胚性マウス脳の器官型スライス培養における移行ニューロンの経時的共焦点イメージング

本手順の全体的な目的は、エレクトロポレーションを施した胚脳から調製した臓器型スライス培養において、放射状に移動するニューロンをタイムラプス共焦点顕微鏡で直接観察することです。この手法は、新皮質発達の重要な側面の研究に役立ちます。これにより、ニューロンの極性形成に関与する分子メカニズムや、脳内の最終目的地へのニューロンの放射状移動についての調査が可能になります。

この手法の主な利点は、移動速度プロファイル、平均移動速度、および移動方向の変化を含む、移動ニューロンの動的な特性を分析できることです。まず、適切に麻酔をかけた妊娠マウスを、ウォーミングプレート上の仰臥位に配置します。足底反射がないことを確認してください。

その後、乾燥を防ぐため、眼をワセリンで丁寧に覆います。次に、四肢をゆっくりと広げ、外科用テープで加温プレートに固定します。腹部を70% ethanolで拭き、続いてヨウ素液で消毒した後、腹部切開用に切り込みを入れた滅菌ガーゼを腹部に当てます。

細菌静止剤含有塩化ナトリウム溶液でガーゼを湿らせます。足底反射の消失により外科的麻酔の状態を再確認した後、ギザ付きマイクロアドソン鉗子と角度付き微細剪刀を用いて、腹部正中線に沿って皮膚を約1.5センチメートル切開します。次に、白線に沿って下層の筋肉を切開します。

リング鉗子で胚の間の子宮角を把持し、胎盤や供給血管を乱さないように、湿らせたガーゼの上に静かに置きます。次に、矢状静脈洞に平行な三日月形の影として現れる側脳室が明確に見えるように、胚を慎重に配置します。注入部位は、色素沈着した眼と、矢状静脈洞が2つの転移静脈に分かれる静脈洞合流点を結ぶ線の中間にあります。

標的を特定した後、マイクロインジェクション針を子宮壁から側脳室へと刺入します。次に、フットペダルで操作するマイクロインジェクターを用い、5～10回のパルスで1～2 µLのDNA溶液を注入します。注入の成否は、脳室系を満たす着色されたDNA溶液によって確認できます。

次に、陽極が注入した心室側に、陰極が注入した心室の反対側で胚の頭部の耳の下にくるように、ピンセット型電極を配置します。エレクトロポレーション部位に静菌性塩化ナトリウム溶液を数滴滴下して湿らせ、50ミリ秒のパルス幅、950ミリ秒の間隔で、電気パルスを5回印加します。陰極に気泡が発生していれば、電流が流れていることを示します。

通常、エレクトロポレーションを成功させるには60から90ミリアンペアで十分です。電流が低すぎるとニューロンへの導入効率が低下し、高すぎると胚死亡につながる可能性があります。第一子宮角のすべての胚に対してこの手順を繰り返した後、慎重に腹腔内に戻します。

筋層と皮膚を縫合した後、ヨウ素溶液で慎重に消毒し、セルロース綿棒を用いて眼から पेट्रोलियम jellyを優しく取り除きます。マウスを赤外線ランプの下に置き、覚醒するまで待ちます。承認された方法で妊娠した雌を安楽死させた後、胚を含む子宮を摘出し、氷冷した complete HBSSを入れた10 cmのペトリ皿に移します。

ここからは、すべての溶液、胚、および脳を氷上に保持してください。実体顕微鏡下で、極細ピンセットとVannas Tubingenばね式剪刀を使用し、各胚を子宮から分離します。分離した胚を、氷冷した完全HBSSを含む別のペトリ皿に移します。

脳幹の高さで切開し、正中矢状面に沿って切断します。脳を覆っている皮膚と軟骨を剥がします。次に、大脳半球の直後で脳幹を切断し、頭蓋骨から脳を取り出します。

マイクロ spoons スパチュラを用いて、脳を氷冷した完全 HBSS を含む 12ウェルプレートに転移させます。1つのリターから得られたすべての脳を 12ウェルプレートに回収します。次に、蛍光実体顕微鏡を使用して、12ウェルプレート内の脳の蛍光強度および電気穿孔領域の大きさをスクリーニングします。

鮮明な蛍光シグナルが認められ、体性感覚皮質と思われる部位がある脳を2～4個選び、以降の処理に用います。次に、溶融した3%低融点アガロース溶液を、剥離可能な使い捨て埋め込み型モールドに注ぎます。マイクロスプーンスパチュラを使用して12ウェルプレートから脳を取り出し、微細組織紙を用いて脳周囲の余分な完全HBSSを慎重に拭き取ります。

脳をアガロース溶液の中に静かに置きます。次に、20ゲージの針を使用して、脳をモールドの底まで押し込み、慎重に位置を調整します。冠状断を作成する場合は、嗅球が上を向くように脳の向きを調整してください。

アガロース溶液が凝固するまで、モールドを氷上に保持し、その後、脳の切断に進みます。清潔なカミソリを用いて、脳周囲の余分なアガロースを切り取り、嗅球を除いて、全周囲に約1 mmのアガロースが残るようにします。嗅球の周囲には2〜3 mmのアガロースを残してください。標本に少量のシアノアクリレート系接着剤を塗布した後、嗅球を下向きにして、切り出したアガロースブロックを固定します。

検体を氷冷した完全HBSSを含む振動刃マイクロトームのスライスチャンバーに移し、脳の背面を刃に向けて配置します。低から中程度の振幅、および極めて低速の切断速度で、電気穿孔領域を含む250 micron厚の脳切片を作成します。通常、電気穿孔に成功した各脳から、強い蛍光信号を持つ切片が4枚から6枚得られます。

細先のピンセットで1つの切片のアガロース縁を掴み、曲がったマイクロスプーンスパチュラの上に切片を引き出します。この方法で、脳切片を氷冷した完全HBSSを含む6ウェルプレートに慎重に移します。ラミニンコーティングされたメンブレンインサートを100 µLの完全HBSSで湿らせます。

次に、曲げられたマイクロスプーンスパチュラとピンセットを使用して、スライスを慎重にメンブレン上に転写します。スパチュラからメンブレンに向けてスライスをそっと押し出し、その後ピンセットで位置を調整します。残りのスライスについても同様に転写を続けてください。

1枚のメンブレンインサートに最大5枚のスライスを配置できます。ピペットで過剰な完全HBSSを除去します。次に、ピンセットを用いて、スライスが入ったメンブレンインサートを、1.8 millilitersのスライス培養液が入った6ウェルプレートに注意深く配置します。

倒立顕微鏡でスライスを観察し、イメージングに適した脳スライスを選択します。スライス表面に向かって放射状に移動している、上部SVZの輝度の高い単一ニューロンが存在するスライスを選択してください。脳室帯全体に広がる放射状グリア細胞の微細な蛍光突起が確認できれば、移動中のニューロンが利用する放射状グリア足場が維持されていることを示しています。

選択したスライスが入ったメンブレンインサートを、2 mLのスライス培養液を含む直径50 mmのガラス底ディッシュに移します。ディッシュを共焦点顕微鏡のクライメートチャンバーに設置します。解像度を512×512ピクセルに設定します。

フレームレートを約1.4 fpsから約2.5 fpsに上げるため、スキャン速度を400 hertzから700 hertzに上げます。平均化回数は2回以内に設定してください。ステップサイズ1.5 micronsで、電気穿孔領域をカバーするZスタックを定義します。

30分ごとにZスタックを取得し、タイムラプスシリーズを開始します。記載された設定により、画像取得中の光損傷を低く抑えつつ、十分な解像度と明るさを確保できます。この動画では、E16.5の皮質ニューロンが脳室下帯から皮質板へと移動する様子を示しています。

Bcl11a floxed 条件付トランスジェニックマウスにおいて、胚齢14.5日にIRES-GFPコントロールプラスミドをエレクトロポレーションした様子。この動画は1秒間に5フレームの割合で、計108フレームで構成されている。スケールバーは100 micronsを示す。

Cre-IRES-GFPを含むDNAプラスミドベクターのエレクトロポレーションにより、Bcl11aを条件付きでfloxした脳における皮質ニューロンの遊走が影響を受けました。ここに見られるように、中間帯を越えて皮質板に到達するニューロンは極めてわずかです。この動画では、左側のGFP標識コントロールと、右側のBcl11a変異体のニューロンにおける皮質ニューロンの極性化を比較して示しています。

Bcl11a変異ニューロンにおける代表的な対照群のアニメーショントレースは、1時間間隔の解像度で撮影したE16.5スライス培養のタイムラプスシリーズから得られたものです。ここでも、左側にコントロール脳のデータを、右側にCre-IRES-GFPをエレクトロポレーションした脳のデータを表示しています。対照群およびBcl11a変異スライス培養から得られたこれら代表的なトレースの集まりからわかるように、Bcl11a変異ニューロンでは、赤色の矢印で示されるように、移動速度の低下とランダムな方向転換が繰り返される局面が頻繁に認められます。

速度プロファイルは、遊走するニューロンのトレースから算出できます。ここで示されているように、コントロールと比較して、Bcl11a変異ニューロンでは遊走速度がより遅いニューロンの割合が高くなっています。偏差角はトレースデータから算出可能です。

このヒストグラムからわかるように、黒いバーで示されるBcl11a変異ニューロンは、コントロールと比較してより大きな偏角を示しています。習熟すれば、子宮内電穿孔法と組織培養脳スライスの準備は、それぞれ2時間以内に完了させることができます。本手法は、機能獲得および機能喪失による放射状遊走皮質ニューロンにおける標的遺伝子の分画解析や、血管実験にも容易に適応させることが可能です。

このビデオを視聴することで、エレクトロポレーションを施した胚性脳から作製したオルガノタイプスライス培養において、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて放射状に遊走するニューロンを直接観察する方法について、十分に理解できるはずです。