ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析
2017年11月5日
島の試金は比較的新しい、コスト効果の高いアッセイキイロショウジョウバエの基本的な運動動作を評価するために使用できます。本稿では、自動データ処理と島のアッセイのデータ、このアッセイの大きな遺伝的または薬理学的画面の高感度、高速読み出しの客観的定量化のためのアルゴリズムについて説明します。
Island Assayの全体的な目標は、自動データ処理と客観的定量化により、Drosophila melanogasterの基本的な運動行動を評価することです。この方法は、運動障害に関与する遺伝子など、自発運動行動の主要な調節因子を特定するために使用できます。このような欠陥を元に戻す可能性のある薬物の試験に使用できます。
この手法の主な利点は、ショウジョウバエの自発運動行動をハイスループットで定量化できるため、この手法は大規模なスクリーニングに適していることです。私たちは、多数の疾患モデルを解析できるように、この方法論を開発することにしました。これを実現するためには、自動化された画像データ分析が必要でした。
この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に役立ちます。ベータ処理のいくつかのステップは非常に重要であり、新規ユーザー、特に使用中のソフトウェアパッケージに慣れていないユーザーにとっては難しい場合があります。まず、生物学的複製として実験条件ごとに最低3つのバイアルを準備します。
各ファイルには、同じ性別で年齢が近い約 15 匹のハエが含まれている必要があります。重要なのは、ハエは無傷の翼を持っていなければならないということです。実験を保存するフォルダーを作成します。
これらは、条件とレプリケートによって定義されたディレクトリ構造に生成します。たとえば、実験に 2 つの遺伝子型があり、それぞれに 5 回の反復がある場合は、実験の日付を含むメインフォルダーを作成し、そのフォルダー内に遺伝子型ごとに 1 つのサブフォルダーを作成します。次に、遺伝子型フォルダー内に、各レプリケートのサブフォルダーを作成します。
次に、テスト装置をセットアップします。少量の石鹸を入れた冷水をバストレイに加え、プラットフォームをバスの中央に配置します(まだバスに固定されていない場合は)。トレイとプラットフォームを透明なボックスで覆います。
プラットフォームを照らすには、通常の12ボルトLEDなどの冷却ランプをその上に配置します。また、Webカメラをコンピューターに接続してプラットフォームの真上に配置します。パソコンで、画像記録ソフトウェアを開きます。
メニューシステムから、キャプチャデバイスとして適切なWebカメラを選択します。島にデッドフライを置いて、ビデオ設定を調整します。ソフトウェアの明るさ、コントラスト、色を微調整して、死んだハエが白い背景に対して黒く見えるようにします。
次に、タイムラプスムービーの設定を調整して、ムービーをAVIファイルとして保存します。次に、データを保存するディレクトリを参照し、ムービーの名前を定義します。これらの変更を保存します。
画像データの圧縮には、Intel IYUV コードを選択します。録画速度を0.1秒ごとに1フレームに設定し、対応する再生速度を1秒あたり10枚に調整します。最後に、詳細設定に移動し、キャプチャしたフレームごとにbmp画像を作成するを選択します。
次に、AVIファイルのホストとして選択したのと同じディレクトリを参照し、[OK]を押します。始める前に、島が空できれいであることを確認してください。次に、画像記録ソフトウェアのタイムラプス画像インターフェースで録画を開始します。
ハエの入ったバイアルを取り、2〜3回軽くたたいて、すべてのハエを底にノックダウンします。次に、バイアルからプラグをすばやく取り外し、フライをプラットフォームに強くたたきます。それらはすべてほぼ同時にプラットフォームにぶつかるはずです。
フライがプラットフォームを離れるまで最大30秒待ってから、録音を停止します。必要に応じて、プラットフォームから残っているハエを手動で取り除きます。次の実験に進む前に、次のデータ セットを格納するディレクトリを必ず再定義してください。
最初のタスクは、収集された画像シリーズのスタックと投影を生成することです。フィジーで、Drosophila Island Assayを開きます。新しいウィンドウで、最初の画像時系列識別子を入力します。
次に、スタックと投影の作成サブマクロのみを選択します。[OK]をクリックし、個々のIsland Assay実験を含むすべてのサブフォルダを含むフォルダにコンピュータを移動します。データの処理後、2つの新しいファイルが個々の実験サブフォルダに表示されます。
次のタスクは、画像内のプラットフォームの正確な位置を定義することです。グラフィカルインターフェイスを開き、[Define platform] チェックボックスをオンにします。次に、実験的なサブフォルダが保存されているディレクトリを選択します。
投影画像と2つのウィンドウが開きます。最初の画像では、ポリゴン選択ツールを使用して、島のプラットフォーム上にポリゴンを描画します。この選択には、プラットフォームのパラメータにある境界線を含めないでください。
ROI マネージャー ウィンドウで [追加] をクリックして、選択内容を [ROI マネージャー] ウィンドウに追加します。ROI マネージャーに選択を追加すると、一連の値として表示されます。次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックします。
ソフトウェアは、フォルダに保存されている次の投影画像に進みます。ROI マネージャーに保存されている ROI を選択し、プラットフォームの定義ウィンドウでこの ROI を確認して、プラットフォームの同じ ROI を次の投影画像に引き続き適用します。次の投影画像に進む前に、実験中にプラットフォームが動かなかったことを確認してください。
プラットフォームの位置が移動した場合は、選択範囲の中央を左クリックし、必要な位置にドラッグします。選択ボックスがプラットフォームと一致しない場合は、選択の外側を左クリックし、ポリゴン ツールを使用してプラットフォームの新しい選択を描きます。この新しい選択を ROI マネージャーに追加します。
次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックして新しい選択を確認し、すべてのイメージがプラットフォームを適切に定義するまで手順を続けます。データを処理する前の最後のタスクは、フライの最小サイズを定義することです。これはテキストプロトコルで説明されています。
プラットフォームから逃げるハエを定量化するには、まず、最小のフライサイズを設定します。次に、実験シリーズ内のファイル内のハエの最大数を示します。analyze 関数を開始し、プロンプトで実験のメインディレクトリを選択します。
マクロの実行後、新しい結果ファイルと新しいイメージ スタックが各フォルダに表示されることに注意してください。これらのファイルを開いて、手順が正しく機能していることを確認します。RまたはRStudioソフトウェアパッケージを起動し、Island Assay分析スクリプトを開いて、すべての実験を同時に処理します。
解析を成功させるには、スクリプトを正しく編集する必要があります。スクリプトの 16 行目に、分析する実験を含むメイン ディレクトリへのパスを挿入します。解析出力ファイルを保存するフォルダーへのパスを 19 行目に挿入します。
後者は、解析する画像データを含むディレクトリとは異なる場所である必要があります。次に、ツールバーからスクリプトを実行し、結果の分析を続行します。スクリプトIsland Assay analysisは、各実験条件の折れ線グラフをエクスポートします。
グラフは、その条件の複製ごとに、時間の経過とともにプラットフォームに残っているハエの割合を示しています。エクスポートされた折れ線グラフ escape response:all conditions は、メイン フォルダーに存在する最初の 12 の実験条件の平均飛行脱出応答の平均誤差と標準誤差をまとめたものです。各実験反復の曲線下面積は、実験条件が互いに有意に異なるかどうかを判断するために計算されます。
各実験条件の曲線下面積と中央値はグラフとしてエクスポートされます。メイン フォルダに存在する条件の数に応じて、スクリプトは 2 つの条件に対して両側の不対応 Welch T 検定を実行するか、2 つ以上の条件に対して 2 つのキー補正を持つ分散分析を実行します。スクリプトIsland Assay解析によって計算されたすべての数値データもエクスポートされ、データ出力フォルダにcsvまたはtxtファイルとして保存されます。
毛細血管拡張性運動失調症は、ATM遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性運動障害です。この疾患は、小脳性運動失調の早期発症を特徴としています。ATMのハエオルソログをユビキタスにノックダウンする効果をIsland Assayで調べ、対照と比較しました。
全体として、ハエATMオルソログであるTefuのユビキタスノックダウンは、遺伝的バックグラウンドコントロールと比較して、Island Assayの自発運動能力を有意に低下させました。記録されたIsland Assayデータの手動分析では、自動分析と同じ結果が得られました。このビデオを見れば、Island Assayの実行方法、Drosophila Island Assayマクロの実行方法、Island Assay分析スクリプトの操作方法について十分に理解できるはずです。
このプロトコルを試行する際には、画像セグメンテーションの品質が映画の品質と相関していることを覚えておくことが重要です。コントラストが優れているほど、分析は滑らかになります。開発後、この技術は、研究者がショウジョウバエの運動能力をハイスループットで探求する道を開きます。
このアッセイを使用した後、ジオタクシスが陰性であることを示すアッセイなど、他のアッセイを使用して、自発運動障害をさらに調査することができます。
概要
アイランドアッセイ（Island Assay）は、自動データ処理を通じてキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の運動行動を評価するための新しい手法です。この技術により、遺伝学的および薬理学的研究におけるハイスループットスクリーニングが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 行動解析
- 遺伝的スクリーニング
背景
- アイランドアッセイは、ショウジョウバエにおける基本的な運動能力を評価します。
- これにより、運動障害の主要な調節因子を特定します。
- 本手法は、疾患モデルの大規模スクリーニングを可能にします。
- 自動画像解析により、データ処理の効率が向上します。
研究目的
- 自発運動解析のためのハイスループットアッセイを開発すること。
- 運動に影響を与える遺伝的因子の同定を容易にすること。
- 運動機能不全を改善させる可能性のある薬理学的薬剤を試験すること。
使用した手法
- 生物学的レプリケートを用いた実験条件の準備。
- 適切な照明とカメラを備えた記録装置のセットアップ。
- 専用ソフトウェアを用いた画像キャプチャおよび処理の自動化。
- 定義されたパラメータに基づくショウジョウバエの行動の定量化。
主な結果
- 運動能解析のためのアイランドアッセイの導入成功。
- 大規模な遺伝学的スクリーニングに向けた定量化可能なデータの生成。
- 運動障害に対する潜在的な候補薬の同定。
- 今後の研究に向けた再現性のある手法の確立。
結論
- アイランドアッセイは、運動行動を研究するための信頼性の高い枠組みを提供します。
- 自動処理により、データ収集の効率が向上します。
- この手法は、ハイスループットな遺伝学的および薬理学的スクリーニングに適しています。
よくある質問
業界への実用的関連性
アイランドアッセイ（Island Assay）は、ショウジョウバエ（Drosophila）の運動行動の高スループットかつ自動的な定量化を可能にし、運動障害のターゲット検証における重大なボトルネックを解消します。手動によるビデオ解析を客観的で再現性のあるデータ出力に変換することで、運動機能の遺伝学的および薬理学的モジュレーターのスケール可能なスクリーニングをサポートします。これにより、本アッセイは神経学における初期段階の創薬プログラムのリスクを低減するための、メカニズム的に有益で費用対効果の高いツールとして位置づけられます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 遺伝子ノックダウンまたは薬剤処理の影響に対する機能的リードアウトとして、運動逃避反応を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： 遺伝的条件におけるショウジョウバエの行動を自動的かつ客観的に測定することで、生物学的リスクの低減を支援し、表現型スクリーニングにおける観察者のバイアスを減少させる。
- 予測的価値： 曲線下面積（AUC）および逃避反応の中央値などの指標を算出することで、比較分析を容易にし、有意な運動表現型を示す標的の優先順位付けを促進する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 科学的価値： 標準化された時間分解ロコモーターデータを生成し、運動障害修飾因子の大規模スクリーニングにおける信頼性の高い化合物評価を可能にする。
- 運用の価値： 自動画像処理パイプライン（FijiおよびR）を介してアッセイの再現性を確保し、反復試行や実験バッチ間の技術的ばらつきを最小限に抑える。
- 拡張性： 低コストなセットアップ（ウェブカメラ、LED照明）とオープンソースソフトウェアとの互換性により、ハイスループットワークフローに対応しており、幅広い研究室への導入が可能である。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 翻訳的連続性： 保存された運動表現型を通じて、ショウジョウバエの遺伝子モデル（例：ATMオーソログのノックダウン）をヒトの運動障害メカニズムへと結びつけます。
- メカニズムのデリスキング： 定量的な行動リードアウトを提供することで、一般的な運動機能低下と、特定の協調不全や持久力低下を区別することが可能となり、ターゲットへの信頼性を向上させます。
- 前臨床段階での整合性： 薬理剤の用量反応およびタイムコース解析をサポートし、疾患関連システムにおける早期の有効性評価を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
アイランドアッセイは、ターゲット仮説の検証からリード化合物の特定に至る創薬のコンティニュアムに適合し、神経科学プログラムにおける遺伝学的スクリーニングとメカニズム解析のフォローアップを繋ぐ行動表現型解析のブリッジを提供します。
- 探索生物学：遺伝的摂動（例：ATMノックダウン）を定量可能な運動機能欠損に結びつけることで、パスウェイの解明やターゲットのバリデーションをサポートし、仮説に基づいたターゲット解析を可能にします。
- スクリーニング：フライプラットフォームからの脱出時間を自動定量することでアッセイの即時性を高め、化合物ライブラリースクリーニングに適した用量および時間依存的な表現型リードアウトを生成します。
- アナリティクス：曲線下面積（AUC）および中央値を統計出力（Welchのt検定またはANOVA）とともにエクスポートし、条件間の比較やスクリーニングキャンペーンにおけるヒット化合物の選定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ヒト小脳失調症のDrosophilaモデルにおいて保存された運動機能欠損を実証することで、疾患モデルにおける表現型スクリーニングと整合させ、メカニズムの連続性を裏付けます。
- エンタープライズ再利用：再バリデーションすることなく、複数のターゲット、遺伝子型、および化合物スクリーニングに適用可能な、再利用可能な標準化された運動能力評価プラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：客観的な高解像度の行動定量化によりメカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用上の価値：データ処理の自動化により、再現性と拡張性を高め、大規模スクリーニングにおける手作業の負担とユーザー間のばらつきを最小限に抑える。
- 戦略的価値：神経治療薬開発における後期の失敗リスクを低減させる早期の定量的な表現型データを提供し、go/no-go判断の効率を改善する。
- ポートフォリオへの影響：統計的に堅牢な運動反応データに基づいたターゲットおよび化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にし、創薬ポートフォリオにおける資本効率を向上させる。
実施上の考慮事項
- マクロの実行およびスクリプトベースの解析を行うため、FijiおよびR/RStudioに精通している必要があり、基礎的なバイオインフォマティクスまたは画像解析のトレーニングが求められます。
- 正確なハエのセグメンテーションと実験間での信頼性の高い定量化を確保するため、一定の撮像条件（照明、コントラスト、プラットフォームの安定性）に依存します。
- 生物学的なばらつきを最小限に抑え、アッセイの再現性を確保するために、標準化されたハエの準備（完全な翅、年齢、性別、密度）が必要です。
- バッチ間でのデータの整合性を維持するために、厳格に適用されなければならない手動の設定ステップ（プラットフォームROIの定義、最小ハエサイズしきい値）が含まれます。
- 2次元平面上の行動解析に限定されており、垂直飛行や複雑な運動シーケンスは捕捉できないため、完全な行動プロファイリングには補完的なアッセイが必要です。
