Name: HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぼう、UHPLC-MSを用いてHeLa細胞でHDAC1とHDAC6の活性を同時測定する方法。選択的基質と単一インキュベーションで、生細胞におけるヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の選択性を評価できます。

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著者認めるコスト アクション CM1406 (エピジェネティックな化学生物学)。この出版物で報告された研究は、ピエール ・ メルシエ財団によって支えられました。

1. 細胞培養
注: 次の手順は、標準のティッシュ文化フードで実行されます。生殖不能の技術に精通するいるとされます。
<ol>
	<li>10% 牛胎児血清ペニシリン G を添加した MEM でコート t75 フラスコ細胞培養用フラスコの 80% の confluency に HeLa 細胞の培養 (100 U/mL) とストレプトマイシン (100 mg/mL)。 注: セル文化、治療、および換散の手順は 5% CO2無菌条件下での加湿雰囲気で 37 ° C で細胞培養手順を伴う層流の下で行われます。</li>
	<li>DPBS 5 mL で 2 回洗浄、吸引、DPBS 細胞解離試薬 1 mL を加えます。セルをデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>MEM 培地の 9 mL を追加し、徹底的に細胞懸濁液を再懸濁します、診断を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>6 × 104セル/ml MEM に細胞懸濁液の密度を調整します。</li>
	<li>コントロールに細胞懸濁液 100 μ L を追加し、(図 1 a)、滅菌、平底、組織培養治療 96 ウェル プレートの井戸をテストします。</li>
	<li>96 ウェル プレート (図 1 a) の空井戸に MEM 培地の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>24 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい。 注: 24 時間培養は、HeLa 細胞の内因性 HDAC アクティビティをテストする適切な時間です。不明な HDAC 活動と異なるセル型は、制御の細胞の経時的評価を必要があります。</li>
</ol>
2 テスト混合物と HDAC 基板細胞治療
<ol>
	<li>96 ウェル プレートの井戸から培地を吸引します。</li>
	<li>テスト混合物 x 2 を 25 μ l 添加(例えば、トリコスタチン A、MS275、tubastatin、) 井戸をテストする MEM で。コントロールと空白の井戸に MEM の 25 μ L を追加します。 注: テスト混合物の濃度は、少なくとも 5 の最終的な試験濃度 (ウェルあたり 1 つ濃度) の範囲を提供するために調整することです。化合物のテストで DMSO 最終濃度 0.5% を超えないようにする必要があります、空白やコントロールを含む、各ウェルで同じである必要があります。最終的なインキュベーション ボリュームは、ウェルあたり 50 μ L です。トリコスタチン A は 500 から 1.95 に至るまで 5 の濃度テスト nM (1:4 希釈)。6.17 8,000 に至る 5 濃度テストする MS275 と tubastatin A nM (希釈 1:6)。各々 のユーザーが目的の最終的なテスト各試験化合物濃度を決定して用量反応曲線を作成してください。</li>
	<li>コントロールとテスト井戸に基板の混合物 (マル、MOCPAC の 42 μ M と MEM で BATCP の 42 μ M 42 μ M) の 25 μ L を追加します。空井戸に MEM の 25 μ L を追加します。 注: 各基板の最終濃度は 21 μ M. MOCPAC と BATCP がそれぞれ HDAC1 と HDAC6 の活動の区別 (図 1 b)。エピウエハーと活動は認められなかったと、マルの使用可能性別 HDAC アイソ フォームに対する活動の id。</li>
	<li>加湿 5% で 8 h の 37 ° C で 96 ウェル プレートを孵化させなさい CO2インキュベーター。 注: このインキュベーション時間は HeLa 細胞に適しており、合成の基質と対話する内因性 HDAC をことができます。細胞は培養時間および/または基板濃度の調整を必要があります。</li>
</ol>
3. 細胞換散およびクロマト ・ MS/MS のサンプル準備
注意: サンプルの準備の手順は非常に可燃性、摂取または吸入によって有害有機化学物質を使用します。呼吸用保護具、手袋、保護メガネなどを着用してください。
<ol>
	<li>X RIPA バッファーを 6 (10 x RIPA バッファーから希釈) 96 ウェル プレートの各ウェルにプロテアーゼ阻害剤を添加したの 10 μ L を追加します。</li>
	<li>冷たいアセトニ トリルの 160 μ L を各ウェルに追加によって反作用を停止し、上下にピペッティングで混ぜます。 注: この手順の前に-20 ° C で、アセトニ トリルを続けます。</li>
	<li>10 分間-80 ° C のフリーザーにプレートを配置します。</li>
	<li>冷凍庫からプレートを削除し、各ウェルの内容の 220 μ L を生殖不能、円錐底 (V 下) 96 ウェル プレートに転送します。5,000 × g と 10 分のための 4 ° C でプレートを遠心します。 注: この手順は、蛋白質および塩の取り外しを目指しています。必要に応じて、ソリューションを遠心分離前に個々 の円錐形遠心チューブに転送または 0.65 μ m PVDF フィルター プレート 96 ウェルのセットをフィルター処理できます。沈殿物の成功の除去は、クロマト分析の前に必要です。</li>
	<li>UHPLC システムと互換性のある 96 ウェル プレートに上清 (または濾液) の 200 μ L を転送し、プレートのシーラーを使用して剥離、ヒートシールの箔シールします。 メモ: は、培養上清を削除する場合は、ペレットをピペッティングしないでください。クロマト分析を即座に実行できない場合は、分析まで 24 h 最大 4 ° C でプレートに格納できます。</li>
</ol>
4. UHPLC/MS-質量分析
<ol>
	<li>移動相システム (95% A:5 %b) で塗りつぶすことにより UHPLC システムを準備します。 A: H2O、HPLC グレード 0.1% ギ酸を含む (1 L を準備) B: アセトニ トリル、HPLC グレード, 0.1% ギ酸を含む (1 L の準備)。 注意: 移動相には、非常に可燃性、摂取または吸入によって有毒な有機化学物質が含まれています。呼吸用保護具、手袋、保護メガネなどを着用してください。</li>
	<li>96 ウェル プレートは、プレート ホルダーを含むサンプル マネージャーに。表 1にクロマト ・ MS/MS 条件に従ってサンプルを実行します。 注: 分析の 96 ウェル プレートのすべての列も、よく 1 つのコントロールと 1 つの空白も (図 1 aのプレート方式で描かれている) です。コントロールが、ブランクがある MS ソースは一貫性のある背景を提供するかどうかを確認するテスト細胞の酵素活性を 100% の代表。指定された空白で検出された異常な MS ピークスは、MS 感度変更を防ぐために調べる必要があります。</li>
</ol>
5. データの解析
<ol>
	<li>各基板とそのされたきちん製品のピーク面積を適切なの UHPLC 統合ソフトウェアに統合します。 注: は、平滑化手法 (平均、ウィンドウ サイズ 3 と 2 を例えば滑らかの数) と自動統合パラメーターを使用します。表1 クロマトグラフィー条件を使用して、溶出順序は、dMAL (5.8 分)、dBATCP (6.0 分)、dMOCPAC (6.2 分)、マル (7.6 分)、MOCPAC (8.9 分)、BATCP (9.8 分)、図 1に示されています。</li>
	<li>各基板 (されたきちん/アセチル化) (テストおよび制御サンプル) 各クロマト グラムのピーク面積比を計算します。</li>
	<li>各テスト サンプルのパーセント HDAC 阻害を計算します。 
	<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/55878/55878eq1.jpg"> 注: HDAC1 阻害は、dMOCPAC/MOCPAC; のピーク面積比を使用して、計算します。HDAC6 阻害は、dBATCP/BATCP と計算されます。比 dMAL/マルは、一般的な HDAC 阻害を表現する使用できます。</li>
</ol>

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</ol>

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HDAC 阻害は、がん療法21HDAC6 阻害の現在のフォーカスの創薬におけるホットな話題です。HDAC の選択性は通常個々 HDAC アイソ フォーム21に向けて抑制効力を判断する高スループット、携帯無料の試金のシリーズによって評価されます。しかし、阻害の選択性またによって確認されなければならない細胞のヒストンなどの内因性のタンパク質の基質のアセチル化状態を評価する (のクラス I hdacs をした) とチューブリン (HDAC6) のため。したがって、細胞試金の抗体認識 (例えば、免疫染色、西部のしみ、フローサイトメトリー、ELISA) を含む、通常必要なアイソ フォームの定量的または半定量的評価を達成するために生活の特定の化合物の効能細胞21。それは珍しい無細胞酵素アッセイで選択された化合物は細胞や組織の17,22、及び逆<sup class="xref...

Hdacs をしたはクロマチン構造中のヒストンを deacetylate することができる酵素の家族に属しています。また、細胞質で他の蛋白質の基質がある、細胞の様々 な区分であります。18 HDAC アイソ フォームの合計これまで同定されている細胞シグナル伝達し同様に、転写因子や遺伝子発現の調節など、いくつかの細胞メカニズムに関連しているし、1,2,3,4,5,6,7を輸送します。触媒の HDAC 阻害剤はがん治療のための潜在的な治療薬として浮上しています。ほとんど HDAC の抑制剤は、現在 FDA によって承認されて T 細胞リンパ腫、多発性骨髄腫の治療のため、ボリノスタット (サハ)、belinostat、パノビノスタット8,9などの非特異的 HDAC 阻害剤です。しかし、副作用のシリーズはパン阻害薬に関連付けられている、アイソ フォーム特異的小さな分子の検索は、薬効がある化学および薬剤の発見のホットな話題。したがって、クラス私 (HDAC1 3 と見られる HDAC8) の選択的阻害剤ロミデプシンは既に承認された薬10特定の HDAC6 阻害剤は、現在多発性骨髄腫11,12,13,14,15に高められた治療の可能性と、臨床試験中。
スクリーニング アッセイ HDAC を特徴づける阻害剤は酵素ソース (1 つのアイソ フォーム、核エキスまたは細胞ライセート) と HDAC 基板のインキュベーションに基づいています。基材は通常 N-(4-methyl-7-aminocoumarinyl)-Nα-(t-butoxycarbonyl)-Nω-acetyllysineamide (マル)16など分解蛍光体 (例えばクマリン) と結合したアセチル リジン残基を含む小さいペプチッド シーケンスです。アイソ フォーム固有のアクティビティを区別するために各アイソ フォームを含む別の無料のセル アッセイが必要と細胞内本物のアイソ フォームの活動を反映していないこと。アイソ フォーム固有の基板ベンジルなど、市販されている (S)-[1-(4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)-5-propionylaminopentyl]carbamate (MOCPAC、HDAC1 特異的基質) と (S)-[5-acetylamino-1-(2-oxo-4-trifluoromethyl-2H-chromen-7-ylcarbamoyl)pentyl]carbamic 酸 tert-ブチル エステル (BATCP、HDAC6 特異的基質) (図 1 b)。ただし、マルを含む複数基質混合物、MOCPAC、および BATCP 細胞に与えられるを許可しません個々 されたきちん製品の検出蛍光測定による同じ分解蛍光体を抱くことを考える。
ここで説明する方法は、検出と各基板とそのされたきちん製品 UHPLC-ESI ・ MS/MS 分析17続いてマルチ基板アッセイを用いた HeLa 細胞での相対的な定量化のためことができます。HDAC 阻害活性と内因性 hdacs をした試験化合物の特異性の直接同定法を有効に HeLa 細胞に HDAC アッセイを行ったHDAC1 と HDAC6 が同時に評価の焦点があります。単一培養の試金でこれらの酵素の測定を達成するため、96 ウェル プレートにメッキ処理と未処理の HeLa 細胞を非特異的, 特異 HDAC の基板上の混合物を追加します。インキュベーションのステップでは、次のセルは基板と区切られ、UHPLC-質量分析法 (図 1) を使用して検出された彼らのそれぞれの反応製品を解放する服従に分離します。マル、MOCPAC、および BATCP の基板のされたきちんの製品は、それぞれされたきちん MAL (dMAL)、されたきちん MOCPAC (dMOCPAC) とされたきちん BATCP (dBATCP) です。用量反応曲線は、活性化合物を構築できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55878/55878fig1.jpg"> 
図 1: 複数基板の UHPLC MS 解析による HDAC1 固有、HDAC6 阻害剤を識別するために細胞を用いた HDAC 試金のための一般的な方式です。(A) 方式、標準の 96 ウェル プレート治療 (試験化合物を含む) の (無処理) HeLa 細胞と無細胞ブランク。(B) 混合物 (各 21 μ M) として内因性 hdacs をした、されたきちんするのに追加基板の化学構造。(C) (マル、MOCPAC、および BATCP) の追加基板とされたきちん製品のピークを示す典型的なクロマト ・ MS クロマト グラム (dMAL、dMOCPAC と dBACTP、それぞれ)。<a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55878/55878fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>BATCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4061</td><td></td></tr><tr><td>MAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCP0168</td><td>同義語: BOC-Ac-Lys-AMC</td></tr><tr><td>MOCPAC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2195</td><td></td></tr><tr><td>MS275</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EPS002</td><td></td></tr><tr><td>トリコスタチンA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td></td></tr><tr><td>ツバスタチンA</td><td>Σ-Aldrich</td><td>SML0044</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、HPLCグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10660131</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸、LC/MSグレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10596814</td><td></td></tr><tr><td>H2O、</td><td>Milli-Q精製システムによりろ過された</td>HPLCグレードの<td></td><td></td>蒸留H2O</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬 TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, 細胞培養グレード</td><td>Applichem</td><td>146463</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190144</td><td></td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22561021</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>バイオコンセプト</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>10x RIPA バッファー</td><td>Abcam</td><td>ab156034</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast プロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、滅菌済み、平底、組織培養処理済み Corning</td><td>VWR</td><td>29442-058</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、非滅菌、V-bottom</td><td></td><td></td> 遠心<td>分離ステップで使用</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、円錐底、Nunc</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>249944</td><td>Acquity UHPLC システムに対応</td></tr><tr><td>T75 細胞培養フラスコ Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td></td></tr><tr><td>剥離可能なヒートシーリングフォイル</td><td>Waters</td><td>186002789</td><td></td></tr><tr><td>Acquity UPLC システム</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5810 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-413-323</td><td></td></tr><tr><td>統合ソフトウェア: MassLynx V4.1</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>コンビサーモシーラー SP-0669/240</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr><tr><td>Quattro micro API タンデム四重極システム</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td>カタログ番号なし</td></tr></tbody></table>

hdac1 と hdac6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト ms

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

創薬における関心は高くなり新しいヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤の検索では。アイソ フォーム選択性ロミデプシン、クラス成立以来脚光を浴びている私は HDAC 阻害剤癌治療の多発性骨髄腫の特定の HDAC6 阻害剤の臨床的検討。現在のメソッドを使用して、HDAC1 とセルに HDAC6 試験化合物の阻害活性を決定します。アイソ フォームの活動は、超高速液体クロマトグラフィー-質量分析法 (クロマト ・ MS) 解析処理と未処理の HeLa 細胞と培養の特定の基板を使用して測定されます。メソッドには、分離のアイソ フォームで実施無料の細胞生化学的アッセイとは対照的、細胞環境で内因性 HDAC 活動を反映しての利点があります。さらに、それは合成基板の定量化に基づくが、ためメソッドは内生アセチル化タンパク質の抗体認識を必要ありません。それはいくつかの細胞株および自動化されたプロセスに容易に適応です。メソッドはすでに神経 HDAC6 選択的化合物を見つけることに有用な証明されています。典型的な結果をここに示します標準 HDAC 阻害剤トリコスタチン、(非特定の)、MS275 (HDAC1 固有の)、tubastatin (HDAC6 固有) を用いた HeLa 細胞と。

メソッドの HDAC1 の非選択性選択的阻害物質の識別への応用を実証する (クラス I)、HDAC6 (IIb クラス)、HeLa 細胞は知られている標準的な化合物と扱われた: トリコスタチン A (非選択的 HDAC1 と HDAC6)18MS275 (HDAC1 選択的阻害剤)19、および tubastatin (HDAC6 選択的阻害剤)20。本法 (図 1) を使用して、IC50値直接ごとに決定される細胞内 (MOCPAC 脱アセチル化を見て)、HDAC1、HDAC6 (BATCP 脱アセチル化を見ている) (図 2)。トリコスタチン A は、HDAC1 と HDAC6 に向かって強力な非選択的阻害剤だった。その一方で、MS275 だった、HDAC1 の選択的 tubastatin ...

本手法は複数基板の UHPLC MS 解析によるヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) HeLa 細胞でのアイソ フォーム特異阻害剤を識別するために提供しています。これは生活 HDAC1 と HDAC6 の活動を反映するように開発された抗体無料メソッド セル環境、単一アイソ フォーム細胞アッセイとは対照的。

HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

この手法の全体的な目的は、単一の超高性能液体クロマトグラフィー質量分析（UHPLC-MS）アッセイを用いて、化合物のHDAC阻害能を決定し、細胞内におけるHDAC6またはHDAC1に対する選択性を特定することです。本手法は、HDAC阻害剤が生細胞においてクラスI HDACよりもHDAC6に対して選択的であるかを確認するなど、創薬分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、細胞、阻害剤、および選択的基質を一度インキュベートするだけで、2つのHDACアイソフォームに対する効力を同時に決定できることです。この手法は、内因性タンパク質のアセチル化アッセイを回避し、生存細胞内でHDAC6の選択性が維持されているかを確認できるため、選択的HDAC阻害剤の早期創薬への応用が期待されます。本法ではHeLa細胞を用いてHDAC阻害剤の選択性を評価していますが、原代細胞や臨床検体を含む他の腫瘍細胞などの他の細胞株にも適用可能です。10%胎児牛血清、ペニシリンG、およびストレプトマイシンを添加した最小必須培地を用いて、T75細胞培養フラスコ内でHeLa細胞を80%コンフルエンスまで培養します。Dulbecco's Phosphate-Buffered Salineを5 mLを用いて、細胞を2回洗浄します。次に、バッファーを吸引し、細胞解離試薬を1 mL加えます。細胞を剥離させるため、37 °Cで5分間インキュベートします。5分後、細胞にMEM培地を9 mL加え、細胞懸濁液を十分に再懸濁します。細胞を新しい15 mLチューブに移し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。MEM中での細胞懸濁液の密度を 60,000 cells/mL に調整します。次に、滅菌済みの組織培養処理済み平底96ウェルプレートのコントロールウェルおよびテストウェルに、細胞懸濁液を100 µLずつ加えます。その後、96ウェルプレートのブランクウェルにMEM培地を100 µL加えます。この96ウェルプレートを37 °Cで24時間インキュベートします。96ウェルプレートのウェルから培地を吸引します。培地を吸引する際、ウェルから細胞を剥離・除去しないように注意してください。これは、吸引速度を低く設定し、吸引チップをウェル表面の底隅に慎重に配置することで達成できます。次に、Trichostatin A、MS275、および Tubastatin A を含む、MEMで調製した2倍濃度の被験化合物を25 µLずつ試験ウェルに加えます。コントロールウェルおよびブランクウェルには、MEMを25 µLずつ加えます。続いて、コントロールウェルおよび試験ウェルに、基質混合液を25 µLずつ加えます。最後に、ブランクウェルにMEMを25 µLずつ加えます。96ウェルプレートを、加湿された5% 二酸化炭素インキュベーターにて37 °Cで8時間インキュベートします。細胞溶解を行うため、まずプロテアーゼ阻害剤を添加した6倍濃度のRIPAバッファーを10 µLずつ、96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各ウェルに160 µLの冷アセトニトリルを加えて反応を停止させ、ピペッティングによって混合します。プレートを-80°Cのフリーザーで10分間保持します。プレートをフリーザーから取り出し、各ウェルの内容物220µLを非滅菌の円錐底96ウェルプレートに移します。プレートを5,000×g、4°Cで10分間遠心分離します。遠心分離後、上清 200 µL を UHPLC システムに対応した 96 ウェルプレートに移します。次に、プレートシーラーを用いて、剥離可能な熱シールフォイルでプレートを密封します。移動相システムを充填し、超高速液体クロマトグラフィー質量分析計システムを準備します。プレートホルダーを備えたサンプルマネージャーに96ウェルプレートを設置します。本文に記載されているUHPLC ESI MS/MS条件に従ってサンプルを分析します。データ解析を行うには、適切なUHPLCインテグレーションソフトウェアを用いて、各基質およびその脱アセチル化生成物のピーク面積を積分します。各基質について、各クロマトグラムにおける脱アセチル化体とアセチル化体のピーク面積比を算出します。これには試験サンプルとコントロールサンプルの両方を含めてください。最後に、テキストプロトコル内の式に従って、各試験サンプルのHDAC阻害率（%）を算出します。サンプルのUHPLC-MSクロマトグラムをここに示します。細胞に添加した基質に対応するピークは、書面プロトコルの表1に記載されている質量遷移に従って検出されます。MOCPACはHDAC1によって脱アセチル化され、脱アセチル化MOCPACピークを生じます。同様に、BATCPはHDAC6によって脱アセチル化され、脱アセチル化BATCPピークを与えます。最後に、MALは脱アセチル化MALピークを提供し、これはいくつかの内因性HDACの非特異的な脱アセチル化を反映しています。ここに、異なる濃度のHDAC阻害剤Trichostatin Aを用いて得られたクロマトグラムの図を示します。標準的なHDAC阻害剤の用量反応評価が行われました。MOCPACおよびdMOCPACから得られた積分値を用いて、HDAC1に対する標準阻害剤の効力を算出した。IC 50の算出結果、選択的クラスI HDAC阻害剤であるMS275は、既知のHDAC6阻害剤であるTubastatin AよりもHDAC1に対して低いIC 50値を示した。一方、BATCPおよびdBATCPから得られた単離値を用いて、HDAC6に対する標準物質の効力を算出した。今回、Tubastatin AはMS275よりも低いIC 50値を示し、それらのアイソフォーム選択的プロファイルが確認されました。Trichostatin Aは、強力で非選択的な阻害剤です。この手法を習得すれば、細胞処理時間と96ウェルプレートの解析を含め、適切に実施することで72時間で完了させることができます。本手順を実施する際は、ここに記載されているインキュベーション時間はHeLa細胞に対するものであることに留意してください。別の細胞株を使用する場合は、最適化が必要です。本手順に従うことで、特異的な基質が存在する限り、他のアイソフォームの選択的HDAC抑制活性を測定することが可能です。有機溶媒やその他の化学薬品の使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は必ず保護メガネ、手袋、および白衣を着用してください。

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JoVE Journal

Chemistry

化学

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HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

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