胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージングウテロのエレクトロポレーション

このプロトコルは、放射状に移動する皮質ニューロンの直接観察のための指示を提供する。 子宮内でのエレクトロポレーションでは、器官型スライス培養および時間経過共焦点画像化を組み合わせて、移動するニューロンにおける関心対象遺伝子の過剰発現または下方制御の影響を直接かつ動的に研究し、発生時のそれらの分化を分析する。

この手順の全体的な目標は、エレクトロポレーションされた胚性脳から調製された器官型スライス培養物中の放射状に移動するニューロンを、タイムラプス共焦点顕微鏡法によって直接観察することです。この方法は、新皮質の発達の重要な側面を研究するのに役立ちます。これにより、ニューロンの分極と、脳内の最終位置へのニューロンの半径方向の移動に関与する分子メカニズムの調査が可能になります。

この手法の主な利点は、速度プロファイル、平均移動速度、移動方向の変化など、移動するニューロンの動的特性を分析できることです。適切に麻酔をかけた妊娠中のマウスを温めプレートの仰臥位に置くことから始めます。ペダル反射がないことを確認してください。

そして、目が乾燥しないようにワセリンで慎重に覆います。次に、手足をやさしく広げ、サージカルテープでウォーミングプレートに固定します。70%エタノールとヨウ素溶液で綿棒で拭いて腹部を滅菌し、腹部切開のために切り込みを入れた滅菌ガーゼを腹部の上に置きます。.

ガーゼを静菌性塩化ナトリウム溶液で湿らせます。外科的麻酔の発達を再評価した後、ペダル反射の喪失により、鋸歯状のマイクロアドソン鉗子と角度のついた細いはさみを使用して、腹部の正中線に沿って皮膚を約1.5センチメートル切断します。次に、リネアアルバに沿って下にある筋肉をカットします。

リング鉗子で胚の間の子宮角をつかみ、胎盤や供給血管を乱さずに湿らせたガーゼにそっと置きます。次に、胚を慎重に配置して、矢状洞に平行な三日月形の影として現れる側脳室をはっきりと見ることができます。注射部位は、色素沈着した眼と、矢状洞が2つの移動洞に分岐する副鼻腔の合流点との間の線の中央にあります。

特定されたら、マイクロインジェクション針を子宮壁から側脳室に押し込みます。次に、フットペダルで操作するマイクロインジェクターを使用して、1〜2マイクロリットルのDNA溶液を5〜10パルスで注入します。成功した注射は、心室系を満たすはずの色付きDNA溶液によって監視できます。

次に、正極が注入された心室と同じ側にくられるようにピンセットタイプの電極を配置し、負極が胚の頭の耳の下に注入された心室の反対側にくるように配置します。エレクトロポレーション部位を数滴の静菌性塩化ナトリウム溶液で湿らせ、950ミリ秒間隔で50ミリ秒の電流パルスを5回印加します。負極の気泡は電流を示しています。

エレクトロポレーションを成功させるには、通常60〜90ミリアンペアで十分です。電流が小さいとニューロンが効率的にトランスフェクションされませんが、電流が大きいと胚死につながる可能性があります。最初の子宮角のすべての胚に対してこの手順を繰り返した後、それを腹腔内にそっと戻します。

筋肉層と皮膚を縫合した後、ヨウ素溶液で丁寧に消毒し、セルロース綿棒を使用して目からワセリンをやさしく取り除きます。マウスがウェイクアップするまで、赤外線ランプの下に置きます。承認された方法を使用して妊娠中の女性を安楽死させた後、胚を含む子宮を取り出し、氷冷した完全なHBSSを入れた10センチメートルのシャーレに入れます。

この時点から、すべての溶液、胚、脳を氷の上に置いてください。実体顕微鏡で作業しながら、先端の細い鉗子とVannas Tubingenスプリングハサミを使用して、各胚を子宮から分離します。胚を氷冷した完全なHBSSを含む別のシャーレに移します。

脳幹のレベルで切開を行い、矢状正中線に沿って切り込みます。脳を覆っている皮膚と軟骨をはがします。次に、半球のすぐ後ろの脳幹を切り取り、頭蓋骨から脳を取り出します。

マイクロスプーンスパチュラで脳を氷冷した完全なHBSSが入った12ウェルプレートに移します。12ウェルプレートのリターからすべての脳を回収します。次に、蛍光実体顕微鏡を使用して、12ウェルプレートの脳をスクリーニングし、蛍光の明るさとエレクトロポレーション領域のサイズを確認します。

明るい蛍光シグナルと推定体性感覚皮質を持つ2〜4つの脳を選択して、さらに処理します。次に、溶融した3%低融点アガロース溶液を剥離使い捨て埋め込み型に流し込みます。マイクロスプーンスパチュラを使用して12ウェルプレートから脳を取り出し、細かいティッシュペーパーを使用して脳の周りから余分な完全なHBSSを慎重に排出します。

脳をアガロース溶液にやさしく入れます。次に、20ゲージの針を使用して金型の底に押し込み、慎重に位置を調整します。冠状切片の場合は、嗅球が上を向くように脳を向けます。

アガロース溶液が固まるまで型を氷上に置いてから、脳の切片化に進みます。清潔なカミソリの刃を使用して、脳の周りの余分なアガロースを切り取り、2〜3ミリメートルのアガロースが残るはずの嗅球を除くすべての側面に約1ミリメートルのアガロースを残します。少量のシアノアクリレート接着剤を標本に塗布した後、トリミングされたアガロースブロックを嗅球が下を向くように固定します。

氷冷した完全なHBSSを含む振動ブレードミクロトームのスライスチャンバーに試料ステージを移し、脳の背側をブレードに向けて配置します。エレクトロポレーション領域を含む厚さ250ミクロンの脳スライスを、低から中程度の振幅と非常に遅い切片化速度で切断します。通常、エレクトロポレーションに成功した各脳から、明るい蛍光シグナルを有する4〜6枚のスライスが得られます。

先端の細い鉗子で1つのセクションのアガロースの縁をつかみ、曲がったマイクロスプーンヘラにスライスを引きます。このようにして、脳のスライスを氷冷した完全なHBSSを含む6ウェルプレートに慎重に移します。ラミニンコーティングされたメンブレンインサートを100マイクロリットルの完全なHBSSで湿らせます。

次に、曲げたマイクロスプーンヘラと鉗子を使用して、スライスをメンブレンに慎重に移します。へらからスライスをメンブレンにそっと押し込み、鉗子を使用して位置決めします。残りのスライスの転送を続けます。

1つのメンブレンインサートに最大5つのスライスを配置できます。ピペットで余分な完全なHBSSを取り除きます。次に、鉗子の助けを借りて、スライスしたメンブレンインサートを1.8ミリリットルのスライスした培地を含む6ウェルプレートに慎重に配置します。

倒立顕微鏡でスライスを見て、イメージングする脳スライスを選択します。上部 SVZ の明るい単一ニューロンがスライスのパイル表面に向かって放射状に移動するスライスを選択します。複合体プレート全体に広がる放射状グリア細胞の微細な蛍光過程の存在は、移動する結合ニューロンによって使用される無傷の放射状グリア足場を示しています。

選択したスライスを入れたメンブレンインサートを、2ミリリットルのスライス培地を含む直径50mmのガラス底ディッシュに移します。ディッシュを共焦点顕微鏡のクライメートチャンバーに入れます。解像度を 512 x 512 ピクセルに設定します。

スキャン速度を 400 ヘルツから 700 ヘルツに上げて、フレーム レートを約 1.4 フレーム/秒から約 2.5 フレーム/秒に上げます。平均化は 2 回以下で行ってください。エレクトロポレーション領域を通るZスタックを、ステップサイズ1.5ミクロンで定義します。

タイムラプスシリーズは、30分ごとにZスタックを撮影して開始します。説明されている設定により、画像の十分な解像度と明るさを確保しながら、取得中の写真の損傷を低く抑えることができます。この動画は、E16.5皮質ニューロンが心室腹下帯から皮質板に移動する様子を示しています。

Bcl11aでは、胚の14.5日目にIRES-GFPコントロールプラスミドのエレクトロポレーション後に浮かんだ条件付きトランスジェニック。このムービーは、108フレーム/秒の速度で構成されています。スケールバーは100ミクロンを表します。

Cre-IRES-GFPを含むDNAプラスミドベクターのエレクトロポレーションは、条件付きBcl11aフロックス脳における皮質ニューロンの移動に影響を与えました。ここで見られるように、中間ゾーンを通過して皮質プレートに到達するニューロンはほとんどありません。この動画は、左のGFP標識コントロールの皮質ニューロンと右のBcl11a変異体からのニューロンの分極を示しています。

Bcl11a変異体ニューロンにおける代表的な制御のこれらのアニメーショントレースは、1時間間隔の分解能でE16.5スライス培養のタイムラプスシリーズから得られた。ここでも、コントロールブレインからのデータを左側に、Cre-IRES-GFPエレクトロポレーションブレインからのデータを右側に示します。対照およびBcl11a変異体スライス培養物からの代表的なトレースのこのコレクションからわかるように、Bcl11a変異体ニューロンは、赤い矢印でマークされているように、移動速度の低下とランダムに方向が変化する反復段階を頻繁に経験します。

速度プロファイルは、移動するニューロンの痕跡から計算できます。ここで見られるように、Bcl11a変異体ニューロンの大部分は、対照群と比較して移動速度が遅い。偏差角度は、トレースデータから計算できます。

このヒストグラムからわかるように、黒いバーで表されるBcl11a変異体ニューロンは、対照と比較してより大きな偏差角を示します。一度習得すると、この技術は、子宮内エレクトロポレーションと器官型脳スライス培養の準備のために、それぞれ2時間未満で行うことができます。この手順は、機能の獲得と喪失、および血管実験による放射状に移動する皮質ニューロンにおける目的の遺伝子の分割解析を実行するために容易に適合させることができます。

このビデオを見れば、エレクトロポレーションされた胚性脳から調製した器官型スライス培養において、タイムラプス共焦点顕微鏡法により放射状に移動するニューロンを直接観察する方法を十分に理解できるはずです。