Name: 3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶ3D-FRAP顕微鏡法を用いて、心筋細胞における微小RNAのギャップジャンクション依存的転送を可視化・定量化する方法です。高時空間分解能で細胞間シグナル伝達を解析し、心血管研究に応用できます。

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この作業は、ドイツ連邦教育研究省（FKZ 0312138AおよびFKZ 316159）、EU構造基金（ESF / IVWM-B34-0030 / 10およびESF / IVBM-B35-0010 / 12）、DFG（DA1296-1）、およびドイツ心臓財団（F / 01/12）が含まれる。さらに、RDは、ロストック大学医療センター（889001）のFORUNプログラム、DAMP財団、およびBMBF（VIP + 00240）によってサポートされています。

新生児マウスを含むこのプロトコールの全てのステップは、ロストック大学メディカルセンターの動物飼育に関する倫理ガイドラインに従って実施した。 1.細胞培養用調製物および心筋細胞培養用培地の調製<ol><li> PBS中の0.1％ゼラチンで細胞培養プレートをコートし、37℃で4時間または4℃で一晩インキュベートする。ゼラチンを除去し、滅菌層流の下で乾燥させる。 </li><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）を補充した50mLのDMEMからなる細胞培養培地を調製する。 37℃に予熱してください。 </li></ol>新生児心筋細胞の単離<ol><li>新生仔マウス（1〜2日齢）を無菌ハサミで断頭し、胸骨に沿って胸を開ける。鉗子を使用して胸郭を軽く押しながら心臓を取り出し、心臓を氷冷HBSSを含む24ウェルプレートに移す（Ca 2+およびMg 2+なし ）。 </li><li>滅菌鉗子を使用して非心臓組織およびより大きな血管を除去する。洗浄した心臓を氷冷HBSSを入れた1.5mLチューブに移す。酵素消化にはチューブあたり最大5心を使用してください。 </li><li>小さなハサミでハートを0.5〜1mm³未満の小片にします。 </li><li> 1mLのマイクロリットルピペットを用いてHBSSを吸引/添加することにより、細かい心臓をHBSSで2回洗浄する。酵素を添加する前に、HBSSを完全に除去する。 </li><li>新生児の心臓を酵素消化するには、市販のキットを使用し、メーカーのプロトコールに従ってください（ 表の表を参照 ）。 35分間37℃で酵素と共にインキュベートしながら、5分ごとに細かい心臓を含むチューブを振る。 </li><li>非心筋細胞画分の接着を可能にするために、1.5-2時間、細胞培養培地を含む非被覆細胞培養皿上に細胞を懸濁させた。高純度の心筋細胞が必要である。必要に応じて、非心筋細胞画分をさらに培養する。 注：15心の細胞懸濁液については、75cm 2細胞培養フラスコ上でプレプレーティング工程を実施することができる。通常、1つの新生児の心臓から約5×10 5個の細胞が得られる。 </li><li>上清を15mLコニカルチューブに集め、300xgで10分間遠心分離する。 1mLの細胞培養培地に細胞を再懸濁する。 </li><li> Neubauerチャンバー血球計で細胞を数えるか、同等の方法を使用してください。 </li><li> 3×10 5細胞/ cm 2の密度を有する6ウェルプレート上のプレート単離心筋細胞。 37℃および5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 注：任意で、この時点で細胞をトランスフェクトすることもできます。しかし、細胞をエレクトロポレーションに供する前に1日間培養した場合、生存率の増加が観察された。 </li></ol> 3.蛍光標識されたmiRNAによるトランスフェクション<ol><li>事前に、水浴または同等の装置中で37℃まで温かい細胞培養培地（ステップ1.2参照）を添加する。 </li><li> RNaseフリー滅菌水に蛍光miRNAの20μMストック溶液を調製します。 </li><li> 90mM Na 2 HPO 4、90mM NaH 2 PO 4、5mM KCl、10mM MgCl 2および10mMコハク酸ナトリウムを含むエレクトロポレーション緩衝液を調製し、pHを7.2に調整する;エレクトロポレーション緩衝液は-20℃で数ヶ月保存することができます。 </li><li> 0.05％トリプシンを用いて5分間培養皿から細胞を分離する。細胞培養培地を添加してトリプシンを不活性化する。 </li><li> Neubauerチャンバー血球計で細胞を数えるか、同等の方法を使用してください。細胞を300xgで10分間遠心分離する。 </li><li>細胞をエレクトロポレーション緩衝液に再懸濁し、100μLあたり4×10 5細胞の濃度を得る。 </li><li> チューブ内に100μLの細胞懸濁液を蛍光miRNA（最終濃度0.25μM）と混合し、混合物をエレクトロポレーションキュベットに入れる。 <ol><li>細胞の種類に応じて、miRNAの適切な量を実験的に決定する。 </li></ol></li><li> 「G-009」プログラムを用いてエレクトロポレーション装置（ 表の表を参照 ）を用いてエレクトロポレーションを行う。 </li><li>あらかじめ加温した細胞培養液500μLを加え、4ウェルガラス底チャンバースライドのウェルに細胞懸濁液全体（4 x 10 5細胞）を移す。 37℃、5％CO 2雰囲気下で1日培養する。 注：FRAP分析では、~80％の細胞密度が最適です。標識されたmiRNAのトランスフェクションは、エレクトロポレーションを用いて排他的に行われるべきである。標識されたmiRNA分子の均質な分布はFRAP測定に有益であるため、試薬ベースのトランスフェクションは推奨されません。 </li></ol> 4. 3D-FRAP顕微鏡検査の適用（3日目） <ol><li>顕微鏡インキュベーターを温めて37°; Cと熱平衡を確立し、ドリフトの可能性を減少させるためにFRAP測定の少なくとも2時間前に共焦点顕微鏡システムをスイッチオンする。可能であれば、5％CO 2雰囲気を維持する。 </li><li>チャンバーのスライドをステージのサンプルホルダーに挿入します。 </li><li> 1.4 NAの油性対物レンズ（400倍の倍率）と、570-680 nmの検出範囲で、低レーザーパワーで561 nmレーザー励起光を使用して、トランスフェクトされた心筋細胞のクラスターを見つける。 注：FRAP設定、画像取得、および分析の定義は、顕微鏡専用のソフトウェアを使用して行った（ 表の表を参照 ）。 </li><li> &quot;Setup Manager&quot;で &quot;z-Stack&quot;、 &quot;Time Series&quot;、 &quot;Bleaching&quot;、 &quot;Regions&quot;の各ボタンを有効にします。 </li><li> FRAPパラメータを定義します。 <ol><li> 「取得モード」メニューで画像取得設定を定義するには、「フレームサイズ4; 「ラインステップ」を1に、「スキャン時間」を&lt;1秒に設定します。 </li><li> &quot;Channels&quot;メニューで、レーザーパワー、オフセット、ゲインの設定を調整して、最小レーザー励起（ 例 ：レーザーパワー：1〜5％）から最大限の蛍光を得ます。強度の飽和を避けるために調整します。 「ピンホールサイズ」を2μmに設定します。 </li><li>次に、[領域]メニューで[ROI描画ツール]を選択し、カーソルを使用してターゲットセル、参照セル、および背景領域をマークします。必要に応じて、光退色のためのいくつかの標的細胞を選択する。 </li><li> 「漂白」メニュー（ 例えば、反復：9-14、光退色用レーザ出力：100％、画像取得間隔：60秒、周期：15）における光退色設定を調整する。最初の3回のスキャンの後に漂白の開始を定義する。 </li><li> 「z-Stack」メニューでは、セルの厚さに応じて、zスタック取得の限度を定義します。 「番号を調整する」f z層 &quot;を12~15とする。 </li><li> FRAP実験を開始し、蛍光回復を記録する。 注：FRAP実験の設定は、細胞型、蛍光色素、および顕微鏡システムに依存するため、パイロット実験を実施してFRAPの最適パラメータを決定することが最善です。漂白は、初期蛍光強度を少なくとも50％低下させるのに十分でなければならない。典型的には、プラトー相に達するまで蛍光回復を30〜60秒ごとに記録する必要があります。 </li></ol></li></ol> 5.データ解析<ol><li> 得られたz-スタックの最大投影を作成し、漂白標的細胞、参照細胞およびバックグラウンドの蛍光強度値を得る。顕微鏡固有のソフトウェアを使用して、「処理」→「最大輝度投影」→ファイル選択→「適用」をクリックします。 <ol><li>あるいは、同等の画像解析ツール（ <eImageJなど）。 </li></ol></li><li> ターゲット細胞、バックグラウンド、および参照細胞からの蛍光強度データをすべての時点でスプレッドシートにコピーします。 <ol><li>取得プロセス中に生じた光退色を補正するために、標的細胞の強度値から基準細胞のバックグラウンド強度および強度を差し引く。各時点でバックグラウンドセルとリファレンスセルの補正を実行します。 </li><li>各値を初期蛍光で割ることにより、漂白前の初期蛍光強度に補正されたFRAPデータを正規化する。 </li><li> FRAP曲線を得るために、各時点の強度値から減算することによって、漂白直後の蛍光強度にベースラインを設定する。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、利害の対立を宣言していない。

<html> miRNAは、細胞生理学における重要な役割を果たしており、とりわけGJを細胞間の経路11,12,22の経路として使用することで、シグナル伝達分子として働くことが示されています。現在のプロトコールは、細胞クラスター内の蛍光miRNAを用いてこのGJ依存シャトルを特徴付けるインビトロ生細胞撮像技術を提示している。 プロトコールは、細胞モデル系として心筋細胞上に開発された。しかし、このアプローチは、エレクトロポレーションがmiRNAトランスフェクションに適した方法であれば、いくつかの細胞タイプに適用することができます。細胞間の交換に加えて、提示された技術は、miRNA分子の細胞内移動性を調べるのにも適している（ 例えば、細胞内の可能な輸送機構の同定のため） 23,24 。 FRAP顕微鏡法によるmiRNA導入の研究では、蛍光標識されたmiRNA分子が必要です（ 図2 ）。特定の細胞miRNAの標識が可能でないため、導入された外来miRNAのみを3D-...

小さな非コードRNAは、細胞遺伝子調節において重要な役割を担っている。これらの分子は、特定の標的mRNAに結合する20〜25個のヌクレオチドから構成され、翻訳の妨害またはmRNA分解に導く1,2 。 miRNAやsiRNAなどの小規模RNAが担う遺伝子調節プロセスは、多くの異なる種に見られる高度に保存されたメカニズムです3 。特に、miRNA分子は、増殖、分化および再生を含む様々な生理学的過程に極めて重要である4,5。さらに、miRNA発現の調節不全は、多くの病理学的障害に起因する。相応して、miRNAは、診断のためのバイオマーカーとして、および遺伝子治療のための治療剤として適切であることが実証されている6,7。 </sup&gt;。 ギャップジャンクション（GJ）は分子量が最大1kDの分子の拡散交換を可能にする2つの隣接する細胞の原形質膜における特殊なタンパク質構造である。それらは、組織発生、分化、細胞死、および癌または心臓血管疾患などの病理学的障害にとって重要であることが示されている8,9,10。いくつかの分子は、イオン、代謝産物、およびヌクレオチドを含むGJチャネルを横切ることができると記載されている。興味深いことに、GJはまた、小RNA 11,12の細胞間移動のための経路を提供することが見出された。したがって、miRNAは、それらが産生される細胞内だけでなく、レシピエント細胞内でも作用することができる。これは、細胞間シグナル伝達系におけるmiRNAの役割を強調している。同時に、このデータは、ギャップジャンクショナル細胞間連絡はmiRNA機能と密接に関連している。組織恒常性、病理学および診断にmiRNAおよびGJが顕著に及ぼす影響のため、GJの機能およびmiRNAの関連する細胞間動態の包括的な理解は、miRNAに基づく疾患のメカニズムを明らかにし、 miRNA療法。 ギャップ接合カップリングの程度に依存して、細胞間のmiRNA分子の移動は非常に迅速なプロセスであり得る。したがって、これらの調節シグナル伝達分子の迅速な細胞間移動の視覚化および定量化を可能にする方法論が必要である。一般的に、フローサイトメトリーおよび分子生物学的技術が、小RNA 11,12,13,14のシャトルを実証するために適用されている。しかし、FRAPマイクロとは対照的にこれらの手法は、高い時間分解能を欠いており、これはGJを介したmiRNAの交換を分析する際に必須である。さらに、FRAP顕微鏡法は侵襲性が低く、したがって、いくつかの細胞タイプ15,16,17における分子のGJ依存性交換を評価するための強力で新規な生細胞撮像技術を代表する。 ここでは、心筋細胞間のmiRNAシャトルを評価するための3D-FRAPの応用を記述する詳細なプロトコルを提示する。この目的のために、心筋細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。このmiRNAでマークされた細胞を光退色させ、隣接する細胞からのギャップ接合型miRNA再流入を時間依存的に記録した。 FRAP実験の高い時間分解能は、生存細胞間のmiRNAおよびsiRNAの細胞間移動の正確な評価のための動態学的研究を行う可能性を提供する。モレエFRAP顕微鏡法は、GJがそれぞれのシャトルプロセスにどの程度関わっているかを明らかにするのに役立ちます18 。さらに、3D-FRAPは、GJ透過性における生理学的および病理学的変化および小RNA伝達に対するその影響を調べるために使用することができる15,19。

<table><tbody><tr><td>新生児NMRIマウス</td><td>チャールズリバー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G7041</td><td>PBS中の0.1%溶液、滅菌</td></tr><tr><td>PBS</td><td>パン</td><td>バイオテクノロジーP04-53500</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&急性;変性培地</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-03550</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15140122</td><td>100 U/mL, 100&micro;g/mL</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Pan Biotech</td><td>P30-3306</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プラスチック</td><td>TPP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一次心筋細胞単離キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88281</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>88281</td><td>一次心筋細胞単離キットに含まれる</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティフィ</td>ック <td>イ15250061</td><td></td></tr><tr><td>miRIDIAN Dy547標識マイクロRNA模倣</td><td>Dharmacon</td><td>CP-004500-01-05</td>は<td>、RNAseフリー水、ストック溶液20&microに溶解します。M</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>Σ</td><td>S3139</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>カール・ロス</td><td>T877.2</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Serva</td><td>28305.01</td><td></td></tr><tr><td>コハク酸ナトリウム</td><td>カール・ロス</td><td>3195.1</td><td></td></tr><tr><td>0.05% トリプシン/EDTA溶液</td><td>メルク</td><td>L2153</td><td></td></tr><tr><td>4ウェルガラス底チャンバースライド</td><td>IBIDI</td><td>80827</td><td>コートと0.1%ゼラチン溶液</td></tr><tr><td>Amaxa Nucleofector II</td><td>Lonza</td><td></td><td>プログラムG-009をエレクトロポレーションに使用しました&nbsp;</td></tr><tr><td>LSM 780 ELYRA PS.1 システム</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-actinin antibody</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>Connexin43 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9059</td><td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>ヤギ 抗マウス Alexa 594 抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11005</td><td>希釈率 1:300</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ Alexa 488 抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11034</td><td>希釈 1:300</td></tr><tr><td>Connexin43 siRNA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM16708 ID158724</td><td>最終濃度 250 nM</td></tr><tr><td>近赤外生細胞/死細胞染色キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace カルセイン レッドオレンジ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>C34851</td><td></td></tr><tr><td>DAPI核染色</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr></tbody></table>

3d-frap顕微鏡によるmirnaのギャップジャンクション依存的転写の解析

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

miRNAおよびsiRNAのような小さなアンチセンスRNAは、細胞生理学および病理学において重要な役割を果たし、さらにいくつかの疾患の治療において治療薬として使用することができる。 miRNA / siRNA治療のための新しく革新的な戦略の開発は、根底にあるメカニズムの広範な知識に基づいています。最近のデータは、小さなRNAがギャップ結合依存的な様式で細胞間で交換され、それによってレシピエント細胞における遺伝子調節効果を誘導することを示唆している。分子生物学的技術およびフローサイトメトリー分析は、miRNAの細胞間交換を研究するために一般的に用いられる。しかしながら、これらの方法は、ギャップジャンクションの分子束を研究する際に必要とされる、高い時間分解能を提供しない。したがって、細胞内シグナル伝達分子としてのmiRNA / siRNAの影響を調べるためには、細胞レベルでのこれらの小さなRNAの分析を可能にする新規ツールが必要である。現在のプロトコルは、心臓細胞間のmiRNA分子のギャップジャンクション依存的交換を解明するために、光退色（3D-FRAP）顕微鏡法後の三次元蛍光回復の襞付け。重要なことに、この直接的で非侵襲的な生細胞イメージング手法により、蛍光標識された小さなRNAのギャップジャンクショナルシャトルを、時空間分解能の高いリアルタイムで視覚化および定量化することができます。 3D-FRAPによって得られたデータは、細胞間ネットワーク内のシグナリング分子として小さなRNAが作用する、細胞間遺伝子調節の新規な経路を確認する。

ここでは、我々は新生児の心筋細胞内の蛍光miRNAのギャップジャンクショナルシャトルを研究する非侵襲的な技術として3D-FRAP顕微鏡法を提示する。単離された心筋細胞は、典型的な線条α-アクチニンパターンを示し、細胞間境界に沿ってCx43の大きなプラークを含んでいた（ 図1A 、白矢印）。単離した心筋細胞の純度を、α-アクチニン陽性細胞の微量定量によって評価した。一部の非心筋細胞（α-アクチニン陰性細胞）が培養液中に存在したが、新生児の心筋細胞は、単離後に主要細胞型を示した（79.62±3.68％; 図1B ）。 miRNAのギャップジャンクション交換を調べるために、細胞を蛍光標識されたmiRNAでトランスフェクトした。エレctroporationは、高いトランスフェクション効率とトランスフェクションされた化合物の均質な分布を確実に...

ここでは、miRNAのギャップジャンクション依存シャトルを解析するために、光漂白（3D-FRAP）後の3次元蛍光回復の適用について説明します。一般的に適用される方法とは対照的に、3D-FRAPはリアルタイムで高空間/時間分解能で小RNAの細胞間移動の定量化を可能にする。

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

本手順の全般的な目的は、生存している心筋細胞におけるギャップ結合依存的なマイクロRNAの転送を調査することです。この手法は、細胞間信号伝達システムにおけるマイクロRNAの役割を明らかにするのに役立ちます。本技術の主な利点は、マイクロRNAのギャップ結合を介した交換を、高い時空間解像度で生細胞内で可視化および定量化できることです。テキストのプロトコルに従って心筋細胞を単離した後、細胞を6ウェルプレートに3 × 10⁵ cells/cm²の密度で播種します。細胞を37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、0.5 trypsineを細胞に加え、5分間インキュベートして細胞を剥離させます。細胞培養培地を加えてトリプシンを不活化させます。細胞数をカウントした後、300 ×gで10分間遠心分離します。その後、エレクトロポレーションバッファーを用いて、細胞密度が100 µLあたり4 × 10⁵ cellsになるように再懸濁します。次に、100 µLの細胞懸濁液と蛍光標識micro RNAをチューブ内で混合し、その混合液をエレクトロポレーションキュベットに注入します。その後、エレクトロポレーターのG009プログラムを用いてエレクトロポレーションを行います。あらかじめ温めておいた細胞培養液を500 µL加え、細胞懸濁液の全量を4ウェルガラスボトムチャンバースライドのウェルに移します。細胞を37°C、5%二酸化炭素雰囲気下で1日間培養します。顕微鏡インキュベーターを予熱し、共焦点システムを起動した後、チャンバースライドをステージのサンプルホルダーに挿入します。1.4 NAのオイル浸漬対物レンズと561 nmのレーザー励起光を使用し、低レーザー出力および570 nmから680 nmの検出範囲で、導入された心筋細胞のクラスターを確認します。次に、セットアップマネージャーで、z-stack、time series、bleaching、およびregionsのボタンを有効にします。続いて、FRAPのパラメータを定義するため、acquisition modeメニューで、フレームサイズを512 by 512、ラインステップを1、スキャン時間を1秒未満に設定します。channelsメニューでは、強度の飽和を避けるため、最小限のレーザー励起で最大の蛍光が得られるように、レーザー出力、オフセット、およびゲインの設定を調整します。次に、ピンホールサイズを2 µmに設定します。続いて、リージョンメニューからROI描画ツールを選択し、カーソルを使用してターゲット細胞、参照細胞、および背景領域を指定します。必要に応じて、光退色させる複数のターゲット細胞を選択してください。漂白メニューで、フォトブリーチングの設定を調整します。次に、z-stackメニューで、細胞の厚さに応じてz-stack取得の範囲を定義します。z層の数を12から15に調整し、FRAP実験を開始して蛍光回復を記録します。データを分析するために、顕微鏡専用ソフトウェアを使用して取得したz-stackの最大投影図を作成します。「processing」をクリックし、「maximum intensity projection」を選択して、ファイルを選択し、適用します。最後に、ターゲット、バックグラウンド、および参照細胞のすべてのタイムポイントにおける蛍光強度データをスプレッドシートにコピーし、テキストプロトコルに従ってデータ分析を行います。ここに示されているのは、典型的な横紋状のalpha actininパターンと、細胞境界に沿ったconnexin43の大きなプラークを持つ単離心筋細胞です。培養物の中には一部の非心筋細胞が存在していました。ここで示されているように、フローサイトメトリーにより45%のトランスフェクション効率が達成されました。さらに、生存・死細胞アッセイにより、大多数の細胞が高い生存率を示していることが明らかになりました。これはギャップ結合通信を分析する際に重要です。FRAP解析では、細胞クラスター内から標的細胞を選択し、100%のレーザー出力で光漂白を行うことで、選択した細胞内のmicroRNA蛍光を減少させます。取得したデータの定量解析および標準化の結果、平均20%の回復が示されました。本実験において、siRNAによるconnexin43のノックダウンにより、タンパク質発現の減少とギャップ結合を介した細胞間通信の抑制が導かれました。その結果、蛍光回復は50%以上減少しました。これは、microRNA転移の効率が細胞間のギャップ結合による共役度に強く依存していることを示しています。この図は、FRAP実験の3Dサーフェスレンダリングを示しています。最大投影法と比較して、Zスタックの取得を用いることで3D再構成が可能となり、細胞内におけるマイクロRNAの局在と移動性を調査できます。適切に実施し習熟すれば、FRAP測定は2〜3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、隣接する細胞数が同程度であるターゲット細胞を選択することが重要です。さらに、光毒性による影響を避けるため、漂白パラメータと画像取得条件を適切に選択する必要があります。このビデオを視聴することで、細胞クラスター内におけるmicroRNAの移動を定量化および可視化するためのFRAP顕微鏡の使用方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ3D-FRAP顕微鏡法を用いて、心筋細胞における微小RNAのギャップジャンクション依存的転送を可視化・定量化する方法です。高時空間分解能で細胞間シグナル伝達を解析し、心血管研究に応用できます。

3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

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