HDAC1 と HDAC6 hela 細胞活性の同時測定セルを用いたクロマト MS

この分析法の全体的な目標は、化合物のHDAC阻害能を決定し、単一の超高速液体クロマトグラフィー質量分析アッセイを使用して細胞内のHDAC6またはHDAC1に対する選択性を特定することです。この方法は、HDAC阻害剤が生細胞のクラスI HDACよりもHDAC6に対して選択的であるかどうかを判断するなど、創薬分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、2つのHDACアイソフォームに対する効力を同時に測定するためには、細胞、阻害剤、および選択的基質との1回のインキュベーションステップが必要であることです。

この技術は、内因性タンパク質アセチル化アッセイを回避して、生細胞でHDAC6選択性が維持されているかどうかを検出するため、選択的HDAC阻害剤の早期創薬にまで及びます。この方法は、HeLa細胞におけるHDAC阻害剤の選択性を評価するものですが、初代細胞や臨床検体を含む他の腫瘍細胞などの他の細胞株にも適用できます。10%ウシ胎児血清、ペニシリンG、およびストレプトマイシンを添加した最小限の必須培地で、T75細胞培養フラスコでHeLa細胞を80%の密度で培養します。

5ミリリットルのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で細胞を2回洗浄します。次に、バッファーを吸引し、1ミリリットルの細胞解離試薬を添加します。摂氏37度で5分間インキュベートして細胞を剥離します。

5分後、9ミリリットルのMEM培地を細胞に加え、細胞懸濁液を完全に再懸濁します。細胞を新しい15ミリリットルチューブに移し、血球計算盤を使用して細胞をカウントします。細胞懸濁液の密度をMEMでミリリットルあたり60, 000細胞に調整します。

次に、無菌の平底、組織培養処理済み96ウェルプレートのコントロールウェルおよびテストウェルに100マイクロリットルの細胞懸濁液を添加する。次に、100マイクロリットルのMEM培地を96ウェルプレートのブランクウェルに加えます。96ウェルプレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。

96ウェルプレートのウェルの培地を吸引します。培地を吸引している間は、ウェルから細胞を分離したり除去したりしないでください。これは、低い吸引率を使用し、吸引チップをウェル表面の下部隅に慎重に配置することで実現できます。

次に、トリコスタチンA、MS275、およびツバスタチンAを含む、MEM中の25マイクロリットルの25マイクロリットルをテストウェルに加えます。次に、25マイクロリットルの基質混合物をコントロールウェルとテストウェルに加えます。次に、ブランクウェルに25マイクロリットルのMEMを追加します。

96ウェルプレートを摂氏37度で、加湿した5%二酸化炭素インキュベーターで8時間インキュベートします。細胞溶解を行うには、まず、プロテアーゼ阻害剤を添加した6回RIPAバッファーを10マイクロリットルを96ウェルプレートの各ウェルに加えます。各ウェルに160マイクロリットルの冷たいアセトニトリルを加えて反応を停止し、ピペッティングで上下させて混合します。

プレートをマイナス80°Cの冷凍庫に10分間置きます。プレートを冷凍庫から取り出し、各ウェルの内容物220マイクロリットルを非滅菌の円錐形の底部96ウェルプレートに移します。プレートを5, 000倍g、摂氏4度で10分間遠心分離します。

遠心分離後、200マイクロリットルの上清をUHPLCシステムに適合した96ウェルプレートに移します。次に、プレートシーラーを使用して、剥離可能なヒートシールホイルでプレートをシールします。超高速液体クロマトグラフィー質量分析システムを移動相システムで充填して調製します。

96ウェルプレートをプレートホルダー付きのサンプルマネージャーに入れます。テキストに記載されているUHPLC ESI MS/MSの条件に従ってサンプルを分析します。データ解析を行うには、各基質とその脱アセチル化製品のピーク面積を適切なUHPLC統合ソフトウェアで波形解析します。

各基質について、各クロマトグラムにおける脱アセチル化とアセチル化のピーク面積比を計算します。テストサンプルとコントロールサンプルを含めます。最後に、テキストプロトコルの式に従って、各テストサンプルのHDAC阻害率を計算します。

ここでは、サンプルのUHPLC-MSクロマトグラムを示します。細胞に添加された基質に対応するピークは、書かれたプロトコールの表1に記載されているように、それらの質量遷移に従って検出されます。MOCPACはHDAC1によって脱アセチル化され、脱アセチル化されたMOCPACピークが得られます。

同様に、BATCPはHDAC6によって脱アセチル化され、脱アセチル化されたBATCPピークが得られます。最後に、MALは、いくつかの内因性HDACの非特異的な脱アセチル化を反映する脱アセチル化されたMALピークを提供します。ここに示したのは、標準的なHDAC阻害剤の異なる濃度のHDAC阻害剤トリコスタチンA.Aの用量反応評価で得られたクロマトグラムを用いた図です。

MOCPAC と dMOCPAC から得られた積分値を使用して、HDAC1 に対する標準阻害剤の効力を計算しました。IC 50の計算後、選択的クラスI HDAC阻害剤であるMS275は、既知のHDAC6阻害剤であるTubastatin AよりもHDAC1のIC 50値が低いことを示しました。一方、BATCPおよびdBATCPから分離された値を使用して、HDAC6に対する標準の効力を計算しました。

今回、ツバスタチンAはMS275よりも低いIC50値を提供し、そのアイソフォーム選択性プロファイルを確認しました。トリコスタチンAは、強力な非選択的阻害剤です。この手法を習得すると、細胞処理時間や96ウェルプレートの分析を含めて適切に実行すれば、72時間で実行できます。

この手順を試行する際、ここで示したインキュベーション時間はHeLa細胞のものであることを覚えておくことが重要です。別の細胞株を使用する場合は、これを最適化する必要があります。この手順に続いて、特定の基質が存在する限り、他のアイソフォームの選択的HDAC阻害活性を測定できます。

有機溶剤やその他の化学物質の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、保護メガネ、手袋、および白衣を常に着用する必要があることを忘れないでください。