同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

この手順の全体的な目標は、Novel RIP-Tagへの遺伝子導入によって転移因子を特定し、特徴付けることです。RIP-tva マウスモデル。この方法は、ドライバーや新規治療標的の特定など、がん転移領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。このがんのマウスモデルの主な利点は、膵臓ベータ細胞前駆体レギオンへの体細胞遺伝子導入によって転移因子を同定することです。

まず、感染するマウス1匹につきDF1細胞を産生するウイルスの15センチメートル皿を1枚採取します。まず、コンフルエントな15センチの皿から培地を回収します。次に、予冷した遠心分離機でGの1650倍、摂氏4度で10分間低速遠心分離することにより、細胞破片を除去します。

次に、ウイルス上清をポリアロマー超遠心チューブに移します。超遠心分離機でGの9540倍、摂氏4度で1.5時間回転します。超遠心チューブからできるだけ多くの上清を取り除きます。

次に、PBSを超遠心チューブに加えて、15センチメートルの皿あたり最終的な100マイクロリットルのウイルス懸濁液を作ります。チューブを実験用フィルムで覆い、目に見えないウイルスペレットを中速で2分間ボルテックスして再懸濁します。次に、超遠心チューブを摂氏4度で1時間または一晩揺さぶります。

インキュベーション後、ウイルス懸濁液を微量遠心チューブに移し、ウイルスの力価測定に進みます。力価測定手順を開始するには、12ウェル組織培養プレートに装着したDF1細胞が30%のコンフルエント度に達していることを確認します。各ウイルス力価測定には、1つの12ウェルプレートが必要です。

まず、5マイクロリットルのウイルス上清と495マイクロリットルの成長培地をマイクロ遠心チューブ内で混合し、10〜2回目の希釈を行うことにより、ウイルス上清の10倍段階希釈を開始します。数秒間、渦巻きます。次いで、10から第2希釈までの40マイクロリットルを、マイクロ遠心チューブ内の成長培地360マイクロリットルに10から第3希釈に移す。

数秒間、渦巻きます。このプロセスを続行して、10から4番目、10から5に希釈します。次に、2.25ミリリットルの成長培地を5本の6ミリリットルポリスチレンチューブのそれぞれに分注します。

そして、それぞれ10から6番目、10から7番目、10から8番目、10から9番目、10から10とラベルを付けます。10〜5希釈の0.25ミリリットルを、6ミリリットルのポリスチレンチューブで2.25ミリリットルの成長培地と10〜6希釈に混合します。数秒間、渦

10から7、10から8、10から9、10から10の希釈について手順を繰り返します。次に、12ウェルプレート上のDF1細胞から元の培地を取り出します。そして、希釈したウイルスを1ミリリットルずつ各ウェルに二重に加えます。

細胞を摂氏37度と5CO2で少なくとも7日間成長させます。まず、7週齢のRIP-Tag RIP-tvaマウスに麻酔をかけることから感染手順を開始します。角膜の乾燥を防ぐために、両目にアイローションを塗ります。

RIP-Tag RIP-tva マウスの胸腔から毛を剃り、マウスを仰向けにして、胸を上にして、ぴったりとフィットする安全なウォーマーの上にある吸収性ラボ ベンチ ペーパーの上に置きます。つま先をつまんで、動物が反応しないかどうかを確認し、完全な麻酔効果を確認します。前肢を伸ばし、テープで固定します。

注射のためにマウスの胸部に印を付けます。胸骨のノッチと剣状突起の上部の中間、および胸骨の解剖学的にわずかに左の位置をマークします。次に、ポビドンヨードスクラブまたはクロルヘキシジンスクラブのいずれかで胸壁の前壁をこすり、続いて70%イソプロピルアルコールまたは70%エタノールに浸したガーゼスポンジでこすります。

滅菌済みの28.5ゲージインスリン注射器に50マイクロリットルの空気を吸い込み、プランジャーと500マイクロリットル注射器の半月板の間にスペースを作ります。100マイクロリットルのウイルスを描きます。壁に液体がない空域は、心臓の脈拍を見るために重要です。

針を直立させ、片手でマウスの皮膚をぴんと張ったまま保持し、針をマークされた位置に挿入します。注射器に真っ赤な血液のパルスが現れたら、針の前進を止め、片手でマウスに針の深さを固定します。もう一方の手でプランジャーを慎重にゆっくりと押して、ウイルス懸濁液を約60秒かけて送達します。

注射器に真っ赤な血液のパルスが現れるたびに、10〜20マイクロリットルを送達します。透明な針ハブに赤い酸素化された血液が連続的に入ってくることは、針が左心室に適切に配置されていることを示しています。ウイルス懸濁液を届けるために略奪を最後に押した後、次の赤い血液のパルスを見る前に、針を胸腔からすばやく引っ込めます。

出血を減らすために、注射部位に少なくとも1分間穏やかな圧力をかけます。.次に、マウスを加熱パッドまたはヒートランプの下に慎重に移動させますamp完全に意識するまで。RIP-Tag RIP-tva マウスを、7週齢で示されたRCASBP-Bcl-xLレトロウイルスに感染させ、16週齢で安楽死させた。

この写真は、膵リンパ節の転移性膵神経内分泌腫瘍の代表的なシナプトフィジン染色を示しています。ここで、RIP-Tag RIP-tva マウスを示された RCASBP-RHAM B.THIS 写真は、膵臓リンパ節の転移性膵神経内分泌腫瘍の代表的なシナプトフィジン染色を示しています。ここでは、RCASBP-RHAMM Bウイルスの注射後に肝臓にシナプトフィジンの染色が見られます。

これは、RIP-Tag RIP-tvaマウスとRCASBPレトロウイルスレクターで増殖するTVA細胞の生体内感染には、1ミリリットルあたり10から8の感染単位を超えるタイトルを覚えておくことが重要です最大2.5キロベースまでCDNAを送達することができます。このマウスモデルの開発後、BCL-xLが抗アポトーシス機能とは無関係に実際にがんの転移を促進するというパラダイムシフトの発見への道を開きました。