3D-FRAP顕微鏡によるmiRNAのギャップジャンクション依存的転写の解析

この手順の全体的な目標は、生きた心筋細胞におけるマイクロRNAのギャップ結合依存性伝達を調査することです。この方法は、細胞間シグナルトランザクションシステムにおけるマイクロRNAの役割に対処するのに役立ちます。この手法の主な利点は、マイクロRNAのギャップ結合交換を生命細胞で高い空間時間分解能で可視化および定量化できることです。

テキストプロトコルに従って心筋細胞を単離した後、細胞を6つのウェルプレートに10の3倍の密度で10〜5番目の細胞1平方センチメートルあたりプレートに播種します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、細胞に0.5トリプジンを加え、培養物を5分間インキュベートして細胞を剥離します。

細胞培養培地を添加してトリプジンを不活性化します。細胞をカウントした後、300 gで10分間遠心分離します。次に、エレクトロポレーションバッファーを使用して、100マイクロリットルあたり10から5番目の細胞の4倍で細胞を再懸濁します。

次に、100マイクロリットルの細胞懸濁液を蛍光マイクロRNAとチューブ内で混合し、エレクトロポレーションキュベットにロードします。次に、エレクトロポレーターのG009プログラムを使用してエレクトロポレーションを行います。500マイクロリットルの温めた細胞培養培地を加え、細胞懸濁液の全量を4ウェルガラス底チャンバースライドのウェルに移します。

細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%の雰囲気で1日培養します。顕微鏡インキュベーターを事前に加温し、孔子システムをオンにした後、チャンバースライドをステージサンプルホルダーに挿入します。1.4 naのオイル対物レンズと561ナノメートルのレーザー励起光を低レーザー出力で使用し、検出範囲が570〜680ナノメートルで、トランスベクトされた心筋細胞のクラスターを見つけます。

次に、セットアップマネージャーで、z-stack、time series、bleaching、およびregionsボタンをアクティブにします。次に、frapパラメータを定義するために、取得モードメニューで、フレームサイズを512 x 512に、ラインステップを1に、スキャン時間を1秒未満に設定します。チャンネルメニューで、レーザー出力、オフセット、ゲインの設定を調整して、最小限のレーザー励起から最大の蛍光を得るようにし、強度の飽和を回避します。

次に、ピンホールのサイズを2マイクロメートルに設定します。次に、リージョンメニューで、ロイ描画ツールを選択し、カーソルを使用してターゲットセル、参照セル、および背景領域をマークします。必要に応じて、光退色用のターゲットセルをいくつか選択します。

漂白メニューで、写真の漂白設定を調整します。次に、[z-stack] メニューで、セルの厚さに応じて z-stack 取得の制限を定義します。z層の数を12 tp 15に調整し、frap実験を開始し、蛍光回復を記録します。

データを解析するには、顕微鏡専用ソフトウェアを使用して取得したzスタックの最大投影を作成し、処理をクリックし、最大強度投影を行い、ファイルを選択し、適用します。最後に、ターゲット、バックグラウンド、参照細胞からすべての時点での蛍光強度データをスプレッドシートにコピーし、テキストプロトコルに従ってデータ解析を実行します。ここに示されているのは、典型的な横紋アルファアクチニンパターンとコネキシン43の大きなプラークを持つ単離心筋細胞であり、細胞間境界に沿っています。

いくつかの非心筋細胞が培養物に存在していました。ここで見られるように、フローサイトメトリーにより、45%のトランスベクション効率を達成しました。さらに、生死のエッセイでは、大多数の細胞が高い生存率を示したことが明らかになり、これはギャップ結合コミュニケーションを分析する際に重要です。

FRAP解析では、標的細胞を細胞クラスター内で選択し、100%レーザー出力で光退色することで、選択した細胞のマイクロRNA蛍光を減少させます。取得したデータの定量分析と正規化は、平均20%の回復を示しましたこの実験では、siRNAを介したコネキシン43のノックダウンは、タンパク質発現の低下とギャップ結合コミュニケーションの阻害につながりました。蛍光回収率は50%以上低下し、miro RNAの転写効率が細胞間のギャップ結合に強く依存していることを示しています。

この図は、frap 実験の 3D サーフェス レンダリングを示しています。最大投影と比較して、zスタックの取得は、細胞内のマイクロRNAの局在と移動性を調査するための3D再構成を作成するために使用できます。一度マスターすれば、frap測定は適切に行えば2〜3時間で行うことができます。

この手順を試行するときは、隣接するセルの数が同程度のターゲット セルを選択することが重要です。さらに、私の漂白パラメータと画像取得条件は、光毒性の影響を避けるために選択する必要があります。このビデオを見れば、細胞クラスター内のマイクロRNAの動きを定量化し、可視化するためのfrap顕微鏡の使用方法を十分に理解できるはずです。