Name: HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学ぶ非架橋性ホルマリン不使用固定法によるFISH解析プロトコル。乳がん組織で形態と分子品質を保持し、個別化医療のための複合診断を同一検体から実現する革新的な組織処理技術を探索する。

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我々 は、彼らの専門知識の医科大学グラーツの病理学研究所の分子病理学研究室のチームに感謝し、サポートします。さらに、アイリス Kufferath と感謝ダニエラ パブスト テクニカル サポート、ベルナデット リーガーと HER2 のケースを処理するためのシルビア Eidenhammer キン Szurian (病理学者)、タマス Regényi (3DHISTEC)。原稿の校正、ペネロペ Kungl に感謝しますこの作業は、研究・技術・開発のキリスト教のドップラー研究基金、オーストリア連邦省、研究と経済と建国によって財政的にサポートされています。

グラーツ医科大学 (参照番号 20-066)、倫理委員会で承認された研究オーストリア。組織サンプルは、患者が書面によるインフォームド コンセントを与えた後切除主な浸潤性の乳癌の 2 例から得られました。
1. ティッシュの固定
注: 組織の固定は実行標準緩衝ホルマリン ソリューション (リン酸カルシウム) のいずれかを 10% ホルマリン溶液 ph 6.8 ph 7.2 CEN/TS によるとバッファー 3.7% (4% の体積に対応する) ホルムアルデヒドの質量割合として定義されています。16827-1:2015 または (以下固定の代替ソリューションとも呼ばれる) 非相互リンク、無料のホルマリン組織固定システム定着剤と室温 (RT) で手ふれ補正ソリューションから成る。
<ol>
	<li>十分な組織量を確保するため各 4 mm の 2 つの半分に胸滅菌メスでがん組織サンプルをカットします。NCFPE やリン酸カルシウムの組織固定用 4 × 15 × 15 mm の最大サイズを使用します。</li>
	<li>標準組織カセット内腫瘍標本の各半分を置き、リン酸カルシウムまたは 4 つの部分の定着剤および一部組織 (4 mL/1 g 組織 (理想的には 10 mL/1 g)) の体積比 (v/v) あたりのボリュームで 24 時間の代替の固定の解決で水没します。</li>
	<li>コンテナーを開いて、180 ° によって組織カセットを回して、それを沈める 2 72 h のスタビライザー ソリューションにまた固定サンプルを転送します。</li>
	<li>残留リン酸カルシウムを削除する RT で 30 分間 250 mL 70% エタノールにリン酸カルシウム固定サンプル組織カセットを配置します。 注: この手順は、生体分子の保全のため非クロス リンク定着剤の有益な特性を破壊するだろう自動化されたティッシュ プロセッサでの定着剤処理サンプルの非十字リンクのリン酸カルシウムの汚染を防止することが重要です。 注意: リン酸カルシウム危険なソリューションは、皮膚刺激性、眼に対する重篤な損傷を引き起こす、アレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があります、遺伝的欠陥の原因の疑いがある、がん、呼吸器の炎症、臓器に眠気と原因の損傷を引き起こす可能性があります。代替の定着剤は吸入、皮膚に接触すると有毒飲み込んだ場合、飲み込んだ場合、目や皮膚、吸入、皮膚との接触を介して非常に深刻な不可逆効果の危険性への刺激と。どちらのソリューションでも固定の吸入と物理的な接触を避けてください。適切な防護服、手袋、眼と顔の保護を着用します。発煙のフードで働いてください。</li>
	<li>ティッシュの処理の埋め込み、およびティッシュの区分 (セクション 2 および 3) に進みます。</li>
</ol>
2. ティッシュの処理と埋め込み
<ol>
	<li>70% (2 × 15 分)、80% (30 分)、90% (60 分)、99% (2 x 60 分) エタノール、キシレン (2 x 60 分) の順で固定ティッシュ サンプル組織カセットの段階的な脱水を実行します。自動組織プロセッサ (4 × 45 分) のパラフィン浸透します。</li>
	<li>鉗子を使用して、配置、脱水とパラフィン浸透のサンプル (または、リン酸カルシウム固定) 金型で。</li>
	<li>サンプルを埋め込む 5-10 mL 溶融パラフィン (凝固点 56-58 ° C) パラフィン包埋を使用して計測器します。</li>
	<li>-5 ° c で 30 分間冷却プレート金型を配置します。</li>
	<li>金型からパラフィン埋め込まれたティッシュのブロックを回復します。</li>
	<li>結果ブロックを保存 (または固定パラフィン (NCFPE)、リン酸カルシウム固定パラフィン (FFPE)) 使用するまで 4 ° C で暗闇の中。</li>
</ol>
3. 組織区分およびスライド準備魚
注: 魚の手順の前に 24 時間の NCFPE セクションのスライドを後リン酸カルシウムで固定されています。 FFPE セクションは、魚の使用直接。
<ol>
	<li>ミクロトームに使い捨てブレードを挿入し、10 μ m にミクロトームを調整します。</li>
	<li>冷却板から最初のブロックを取るし、測定器に挿入します。</li>
	<li>均一な表面が得られるまでブロックをトリムします。ブラシを使用してミクロトームをきれいにし 2-3 の最初のセクションの破棄は、3 μ m にそれを調整します。</li>
	<li>NCFPE と FFPE のブロックの 3 μ m のセクションをカットし、冷水浴 (純水) に配置します。 注: 重複する核なしより良い写真を得るためには、ここでは、manufacturer´s 命令で推奨されている 3-5 μ m ではなく 2 μ m セクションの画像が表示されます。</li>
	<li>フローティング各部細かいペイント ブラシと組織切片接着コーティング顕微鏡スライド上に針を拾います。</li>
	<li>このスライドに突入 (40 ° C) 暖かい水のお風呂、完全にストレッチ セクション。</li>
	<li>水のスライドを慎重に引いて、スライドにセクションを置くし、しわを避けるため。</li>
	<li>すべてのセクションが 1 時間常温で乾燥させてください。</li>
	<li>パラフィンを溶かすインキュベーターで 30 分間 70 ° C でスライドを加熱します。</li>
	<li>ガラスの瓶を染色で水平方向にスライドを置きます。</li>
	<li>Rehydrate 250 ml 以下の液体の満たされた染色瓶に RT で段階的なセクション: 100% キシレン 2 x 15 分、96% エタノール 2 x 15 分、90% エタノール 80% エタノール 70% エタノール、50% エタノールの 2 分 2 分 2 分 2 分、し、蒸留した水を 2 x 10 分。 注意: ヒューム フードの退避と deparaffinization の手順を実行します、発生の有毒な溶剤を吸入しません。 注: セクション、組織によって必要があります異なるインキュベーション時間を事前にテストします。</li>
</ol>
4. ポスト固定 NCFPE 標本の
<ol>
	<li>24 h 後固定段階右場所ヒューム フードの瓶で 24 h のリン酸カルシウムで満ちている新しい染色瓶にそれらを置くことによって NCFPE スライドのポスト固定を実行します。</li>
	<li>リン酸洗浄することにより削除過剰なリン酸カルシウムは緩衝生理食塩水 (3 x 10 分) と蒸留水 (2 x 10 分)。</li>
</ol>
5. 蛍光現場の交配 (魚)
注: ここで魚が市販の HER2/CEN17 デュアル カラー プローブ キットを使用して、製造元の指示に従って実行されます。組織切片をハイブリダイゼーションと洗浄の手順中に乾燥するようにしてください。DNA プローブと 4'、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) DNA 対比染色ソリューション光に長時間さらされることはできません。暗闇の中でこれらの手順を実行します遮光容器を使用しています。年齢、サンプル素材の固定ステップによって変性を増減し、良い交配の結果を得るための温度を洗います。
<ol>
	<li>場所染色瓶 250 mL 熱前処理ソリューション 98 ° C の水浴中にクエン酸にはが含まれています。</li>
	<li>補給 FFPE を配置して 15 分間インキュベート後固定 NCFPE jar ファイルにスライドします。</li></ol>Jar を染色あたり六つ以上のスライドを使用しないでください。
	<li>新しい染色瓶に RT で 3 分間蒸留水でスライドを洗います。</li>
	<li>37 ° C で温度制御の交配システムにスライドを配置、タンパク質分解の<ol>
		<li>すぐに、適用、-使えるにペプシン溶液 (2 mg/ml) 滴下 (~ ドロップあたり 30 μ l) ティッシュ セクションそれが完全に覆われるまでに。ハイブリダイゼーション システムで 37 ° C で 9 分間インキュベートします。 注: インキュベーション時間 5-15 分をお勧めします。タンパク質分解に最適な時間を事前に望まれます。</li>
		<li>スライドを洗浄バッファー SSC を含む jar ファイルに置き、5 分間インキュベートします。</li>
		<li>室温 1 分の蒸留水でスライドをすすいでください。</li>
		<li>次の傾斜アルコール中でのセクションの脱水を実行: 50%、70%、90%、100 %1 分空気の乾燥のセクション。</li>
		<li>ピペット 10 μ L 乾燥切片に HER2/CEN17 プローブの交配のため、coverslip で各サンプルをカバーし、ラバー セメントでそれを封印します。 注: 22 × 22 mm 組織領域ごとには、プローブの 10 μ L の使用をお勧めします。プローブの穏やかな温暖化とピペッティングのプロセスが容易になります。泡と光へのプローブの長い露出を避けてください。</li>
		<li>共同 75 ° C、10 分間で交配システムのプローブと試料 DNA を変化させなさい。</li>
		<li>ハイブリダイゼーション システムを 37 ° C に設定し、一晩交配させます。</li>
		<li>ポスト交配・検出用鉗子でゴム セメントを慎重に取り外します。</li>
		<li>染色瓶含む 37 ° C で加温 1 x 洗浄バッファー A 5 分削除のスライド、coverslips を孵化させなさい。</li>
		<li>スライドを使用して加温 1 x 洗浄バッファー A 37 ° C で 5 分間 2 回洗浄</li>
		<li>70%、90%、100% エタノール、1 分のスライドを脱水します。</li>
		<li>空気のサンプルを乾燥し、光から保護します。</li>
		<li>染色の適用 30 μ L の泡を回避する交配させられた領域に DAPI ソリューション。観察のセクションをカバーしてください。</li>
		<li>光から保護されて 15 分間インキュベートします。</li>
		<li>フィルター ペーパーの間にスライドをそっと押して過剰の DAPI 溶液を慎重に取り外します。</li>
		<li>共焦点顕微鏡による評価までに最大 2 週間は暗闇の中での 2-8 ° C でスライドを保存します。</li>
	</ol>
	</li>

6. 共焦点イメージングと魚スライドのスキャン
<ol>
	<li>共焦点イメージングおよび共焦点デジタル スキャナー 40 x 搭載でスライドのスキャンを実行/1.2 NA 目的、クワッド バンド フィルター (DAPI、FITC、TRITC、Cy5)、5.5Mpx、16 ビット冷却科学相補的金属酸化物半導体 (CMOS) カメラ。</li>
	<li>グリーンのフィルターで画像を取得 (励起: 503 nm、発光: 528 nm) とオレンジ (励起: 547 nm、発光: 572 nm) チャンネル。</li>
</ol>
7. 解釈
注: HER2/CEN17 プローブは赤色螢光色素標識 CEN17 特定のプローブ染色体 17 のアルファ衛星セントロメア領域 (D17Z1) とグリーン螢光色素標識 HER2 特定のプローブ HER2 遺伝子 (プローブの場所 17q12) の混合物。核当り HER2:CEN17 比なの腫瘍の標本は、HER2:CEN17 比 ≥2.0 とのそれらを増幅17として獲得しているに対し、通常通り採点されています。
<ol>
	<li>オープン ソースの CaseViewer 2.120と画像の品質解析を実行します。<ol>
		<li>侵襲癌病理学者によって定義されたコンポーネントの 2 つの異なる地域にある少なくとも 20 セルを評価します。カウント領域で明確に区別も分散核があります。組織収縮または絞り地と境界領域をカウントから除外します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. RNA の品質
<ol>
	<li>RNA の抽出<ol>
		<li>すべての機器とツールが RNAse フリーであることを確認します。RNAse 除去のソリューションを使用します。</li>
		<li>3.8 のステップまでプロトコルに従うミクロトームを使用して NCFPE または FFPE サンプルの 10 に 20 セクション (厚み 5 μ m) をカットします。</li>
		<li>NCFPE から RNA を抽出 RNA の隔離を使用してサンプル キット (材料の表を参照してください)。FFPE RNA 抽出用キットを用いた FFPE サンプルから RNA を抽出します。 注: 非クロス リンク定着剤からの RNA の抽出には、固定法に適応した分離メソッドが必要です。その他 RNA 分離の方法 (例えば Trizol、RNeasy FFPE、NCFPE 試験片など) を使用しないでください。</li>
		<li>RNA 濃度と純度分光光度計を使用して決定します。260 で吸光度の比 nm と 280 nm (A260/280) をする必要があります 〜 2.0。</li>
		<li>さらに分析まで-70 ° C で隔離された RNA を保存します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>実行グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) リアルタイム逆転写 PCR プライマーを使用して異なる長さ8,9の産物を生成します。<ol>
		<li>CDNA 合成用 manufacturer´s 指示に従って cDNA 逆のトランスクリプション キットを使用します。各サンプルの 500 の ng RNA を使用します。さらに使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。</li>
		<li>Manufacturer´s の指示に従って PCR マスター ミックスを準備します。</li>
		<li>384 ウェル反応板トリプリケートで PCR マスター ミックスをピペットします。追加 4 μ L 1:16 の希釈 cDNA (PCR テンプレート)。Manufacturer´s の指示に従って PCR を実行します。 注: 人間の GAPDH の次のプライマーを用いて: GAPDH 前方: 5´-CCACATCGCTCAGACACCAT-3´;GAPDH 逆: 71 bp 5´-ACCAGGCGCCCAATACG-3´、153 bp 5´-GTAAACCATGTAGTTGAGGTC-3´、200 bp 5´-TTGACGGTGCCATGGAATTT-3´, 277 bp 5´-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3´、323 bp 5´-AAGACGCCAGTGGACTCCA-3´、530 bp 5´-ACGATACCAAAGTTGTCATG-3´。</li>
		<li>PCR マシンに該当するソフトウェアを使用して結果を分析します。無指定の製品は、融解曲線分析21に基づいて除外する必要があります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

-直流 Qiagen で採用されている、オプションや債券の保有株は、会社の年金制度。本稿で示したデータは Qiagen と PreAnalytiX によって共同で開発されている PAXgene の組織システムを参照してください。Qiagen は、ラットの研究と Biobanking テクノロジの公的資金によるキリスト教ドップラー研究所の産業パートナーです。すべての著者の利害とも競合する金銭的な利益があります。

結果は、2 つ主要な調査結果を示します。最初に、セクション NCFPE 組織からカットのシンプルな 24 h リン酸カルシウム ポスト固定ステップです (また見なさい参照14) FFPE 組織の承認された魚の試金を使用して魚分析 FFPE と同等の結果を得るのに十分です。このプロトコルには、もともと開発し、包括的な再認証を必要とせず FFPE 承認 (例えば、組織の非架橋前の交配の条件を最適化する) によって魚の試金を使用しての利点があります。魚のプロトコルは、製造元のマニュアルの説明どおりに使用できます。
メーカーの推奨は明示的に以前の適応からこのプロトコル (例えばティッシュ セクション直径と潜伏期間 deparaffinization ステップで) 結果の manufacturer´s 指示からマイナーな修正異なる組織の種類と固定方法の使用。
ポスト固定ステップは、18-24 時間を 1 日で分析時間が長く、FFPE 組織 (図 1) の開発により、同じ日々 のワークフローの化学反応時間が必要なため重要です。リン酸カルシウムは時間22組織型23,24に応じて 2 h で 5 mm あたり 1 mm の平均レートで組織に浸透されています。18 時間以上の長時間ポスト固定期間のみが NCFPE のプロパティを FFPE のセクションに変更する観察は定着剤が化学反応時間のない浸透1 の目的の結果を達成するため重要であることを示します ,14。
第二に、生体がよく保存されて、ポスト固定のため使用されていない残りの NCFPE 組織をさらに分子分析のため使用できます。リアルタイム逆転写 PCR (図 3) によってこれを示した。アッセイはより敏感なパラフィン包埋組織8から分離された mRNA の (すなわち、化学修飾と断片化) RNA の品質に関して簡便派生鈴値 (RNA 整合性数) よりも具体的です。品質管理はリアルタイム PCR に本研究では制限された独立したグループは、rna や DNA と NCFPE から分離したタンパク質の品質は FFPE 組織8,9,からより示されているので13。
該当する場合、次を提示プロトコル (例えば、リン酸カルシウムのレシピ、固定条件、RNA 品質管理、検証)、事前分析手順の体外診断 (IVD)、CEN の技術仕様の要件最近発売された標準化ヨーロッパ委員会 (CEN) によって (例えば CEN/TS 16827-ISO 15189 標準を示す FFPE 組織からの RNA の隔離のための 1:2015)。
メソッドは、この特定の固定に限定されます。いくつかの研究では、生体分子と非相互リンク、無料のホルマリン固定液を用いて形態のよい保存を提示されているが研究ではなく日常の医療アプリケーションで主に使用されます。理由の 1 つ金本位リン酸カルシウムを置き換える別定着剤による固定は必要です検証研究のさまざまな非十字リンクの定着剤で固定用 FFPE 材料の最適化されたすべてのプロトコルを使用できるように。他の組織の固定方法は、この魚のプロトコルのテストしませんでした。
本稿で説明した簡単なポスト固定ステップ FFPE と NCFPE 組織の両方承認 IVD 試金を使用しての利点があります。

個別化医療は、ますますマルチパラ メーター試験形態と分子組織分析に依存します。ゴールド スタンダードとして組織のホルマリン固定は、優れた形態品質1,2を提供します。ただし、ホルマリン誘発の化学修飾とタンパク質と核酸3,4、5の否定的架橋分子解析6と干渉します。これらの分子変更核酸とタンパク質の質の制限し、遺伝子シーケンス工芸品7またはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の感受性低下があります-ベースの試金8。FFPE 組織分子テストを最適化するために撮影された主要な努力が、組織の低温保存は一般より優れているホルマリン固定組織別の保存プロシージャのサンプルを分割する必要があるのです。分子解析で、非十字リンク、低温保存の必要性を避けるために無料のホルマリン固定、PAXgene 組織開発されました。この市販のシステムは、固定と異なるアルコール、酢酸可溶性有機化合物を含む安定化ソリューションで構成されます。核酸、タンパク質 (phospo)、形態の適正な保全は、いくつかの研究6,9,10、11,12,13に示されました。
がん診断の 1 つの特定のアプリケーションは、増幅14超顕微鏡的削除転座などの染色体変異の包括的な範囲を検出する魚です。たとえば、浸潤性乳癌の腫瘍の 20% 示すひと上皮成長因子受容体 2 (HER2) の増幅遺伝子15,16,17,18, 予後不良に関連付けられています。 ,19。魚による乳癌の HER2 過剰発現と増幅状態の定量指向抗 HER2 療法のために患者を選択するために必要なコンパニオン診断の連邦医薬品協会 (FDA) (http://www.fda.gov/ に記載されています。MedicalDevices/ProductsandMedicalProcedures/InVitroDiagnostics/ucm301431.htm)17。医療における魚基づいてコンパニオン診断の広範なアプリケーションを可能にするための試金は開発され FFPE 組織の承認します。
以前の研究では NCFPE 組織を FFPE 組織の承認された魚アッセイに使用できないことを示した。しかし、ことを示した 4% ホルムアルデヒドと NCFPE 組織の別のポスト固定手順のシリーズ ポスト固定時間 18 時間以上 NCFPE ティッシュ セクションの時間のテストは FFPE 組織14とのそれらに同等の結果を達成しました。
本研究では、詳細なプロトコルを提供し、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定・ 24 h 4% の影響を与えるバッファー使用される同じプライマリ組織標本から HER2 魚および RNA の品質のセクションにホルムアルデヒド ポスト固定を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig1.jpg"> 
図 1: 蛍光性上皮内交配 (魚) とホルマリン固定パラフィン埋め込まれた (FFPE) と非クロス リンクの RNA 解析の手順を示す図、無料のホルマリン固定パラフィン埋め込まれた組織 (NCFPE) です。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>SAV LP GmbH, Flintsbach a. I., Germany</td><td>www.sav-lp.de</td><td>FN-200L-4-1</td><td>Tissue fixative</td></tr><tr><td>Simport Plastic Ltd., Beloeil, Canada</td><td>www.simport.com</td><td>M-498</td><td>組織サンプルのラベリング、固定、パラフィン包埋を提供する保管装置。</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td>www.qiagen.com</td><td>765112</td><td>組織サンプルの収集、固定、安定化用:PAXgene Tissue FIXおよびPAXgene Tissue STABILIZERを含む10個のプレフィルド試薬容器。</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>813150</td><td>化学固定からパラフィン浸潤までの生体試料の処理</td></tr><tr><td>Merck Millipore, Munich, Germany</td><td>www.analytics-shop.com/de/hersteller/millipore.html</td><td></td><td>MC1009834000 組織サンプルの脱水</td></tr><tr><td>VWR Chemicals, Darmstadt, Germany</td><td></td><td>https://at.vwr.com 10293EP</td><td>組織サンプルの脱水</td></tr><tr><td>ACM Herba Chemosan Apotheker AG, Vienna, Austria</td><td>www.herba-chemosan.at</td><td>2549662 32</td><td>Paraffin used in a tissue processing device</td></tr><tr><td>Leica Mikrosysteme Handels GmbH, Vienna, Austria</td><td>www.LeicaBiosystems.com</td><td>39602004</td><td>Paraffin embedding medium</td></tr><tr><td>Sanova Diagnostik, Vienna, Austria</td><td>www.sanova.at</td><td>5229</td><td>組織学</td></tr><tr><td>用組織用パラフィン包埋装置Histocom Medizintechnik Vertriebs GmbH, Wiener Neudorf, Austria</td><td>www.histocom.info</td><td>M 910010</td><td>このデバイスは、生物学および医学における特に洗練されたパラフィン切片作成技術に使用されます。熟練した人員または特別な訓練を受けた人員のみがミクロトームを操作し、つまり、標本のクランプ、トリミング、切片の取り出し、および装置からの切片の取り外しを行う必要があります。</td></tr><tr><td>Dako Denmark A/S, Glostrup, Denmark</td><td>www.chem.agilent.com</td><td>K802021-2</td><td>コーティングされたスライドガラスで、ホルマリン固定、パラフィン包埋組織切片の取り付けを目的としています。</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td>www.qiagen.com</td><td>73504</td><td>ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片からの全RNAの精製用</td></tr><tr><td>Qiagen GmbH, Hilden Germany</td><td></td><td>www.qiagen.com 765134</td><td>PAXgene固定パラフィン包埋組織切片からの全RNAの精製</td></tr><tr><td>ZytoVision GmbH, Bremerhaven, Germany</td><td>www.zytovision.com</td><td>Z-2015-200</td><td>ERBB2(別名HER2)遺伝子増幅の検出には、乳がんサンプルなどの固形悪性新生物で頻繁に観察されます。</td></tr><tr><td>3DHISTEC、ブダペスト、ハンガリー</td><td>www.3dhistech.com</td><td></td><td>40x/1.2 NA対物レンズ、クワッドバンドフィルター(DAPI / FITC / TRITC / Cy5)フィルター、5.5Mpx、16ビット、冷却科学CMOS(相補型金属酸化物半導体)カメラを搭載した組織スライドをスキャンするためのデジタルデバイス。</td></tr><tr><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4368814</td><td>大容量cDNA逆転写キットには、最大2 μの定量的変換に必要なすべての成分が含まれています。g 1 つの 20 &micro の 1 本鎖 cDNA への全 RNA の g;L反応。</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4367659</td><td>PCRマスターミックスには、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、およびAMPLICONのPCRおよび定量化用のSYBR Greenが含まれています。</td></tr><tr><td>ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE</td><td>www.thermofisher.com</td><td>Ser. Nr. F239</td><td>核酸定量用分光光度計。</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex リアルタイム PCR システム</td><td>www.thermofisher.com</td><td>4485701</td><td>PCR マシン、</td></tr><tr><td>Vysis/Abbott Laboratories.Abbott Park, Illinois, U.S.A</td><td>www.molecular.abbott/us/en/products/instrumentation/thermobrite#order</td><td>e.g. (ThermoBrite) 07J91-020</td><td>in-situ変性/ハイブリダイゼーション手順のための温度制御スライド処理システム。</td></tr></tbody></table>

her2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

Protocol for HER2 FISH Using a Non-cross-linking, Formalin-free Tissue Fixative to Combine Advantages of Cryo-preservation and Formalin Fixation

ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) 組織サンプルの形態学的評価は、その優れた保存形態のため数十年のがん診断のゴールド スタンダードをされています。個別化医療はますます複合形態と分子解析技術と診断により特徴づけられる個々 の病気の個別に適応し、ターゲットを絞った治療を提供します。同じ FFPE 標本からの形態学的及び分子アッセイのパフォーマンスに化学修飾によるホルマリンの否定的な影響のために挑戦し、核酸やタンパク質の架橋します。非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液 FFPE のような形態と低温保存のような生体を維持するために、すなわちの両方の要件を満たすために最近開発しました。魚は、病理組織学的および分子診断との組み合わせでよく必要があるのでこの新しい定着剤と扱われる組織での魚のプロトコルの有効性をテストしました。我々 が見つかりましたそのホルマリンのポスト固定非十字リンク、無料のホルマリンの標本とパラフィン (NCFPE) 乳房癌組織生成相当結果 FFPE 組織とのそれらにひと上皮成長因子受容体 2 (HER2)魚の分析。このプロトコルは、もともと開発および FFPE 組織の検証魚アッセイを組織切片の単純なポスト固定ステップによって NCFPE 組織の使用方法について説明します。

魚 HER2 測定:
FFPE と NCFPE から HER2 魚の信号強度は、類似した (図 2)。どちらの場合もほとんどの細胞では、赤の信号 (CEN17 参照の遺伝子) と比較すると緑色の信号 (HER2 遺伝子の増幅の位置を示す) の明確な過剰を表示します。したがって、場合は、HER2 遺伝子が増幅されたこの患者トラスツズマブ、抗 HER2 標的療法に対応する必要のあることを意味を示しています。FFPE 標本はポジティブ コントロールとして提供しています。非腫瘍性の細胞 (FFPE と NCFPE の両方) で観測された信号は、内部参照と HER2 遺伝子増幅用のネガティブ コントロールとして機能します。すべて分析シリーズ知られている遺伝子増幅状態に少なくとも 1 つのセクションはハイブリダイゼーション反応の肯定的な制御として使用する必要があります。
RNA の品質:
2 つのケースから対応する FFPE と NCFPE のサンプルでは、リアルタイム逆転写 PCR を用いた RNA の品質の違いを示しています。得られた結果を表示異なる私アンプリコンの長さの異なる増幅効率 (すなわち、71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp) GAPDH mRNA の。FFPE サンプルから得られたすべての Ct (サイクルしきい値) 値は、NCFPE からのそれらより高かった。この違いより顕著な化学修飾を示唆 FFPE 組織から分離された mRNA の低い PCR amplificability を示しています。さらに、Ct 値が大きいほど短い産物と比較して長いために、mRNA の断片化のための指標。比較では、長さの異なる私アンプリコン Ct 値斜面は NCFPE 組織 (図 3) よりもより顕著に FFPE の mRNA 断片化を示しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2.jpg"> 
図 2: 対応するホルマリン固定パラフィン包の HER2 魚の代表の結果 (FFPE) を埋め込まれ、非相互リンク、無料のホルマリン固定パラフィン埋め込まれた組織切片を (NCFPE) です。同じ FFPE (A) と NCFPE (B) 組織から対応するサンプルのとおりです。通常間期細胞 (C)、2 グリーン (HER2) と 2 つの赤 (CEN17) 信号が予想されるのとは対照的増幅の HER2 遺伝子座を持つセルを表す緑信号 (HER2) の複数のコピー (D)。HER2 増幅状態は FFPE のポスト固定の NCFPE セクション (A、B) と同じでした。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55885/55885fig3.jpg"> 
図 3: RNA 品質管理用リアルタイム逆転写 PCR 法の結果。Y 軸: GAPDH 遺伝子の Ct (サイクルしきい値) 値の異なる私アンプリコンの長さのとおり (71 bp、153 bp、200 bp、275 bp、323 bp) x 軸に。mRNA は FFPE と PCR のため並列で cDNA に転写加工 2 つ異なる乳がん組織検体の NCFPE から分離されました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55885/55885fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

蛍光の現場の交配 (魚) は、病理と個別化医療の治療法の選択のための分子診断との組み合わせで多くの場合必要です。できる高品質の形態学的、分子と魚解析同じ標本からポスト固定ステップの添加による魚を提示する前に新規非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液。

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

Morphologic assessment of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples has been the gold standard for cancer diagnostics for decades due to its ...

個別化医療には、古典的な組織学から分子解析まで、さまざまな種類の分析が必要であり、最適な治療法を選択するために腫瘍に対して多様なin-situ（in situ）手技が実施されます。これらの調査手法により、単一の検体からさまざまな分析技術を適用することが可能になります。本稿では、単純なホルマリン後固定ステップにおいて非架橋固定剤を使用することで、元々ホルマリン固定パラフィン包埋材料用に開発・検証されたプロトコルを細胞サンプルに適用でき、良好な形態保持、良好なRNA品質、および良好なfull-length sense in-situ ハイブリダイゼーション結果が得られることを実証します。一般的なハイブリダイゼーション条件では、FISHの結果を得るためにホルマリン固定されていない組織に適していません。私たちは、ペクチン固定組織から同等のFISH結果を得るために重要であるのは、浸透ではなく化学的な補正時間であることを明らかにしました。FISHに使用される切片のみが、ホルマリンによる後固定に供されています。RT-PCRで実証されたように、残りのホルマリンフリー固定組織は、FFP組織と比較して優れた分子解析を可能にします。この手順を、私の研究室の技術者であるDaniela Pabstが実演します。まず、十分な組織量を確保するため、乳癌組織サンプルを滅菌メスで4 mm厚の2つの半分に切断します。標準的な緩衝ホルマリン溶液による固定、または代替的な非架橋・ホルマリンフリー組織固定を行う際は、最大サイズを4x15x15 millimitersとして使用してください。腫瘍検体の一半分を標準的な組織カセットに入れ、SBFSに浸します。腫瘍検体のもう半分を、固定液と組織の体積比が4:1となるように代替固定液に入れ、24時間放置してください。次に、容器を開けて組織カセットを180度回転させ、浸漬させることで、代替固定したサンプルを安定剤溶液に2時間から72時間移します。続いて、SBFSで固定したサンプルが入った組織カセットを、70% ethanolを満たした容器に室温で30分間置き、残留したSBFSを除去します。テキストプロトコルに記載された組織処理および包埋の後、ミクロトームを使用してFFPEおよびNCFPEブロックを3 µmの厚さで切片化します。各種類の切片を数枚ずつ、冷水バスに入れます。浮いている切片を細い筆を用いて精密顕微鏡スライドにすくい上げ、温水バスへと移します。再び筆を用いて、しわがないように切片を伸ばしながら顕微鏡スライド上に回収します。また、各タイプの切片の一部を反応用チューブに入れ、同一試料を用いて逆転写PCRを行うためのRNA単離の準備をします。組織切片の脱パラフィン処理を行うため、染色瓶に250 millilitersの各試薬を満たし、室温で段階的に切片を親水化させます。まず、切片を100%xyleneに2回、各15分間浸し、次に96%ethanolに2回、各15分間移します。次に、エタノール濃度を段階的に下げながら切片を移行させ、各溶液で2分間インキュベートします。最後に、切片を2回、蒸留水に10分間移します。NCFPEスライドをSBFSで満たした新しい染色瓶に入れ、室温で24時間置いて後固定を行います。24時間の後固定ステップの間、ジャーをドラフトチャンバー内に置いたままにします。驚くべきことに、18時間を超えるすべての後固定時間において、ホルマリン固定パラフィン包埋材料で得られた結果と同様の結果が得られました。リン酸緩衝生理食塩水で3回10分間洗浄し、スライドから過剰なSPFSを除去します。続いて、蒸留水で10分間の2回目の洗浄を2回行います。次に、250 mLのクエン酸熱前処理溶液を入れた染色瓶を98 °Cのウォーターバスに置きます。後固定したNCFPEスライド上の水和FFPEを瓶に入れ、15分間インキュベートします。次に、新しい染色瓶を用いて、室温で3分間、蒸留水でスライドを洗浄します。タンパク質分解のため、スライドを37 °Cに制御されたハイブリダイゼーション装置に入れます。組織切片が完全に覆われるまで、調製済みのペプシン溶液を滴下します。次に、ハイブリダイゼーションシステム内で37 °Cで9分間インキュベートします。続いて、スライドをSSC洗浄バッファーを入れたジャーに入れ、5分間インキュベートします。その後、スライドを室温の蒸留水に1分間浸します。段階的な濃度のアルコール系列を用いて、各1分間ずつ切片の脱水を行います。脱水処理後、切片を風乾させます。ハイブリダイゼーションでは、乾燥させた組織切片上にHER2およびsun 17プローブの混合液を10 µL分注し、各サンプルをカバーガラスで覆い、ラバーセメントで封印します。ハイブリダイゼーションシステム内で、プローブと検体DNAを75°Cで10分間熱変性させます。その後、システムが自動的に37°Cまで温度を下げ、一晩ハイブリダイゼーションを行います。翌日、ポストハイブリダイゼーションおよび保護のために、ピンセットを用いてラバーセメントとカバーガラスを慎重に除去します。37 °Cに予熱した1XバッファーAを含む染色瓶の中で、スライドを5分間インキュベートします。次に、27 °Cに予熱した1X洗浄バッファーを用いて、スライドを5分間ずつ2回洗浄します。その後、70%、90%、および100%のエタノールを用いて、各濃度で1分間ずつスライドを脱水します。サンプルを風乾させ、遮光して保存します。染色の際は、気泡が入らないように注意しながら、ハイブリダイゼーション領域に30 µLのDAPI溶液を滴下します。カバーガラスを被せ、遮光した状態で15分間インキュベートします。フィルターペーパーでスライドを軽く挟み、余分なDAPI溶液を慎重に取り除きます。共焦点顕微鏡による評価まで、スライドを2～8°Cの暗所で最大2週間保存します。グリーンおよびオレンジのチャンネル用フィルターを用いて画像を撮影します。テキストプロトコルに記載されている手順に従い、データの解釈およびRNA品質の評価を行ってください。ここでは、ホルマリン固定サンプルと、後固定処理を施した非架橋固定サンプルの結果を直接比較して示しています。シグナルの強度は同程度であり、背景（バックグラウンド）も同様です。通常の間期細胞では、HER2遺伝子座と参照用17番染色体遺伝子座に対応する赤色および緑色のシグナルが同数であり、HER2遺伝子に増幅がないことを示しています。ここでは、HER2遺伝子が増幅している別の症例の結果を示しており、参照遺伝子よりもHER2遺伝子座のシグナルがはるかに強く、広範に現れています。この現象は、ホルマリン固定および固定済み組織、ならびに非架橋固定組織の両方で認められます。このグラフは、GAPDH mRNAの異なるアンプリコン長における増幅効率を示しています。ホルマリンの場合、約23サイクルが必要ですが、非架橋固定試料ではこれが20サイクルに減少します。この差はアンプリコン長が長くなるほど顕著になり、非架橋固定剤を使用することで、断片化と化学的修飾の両方が大幅に抑制されることが示唆されます。このビデオを視聴することで、分析前操作に簡単な後固定ステップを追加することにより、非架橋固定試料においてFDA承認のFFPN材料向けキーを使用する方法を十分に理解できるはずです。この手法の主な利点は、フルセンスin-situハイブリダイゼーションに使用する切片のみをホルマリンで後固定し、残りのブロックは非架橋固定液で固定されるため、幅広い分子解析に使用できることです。このプロトコルは、比較的小さな腫瘍から複数の解析を行う必要があり、異なるプロトコルのために組織検体を個別に処理することが困難な現代の個別化医療の文脈において特に有用です。さらに、非架橋固定剤を使用することには、凍結保存と同様に組織の特性を維持できるという利点があります。これにより、液体窒素による凍結や、化学的な文脈でのコールドチェーンの維持が不要になります。固定パラフィン包埋材から抽出したRNAの品質において、これらのRNA品質の差は、RNA整合性数値（RIN）などの古典的なRNA品質管理アッセイでは明確に現れません。これは、これらのアッセイが固定パラフィン包埋材から単離されたRNAの品質を完全に評価できるものではないためです。

protocol-for-her2-fish-using-non-cross-linking-formalin-free-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

マウス組織からのデータ収集を最大にするために異なる技術の組み合わせが提示される。...

親油性色素を組み合わせることで、その場でハイブリダイゼーション、免疫組織化学、および組織学

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。...

ラット中枢神経系および末梢リンパ節の組織切片での免疫組織化学的解析

ここで説明するプロトコルは、全量網膜製剤の構造評価のためのものです。これには、組織解剖、親水性ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)メンブレンインサートへのマウント、蛍光マーカーによるボーラスローディング、細胞およびシナプス成分の免疫組織化学的分析のためのカルボジイミドおよびパラホルムアルデヒドによる固定の比較の説明が含まれます。...

イメージングと免疫組織化学のための網膜ホールマウントの準備のために最適化されたプロトコル

この資料に記載されている間接免疫プロトコルは、検出およびマウス乳腺中のタンパク質の局在を可能にします。完全な方法は、乳腺のサンプルを調製するために蛍光顕微鏡により画像を、組織切片の免疫組織化学を実行し、画像を再構成するために与えられています。...

マウス乳腺の凍結切片の間接免疫

この原稿では、石灰化組織の凍結切片に対する数回の蛍光イメージングから、複数の応答測定値の整列した合成画像を生成するためのハイスループットの半自動凍結組織学プラットフォームを紹介します。...

高スループット、石灰化組織のマルチイメージCryohistology

プロトコルを開発し、ミリ波スケール試料の埋め込みを有効化するカスタム装置を設計されています。アクリル樹脂、ポリイミドのマイクロ CT...

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このプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ胚からの凍結切片に対する順次免疫蛍光および免疫組織化学を示し、特定の細胞集団における正確なコローカリゼーション分析を可能にする。...

凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対する順次免疫蛍光と免疫組織化学

本報告では、免疫組織化学(IHC)のための凍結マウス網膜切片を準備するための包括的な方法について説明する。...

免疫組織化学用マウスレチンクライオ切片の調製

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

ここでは、胚の固定、免疫染色、および切片化のために最適化された段階的なプロトコルが提供され、発達中のマウス組織におけるサイトネムと呼ばれる特殊なシグナル伝達糸状体を検出します。...

シトネム解析のための胚性マウス組織の固定

学ぶ非架橋性ホルマリン不使用固定法によるFISH解析プロトコル。乳がん組織で形態と分子品質を保持し、個別化医療のための複合診断を同一検体から実現する革新的な組織処理技術を探索する。

HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

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