Name: 同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ 新規RIP-Tag;RIP-tvaマウスモデルを用いた遺伝子導入法で、膵β細胞前駆病変に鳥類レトロウイルスを心腔内投与し、転移因子を同定・解析する手法です。がん転移メカニズムの解明と新規治療標的の探索に有用です。

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本研究ではマウスの強力なモデル、リップ-タグについて述べるRIP-tva鳥レトロ ウイルスの同定と転移の要因の解析を介して体細胞遺伝子配達を達成するために。ただし、リップ-タグ;RIP tvaマウス膵神経内分泌腫瘍を発症、このマウス モデルにおける転移因子も他の種類のがんの転移を促進するかもしれません。
我々 のアプローチの導入したがって散発的な人間の腫瘍の開発をより忠実に模倣時間制御方法で膵 β 細胞の前癌病変に体細胞の遺伝的変化を具体的には利点があります。このアプローチは、開発中の興味の遺伝子の異所性発現のため従来のトランスジェニック モデルでしばしば観察された正常組織形成の任意の潜在的な摂動を回避できます。さらに、トランスジェニック マウスを生成するよりも興味のある遺伝子を運ぶ鳥 retroviral ベクトルを生成するはるかに高速です。RCASBP から派生した鳥レトロウイルスベクターは tva を表現する細胞in vitroとin vivoに Cdna (≤2.5 kb)、Shrna、Mirna、他の...

ほとんどの癌は、体細胞変異1から発生します。従来の遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) は、腫瘍2に特定の遺伝子変異の貢献に重要な洞察力を提供しています。ただし、彼らはいくつかの制限があります。これらのモデルの主な欠点は、組織内の一部のセルだけが遺伝の変化を取得する人間の腫瘍の形成の散発的性質を複製しないこと。トランスジェニック、ノックアウト マウスの突然変異生殖開発に影響を与える可能性があります。また、これらマウス モデルの生成は高価で時間がかかるです。
転移は、がんの分野で重要な問題です。転移のモデリングはジェムで難しくなっています。自然転移は、マウスではまれです。浸透度は可変して転移3のジェムで長い待ち時間です。転移の翼列の初期の手順が排除されますので、実験的転移モデルはマウスの循環にセルの直接注入を採用しています。
Bitransgenic マウス モデル、リップ-タグ マウス モデルにおける転移因子を勉強の上記の制限の一部を克服するために開発しました。RIP tva4。戦略は、高い同期腫瘍進行マウス モデル、 RIP タグ5、および受容体サブグループ A トリ白血病ウイルス、tva 6、7の使用を組み合わせることに基づいています。このリップ-タグ;RIP tvaマウス モデルにより、単一の bitransgenic マウス緊張体細胞染色体導入する遺伝子。SV40 T 抗原 p53 および Rb の腫瘍抑制機能を抑制、マウスは過形成、血管新生、腺腫、浸潤癌などの段階で人間の腫瘍と同様の方法で膵神経内分泌腫瘍を開発します。このRIP タグモデルは、がん、膵神経内分泌腫瘍に限定されないの認刻極印の私達の理解に非常に有益されています。また、前臨床試験8で使用されています。
体細胞遺伝子伝リップ-タグに鳥レトロ ウイルス intracardiacally の注入のためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス。RCASBP 由来鳥レトロ ウイルスを感染ターゲットの積極的に増殖の細胞が必要です。したがって、我々 はリップ-タグを選んだRIP tva 7 週齢、膵島の約 50% に過形成を開発するときにマウス。高力価ウイルスの左心室心腔内注射は、10-20 4の感染効率を達成するために必要です。この配信方法は、ウイルス膵島に到達する前に循環内のウイルスの粒子の重要な希釈を低減します。
このアプローチを使用すると、以前 Bcl-xl がその抗アポトーシス機能4,9の独立したがんの転移を促進することを確認しました。Bcl xLリップ-タグに発癌性個体中すべての膵 β 細胞での遺伝子を介して発現していたときこの抗アポトーシス独立転移機能は観察されなかったRIP Bcl xLモデル10をマウスします。したがって、マウス モデルは、ユニークな機会を識別し、特徴付ける腫瘍形成の後の段階で表現される場合に遺伝子の機能を提供しています。小島の 2-4%リップ-タグで腫瘍に発展するのでRIP tvaウイルス感染とすべての前癌病変なし bitransgenic マウスは、RCASBP 由来の鳥のレトロ ウイルスに感染している、癌の自然経過の選択的優位性を与える要因のみを識別できます。特に、転移要因最も簡単に認識されますこのメソッドによって膵リンパ節や他の臓器への転移はリップ-タグで通常発生しませんのでRIP tvaマウス。

<table><tbody><tr><td>RCASBP-Y DV plasmid</td><td>Addgene</td><td>11478</td><td></td></tr><tr><td>RCAS-RNAi plasmid</td><td>Addgene</td><td>15182</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン、100x</td><td>Corning</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin solution、100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS-/-、1x</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Superfect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td></td></tr><tr><td>Polyallomer 遠心分離管</td><td>ベックマン・コールター</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>0.45 mm Nalgene シリンジフィルター、PES メンブレン付き</td><td>Thermo Scientific</td><td>194-2545</td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ</td><td>BD</td><td></td><td></td>329461</tr><tr><td>synaptophysin</td><td>Vector Laboratories</td><td>VP-S284</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG)</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II</td><td>Life Technologies</td><td>N8080153</td><td></td></tr><tr><td>MyTaq DNA Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21106</td><td></td></tr></tbody></table>

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析rip tvaマウスモデル

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

転移がんは、固形腫瘍患者の死亡の 90% を占めています。がん転移のドライバーを理解して新たな治療標的を識別するために緊急の必要性があります。転移する癌から進行を駆動する分子のイベントを調査して、bitransgenic マウス モデル、リップ-タグを開発します。RIP tva。このマウス モデルでラットのインスリン プロモーター (RIP) は、膵 β 細胞における SV40 T 抗原 (タグ) およびサブグループ (tva) トリ白血病ウイルスの受容体の発現を駆動します。マウスは、過形成、血管新生、腺腫、浸潤癌などの段階で人間の腫瘍に類似している明確に定義された段階で 100% の浸透度を持った膵神経内分泌腫瘍を開発します。リップ-タグ;RIP tvaマウスは、転移性疾患を発症しない、転移を促進する遺伝の変化を簡単に識別することができます。体細胞遺伝子の tva 表現に、前癌病変は膵 β を増殖目的遺伝子変異をかくまっている鳥でレトロ ウイルスの心腔内注射によって実現されます。力価 &#62; 1 x 108感染単位 ml は生体内で感染症の適切なと見なされます。さらに、鳥のレトロ ウイルスリップ-タグで腫瘍由来細胞株に感染します。RIP tva高効率を持つマウス。細胞は、転移性の要因を明らかにも使用できます。ここで我々 はこのマウス モデルを利用し細胞の腫瘍の転移で候補者の遺伝子の機能を評価する方法を示します。

リップ-タグの生体内および生体外での感染率RIP tva RCASBP ベースのウイルスによる腫瘍細胞は ~ 20% 〜 80% とそれぞれ20。RIP-タグ;RIP tvaマウス モデル、各マウス 400 の膵島の約 4% に腫瘍20; 開発自然したがってウイルスによって遺伝子の潜在的な効果の組織学的表現型分析の各マウスにおける腫瘍細胞の十分な量があります。このシステムを使用して、転移 Bcl-xl の新規核関数は識別された9だった。RIP の-タグです。RIP tva RCASBP-Bcl xL感染マウス発生率が高い癌のコントロール ウイルス感染マウスよりも RCASBP-ALPP (対 74% 96%) を出展しました。さらに、RCASBP-Bcl-xlの 47%-リップ-タ...

リップ-タグを利用した体細胞遺伝子の転送システムを実証するためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス モデル転移遺伝子の機能を研究します。鳥のレトロ ウイルスは、成体マウスの膵 β 細胞の前癌性、非侵襲的病変への遺伝子導入を確保するため intracardiacally が配信されます。

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

本手順の全体的な目的は、新規RIP-Tag;RIP-tvaマウスモデルへの遺伝子導入により、転移因子の同定および特性解析を行うことです。この手法は、転移の駆動因子の同定や新規治療標的の探索など、がん転移分野における重要な疑問への回答に寄与します。このがんマウスモデルの主な利点は、膵β細胞前駆細胞領域への体細胞遺伝子導入を通じて、転移因子を同定できる点にあります。まず、感染させるマウス1匹あたり、ウイルス産生DF1細胞を播種した15 centimeterディッシュ1枚分を回収します。最初に、コンフルエントになった15 centimeterディッシュから培地を回収します。次に、あらかじめ冷却した遠心機を用い、1650 times G、4 degrees celsiusで10分間、低速遠心分離を行い、細胞残渣を除去します。次に、ウイルスの上清をポリアロマー超遠心管に移します。超遠心機を用いて、9540 ×g、4 °Cで1.5時間遠心分離します。その後、超遠心管から可能な限り多くの上清を除去します。次に、15 cmディッシュあたり最終的に100 µLのウイルス懸濁液となるように、超遠心管にPBSを加えます。チューブをラボ用フィルムで密閉し、中速で2分間ボルテックスして、目に見えないウイルスのペレットを再懸濁させます。その後、超遠心管を4 °Cで1時間または一晩、ロッキングミキサーで攪拌します。インキュベーション後、ウイルス懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、ウイルスのタイター測定に進みます。12ウェル組織培養プレートに播種したDF1細胞が30%コンフルエンスに達していることを確認し、タイター測定の手順を開始してください。ウイルスのタイター決定1回につき、12ウェルプレート1枚が必要です。まず、ウイルス上清5 µLをマイクロ遠心チューブ内の増殖培地495 µLと混合し、10⁻²希釈液を作成して、ウイルス上清の10倍段階希釈を開始します。数秒間、短時間にボルテックスします。次に、この10⁻²希釈液40 µLを、別のマイクロ遠心チューブ内の増殖培地360 µLに転移させ、10⁻³希釈液を作成します。数秒間、短時間ボルテックスします。この工程を繰り返し、10⁴および10⁵まで希釈します。次に、6 mLのポリスチレンチューブ5本に、増殖培地を2.25 mLずつ分注します。それぞれ、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰とラベルを貼ります。10⁶希釈液を作成するため、6 mLポリスチレンチューブ内で、10⁵希釈液0.25 mLと増殖培地2.25 mLを混合します。ボルテックスミキサーで数秒間軽く攪拌します。この手順を10⁻⁷、10⁻⁸、10⁻⁹、および10⁻¹⁰希釈について繰り返します。次に、12ウェルプレート上のDF1細胞から元の培地を除去します。そして、希釈したウイルス液を1 mLずつ、各ウェルに2連で加えます。細胞を 37 °C、5% CO₂ の条件下で少なくとも7日間培養します。まず、7週齢の RIP-Tag RIP-tva マウスを麻酔し、感染手順を開始します。角膜の乾燥を防ぐため、両眼に眼用潤滑剤を塗布します。RIP-Tag RIP-tvaマウスの胸腔から被毛を剃り、スナグルセーフウォーマーの上に敷いた吸収性ラボベンチペーパーの上に、胸を上にして仰向けに配置します。足指つまみ試験を行い、動物に反応がないことと、完全な麻酔効果を確認します。前肢を伸ばし、テープで固定します。マウスの胸部の注射部位をマークします。胸骨切痕と剣状突起上端の中間点にあたり、胸骨の解剖学的な左側にわずかにずれた位置をマークしてください。次に、ポビドンヨードスクラブまたはクロルヘキシジンスクラブを用いて胸壁前面を洗浄し、続いて70% isopropyl alcoholまたは70% ethanolに浸したガーゼスポンジで拭き取ります。滅菌済みの28.5ゲージインスリン用注射器を用いて50 µLの空気を吸引し、500 µL注射器のプランジャーと液面との間に隙間を作ります。次に、ウイルスを100 µL吸引します。壁面に液体がない空気層があることが、心拍を確認する上で極めて重要です。針を直立に保ち、片手でマウスの皮膚をピンと張らせて、印を付けた位置に針を刺入します。シリンジ内に鮮紅色の血液の拍動が見えたら、針の進展を止め、片手でマウスへの針の深さを固定します。もう一方の手でプランジャーをゆっくりと慎重に押し、約60秒かけてウイルス懸濁液を注入します。シリンジ内に鮮紅色の血液の拍動が見られるたびに、10-20 µLを注入します。透明な針ハブに酸素化された赤色の血液が連続的に流入していることは、針が左心室に適切に配置されていることを示しています。ウイルス懸濁液を注入するためにプランジャーを最後に押し出した後、次の血液の拍動が見える前に、速やかに針を胸腔から引き抜いてください。出血を抑えるため、注射部位を少なくとも1分間、軽く圧迫します。その後、マウスが完全に意識を取り戻すまで、慎重にヒートパッドの上またはヒートランプの下に移動させます。RIP-Tag RIP-tvaマウスを7週齢で指定のRCASBP-Bcl-xLレトロウイルスに感染させ、16週齢で安楽死させました。この写真は、膵リンパ節における転移性膵神経内分泌腫瘍の代表的なシナプトフィジン染色の結果を示しています。ここでは、RIP-Tag RIP-tvaマウスに指定のRCASBP-RHAM Bを感染させています。この写真は、膵リンパ節における転移性膵神経内分泌腫瘍の代表的なシナプトフィジン染色を示しています。ここでは、RCASBP-RHAMM Bウイルスの注入後、肝臓においてシナプトフィジン染色が認められます。RIP-Tag RIP-tvaマウスにおける増殖中のTVA細胞のin vivo感染には、1 mLあたり10⁸以上の感染単位が必要であること、またRCASBPレトロウイルスベクターは最大2.5 kbまでのcDNAを導入できることを留意しておくことが重要です。このマウスモデルの開発により、BCL-xLがその抗アポトーシス機能とは独立して、実際には癌の転移を促進するという、パラダイムシフトをもたらす発見への道が開かれました。

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記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。...

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

癌細胞の静脈内注射は転移研究でよく用いられるが、転移性腫瘍の負担は分析が難しい。本明細書において、転移の尾静脈注入モデルを示し、生じる転移性肺腫瘍の負担を分析する新しいアプローチを含む。...

腫瘍細胞の横尾静脈注入後の肺転移の病理学的解析

これは、抑制剤または癌転移のドライバーをスクリーニングするための効果的な方法です。発現ライブラリーを用いて細胞を導入し、鶏絨毛管内膜血管構造中に注入して転移性コロニーを形成する。浸潤性の減少または増加を有するコロニーは、切除、拡張、再注入して表現型を確認し、最後に、ハイスループットシーケンシングを用いて分析する。...

迅速かつ定量的なチック絨毛管内膜モデルを用いた転移性調節因子の発見

この記事では、メラノーマ転移の新規候補メディエーターを試験するために使用される技術のワークフローとその作用機序について説明します。...

メラノーマ転移の新規メディエーターの同定のための堅牢な発見プラットフォーム

学ぶ 新規RIP-Tag;RIP-tvaマウスモデルを用いた遺伝子導入法で、膵β細胞前駆病変に鳥類レトロウイルスを心腔内投与し、転移因子を同定・解析する手法です。がん転移メカニズムの解明と新規治療標的の探索に有用です。

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

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