HER2 のプロトコルは、非相互リンク、無料のホルマリン組織固定液を使用して低温保存とホルマリン固定の利点を結合する魚します。

個別化医療では、従来の組織学から分子解析まで様々な解析が必要であり、腫瘍に対して様々なin-situ技術を用いて最適な治療法を選択しています。この調査技術により、1つの標本からさまざまな分析技術が可能になります。ここでは、単純なホルマリン固定後のステップで非架橋固定剤を使用することで、フォーマルで固定されたパラフィン包埋材料用に最初に開発および検証されたプロトコルを使用し、細胞サンプルから使用して良好な形態、良好なRNA品質、およびより完全な感覚のin-situハイブリダイゼーションのための良好な結果が得られることを実証します。

典型的なハイブリダイゼーション条件は、ホルマリンフリーの固定組織がFISHの結果を生成するのには適していません。私たちは、ペクチン固定組織から同等のFISH結果を達成するために重要であるのは、浸透ではなく化学的補正時間であることを明らかにしました。FISHに使用されるセクションのみが正式なもので、ポスト固定されています。

残りのホルマリンフリー固定組織は、RTPCRで実証されているように、FFP組織と比較して優れた分子分析を可能にします。私たちがデモンストレーションした手順は、私の研究室の技術者であるダニエラ・パブストによるものです。まず、滅菌メスで乳がん組織サンプルを2つに切り、それぞれ4mmの厚さにして、適切な組織量を確保します。

標準的な緩衝ホルマリン溶液による固定、または代替の非架橋ホルマリンフリー組織固定による固定には、最大サイズの4x15x15ミリリミッターを使用してください。腫瘍標本の半分を標準的な組織カセットに入れ、SBFSに沈めます。腫瘍標本の残りの半分を、固定剤4部と組織1部の体積あたりの体積比で24時間、代替固定液に入れます。

次に、交互に固定したサンプルを容器を開けて組織カセットを180度回転させ、それを沈めて、安定剤溶液に2〜72時間移します。次に、SBFSを固定したサンプルを入れた組織カセットを70%エタノールを入れた容器に室温で30分間入れ、残留SBFSを除去します。テキストプロトコルに記載されている組織処理と包埋に続いて、ミクロトームを使用してFFPEおよびNCFPEブロックの3ミクロン切片を切断します。

各タイプのセクションの一部を冷水浴に入れます。浮いている部分を細かい顕微鏡スライドに細い絵筆でつまみ上げ、温水浴に移します。伸ばした部分を絵筆で再び顕微鏡スライドに持ち上げ、しわが寄らないようにします。

また、RNA単離を準備して、各タイプの切片の一部を反応バイアルに入れることにより、同じサンプルで逆転写PCRを実行します。組織切片の脱パラフィンのために、250ミリリットルの異なる試薬を含む染色ジャー内で室温で切片を段階的に水和します。まず、切片を100%キシレンに2回15分間入れ、次に切片を96%エタノールに2回15分間移します。

次に、切片を徐々に低い割合のエタノールで移動させ、各溶液を2分間インキュベートします。最後に、切片を蒸留物に2回10分間移します。NCFPEスライドをSBFSで満たされた新しい染色ジャーに室温で24時間入れて、NCFPEスライドの固定後処理を行います。

固定後24時間のステップで、瓶をドラフトに入れたままにします。驚くべきことに、18時間を超えるすべての固定後時間では、フォーマルで固定されたパラフィン材料で得られた結果と同様の結果が得られました。スライドから余分なSPFSを取り除き、リン酸緩衝生理食塩水で10分間3回洗浄します。

続いて、蒸留水で10分間2回目の洗浄を行います。次に、250ミリリットルの熱前処理溶液クエン酸を含む染色ジャーを摂氏98度の水浴に入れます。後固定したNCFPEスライドに水和FFPEをジャーに入れ、15分間インキュベートします。

次に、スライドを蒸留水で室温で3分間、新しい染色ジャーで洗浄します。タンパク質分解のために、スライドを摂氏37度の温度制御されたハイブリダイゼーションに入れます。すぐに使用できるペプシン溶液を組織切片に滴下し、完全に覆われるまで

次に、ハイブリダイゼーションシステム内で摂氏37度で9分間インキュベートします。次に、スライドをSSC洗浄バッファーの入ったジャーに入れ、5分間インキュベートします。スライドを蒸留水に室温で1分間置きます。

一連の等級付けされたアルコールの切片を、それぞれ1分間脱水します。.脱水シリーズの後、切片を風乾します。ハイブリダイゼーションのために、HER2とsun 17を組み合わせたプローブの10マイクロリットルを乾燥組織切片にピペットで移し、各サンプルをカバースリップで覆い、ゴムセメントで密封します。

ハイブリダイゼーションシステム内のプローブと標本のDNAを摂氏75度で10分間変性させます。ハイブリダイゼーションシステムは自動的に摂氏37度まで減少し、ハイブリダイゼーションは一晩中進行します。翌日、ゴムセメントとカバーを慎重に取り除き、鉗子でカバーもスリップして、ハイブリダイゼーション後と保護を行います。

摂氏37度に温めた1XバッファーAを入れた染色ジャーで、サイズをインキュベートします。次に、予め温めた1X洗浄バッファーを使用して、27°Cで5分間スライドを2回洗浄します。次に、スライドを70%90%および100%エタノールで1分間、濃度ごとに脱水します。

サンプルを空気中で乾燥させ、光から保護します。染色には、30マイクロリットルのDAPI溶液をハイブリダイズ領域に塗布し、気泡を避けます。切片をカバースリップで覆い、切片を15分間インキュベートする前に、光から保護します。

スライドを濾紙の間にそっと押して、余分なDAPI溶液を慎重に取り除きます。スライドは、共焦点顕微鏡による評価まで、最大2週間、暗所で摂氏2〜8度で保管します。緑とオレンジのチャンネルのフィルターを使用して画像を取得します。

テキストプロトコルに記載されているように、データの解釈とRNA品質の評価に進みます。ここに示されているのは、フォーマルサンプルと固定サンプルから得られた結果と、ポストフィックスされた非架橋固定サンプルの結果を直接比較したものです。信号の強度は同程度で、背景も似ています。

正常な間期細胞では、HER2遺伝子座とsen17参照遺伝子座に対応する赤と緑のシグナルが同数存在し、HER2遺伝子に増幅がないことを示しています。ここに示されているのは、HER2遺伝子が増幅され、参照遺伝子よりもHER2遺伝子座の方がはるかに強く、より広いシグナルが存在する別のケースの結果です。この現象は、形式組織と固定組織、および非架橋固定組織で明らかです。

このグラフは、GAPDH mRNAのさまざまなアンプリコン長に対する増幅効果を示しています。ホルマリンの場合、約23サイクルが必要であり、非架橋固定材料の場合、これは20サイクルに減少します。この違いは、長いアンプリコンでより明白になり、非架橋固定剤を使用することでフラグメンテーションと化学修飾の両方が著しく減少することを示しています。

このビデオを見た後、分析前の手順に簡単な固定後ステップを追加することで、非架橋固定材料上のFFPN材料にFDA承認のキーを使用する方法をよく理解できるはずです。この手法の主な利点は、フルセンスのin-situハイブリダイゼーションに使用されるセクションのみがホルマリンによる後固定用であるのに対し、残りのブロックは非架橋固定剤に固定されているため、幅広い分子分析に使用できることです。このプロトコルは、比較的小さな腫瘍から複数の分析を行う必要があり、異なるプロトコルの組織標本を処理することが不可能な現代の個別化医療の文脈で特に有用です。

さらに、非架橋固定剤を使用すると、凍結保存などの組織特性を維持できるという利点があります。これにより、液体窒素を凍結する必要がなくなり、化学的な状況で冷却チェーンを維持する必要がなくなります。これらのRNA品質の違いは明らかではないため、RNAインテグリティ数などの従来のRNA品質管理アッセイを使用する場合、これらのアッセイは固定材料およびパラフィン包埋材料から単離されたRNA品質において完全に形成的ではないためです。