ショウジョウバエ島アッセイにおける歩行行動の高スループット解析

Island Assayの全体的な目標は、自動データ処理と客観的定量化により、Drosophila melanogasterの基本的な運動行動を評価することです。この方法は、運動障害に関与する遺伝子など、自発運動行動の主要な調節因子を特定するために使用できます。このような欠陥を元に戻す可能性のある薬物の試験に使用できます。

この手法の主な利点は、ショウジョウバエの自発運動行動をハイスループットで定量化できるため、この手法は大規模なスクリーニングに適していることです。私たちは、多数の疾患モデルを解析できるように、この方法論を開発することにしました。これを実現するためには、自動化された画像データ分析が必要でした。

この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に役立ちます。ベータ処理のいくつかのステップは非常に重要であり、新規ユーザー、特に使用中のソフトウェアパッケージに慣れていないユーザーにとっては難しい場合があります。まず、生物学的複製として実験条件ごとに最低3つのバイアルを準備します。

各ファイルには、同じ性別で年齢が近い約 15 匹のハエが含まれている必要があります。重要なのは、ハエは無傷の翼を持っていなければならないということです。実験を保存するフォルダーを作成します。

これらは、条件とレプリケートによって定義されたディレクトリ構造に生成します。たとえば、実験に 2 つの遺伝子型があり、それぞれに 5 回の反復がある場合は、実験の日付を含むメインフォルダーを作成し、そのフォルダー内に遺伝子型ごとに 1 つのサブフォルダーを作成します。次に、遺伝子型フォルダー内に、各レプリケートのサブフォルダーを作成します。

次に、テスト装置をセットアップします。少量の石鹸を入れた冷水をバストレイに加え、プラットフォームをバスの中央に配置します(まだバスに固定されていない場合は)。トレイとプラットフォームを透明なボックスで覆います。

プラットフォームを照らすには、通常の12ボルトLEDなどの冷却ランプをその上に配置します。また、Webカメラをコンピューターに接続してプラットフォームの真上に配置します。パソコンで、画像記録ソフトウェアを開きます。

メニューシステムから、キャプチャデバイスとして適切なWebカメラを選択します。島にデッドフライを置いて、ビデオ設定を調整します。ソフトウェアの明るさ、コントラスト、色を微調整して、死んだハエが白い背景に対して黒く見えるようにします。

次に、タイムラプスムービーの設定を調整して、ムービーをAVIファイルとして保存します。次に、データを保存するディレクトリを参照し、ムービーの名前を定義します。これらの変更を保存します。

画像データの圧縮には、Intel IYUV コードを選択します。録画速度を0.1秒ごとに1フレームに設定し、対応する再生速度を1秒あたり10枚に調整します。最後に、詳細設定に移動し、キャプチャしたフレームごとにbmp画像を作成するを選択します。

次に、AVIファイルのホストとして選択したのと同じディレクトリを参照し、[OK]を押します。始める前に、島が空できれいであることを確認してください。次に、画像記録ソフトウェアのタイムラプス画像インターフェースで録画を開始します。

ハエの入ったバイアルを取り、2〜3回軽くたたいて、すべてのハエを底にノックダウンします。次に、バイアルからプラグをすばやく取り外し、フライをプラットフォームに強くたたきます。それらはすべてほぼ同時にプラットフォームにぶつかるはずです。

フライがプラットフォームを離れるまで最大30秒待ってから、録音を停止します。必要に応じて、プラットフォームから残っているハエを手動で取り除きます。次の実験に進む前に、次のデータ セットを格納するディレクトリを必ず再定義してください。

最初のタスクは、収集された画像シリーズのスタックと投影を生成することです。フィジーで、Drosophila Island Assayを開きます。新しいウィンドウで、最初の画像時系列識別子を入力します。

次に、スタックと投影の作成サブマクロのみを選択します。[OK]をクリックし、個々のIsland Assay実験を含むすべてのサブフォルダを含むフォルダにコンピュータを移動します。データの処理後、2つの新しいファイルが個々の実験サブフォルダに表示されます。

次のタスクは、画像内のプラットフォームの正確な位置を定義することです。グラフィカルインターフェイスを開き、[Define platform] チェックボックスをオンにします。次に、実験的なサブフォルダが保存されているディレクトリを選択します。

投影画像と2つのウィンドウが開きます。最初の画像では、ポリゴン選択ツールを使用して、島のプラットフォーム上にポリゴンを描画します。この選択には、プラットフォームのパラメータにある境界線を含めないでください。

ROI マネージャー ウィンドウで [追加] をクリックして、選択内容を [ROI マネージャー] ウィンドウに追加します。ROI マネージャーに選択を追加すると、一連の値として表示されます。次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックします。

ソフトウェアは、フォルダに保存されている次の投影画像に進みます。ROI マネージャーに保存されている ROI を選択し、プラットフォームの定義ウィンドウでこの ROI を確認して、プラットフォームの同じ ROI を次の投影画像に引き続き適用します。次の投影画像に進む前に、実験中にプラットフォームが動かなかったことを確認してください。

プラットフォームの位置が移動した場合は、選択範囲の中央を左クリックし、必要な位置にドラッグします。選択ボックスがプラットフォームと一致しない場合は、選択の外側を左クリックし、ポリゴン ツールを使用してプラットフォームの新しい選択を描きます。この新しい選択を ROI マネージャーに追加します。

次に、プラットフォームの定義ウィンドウで「OK」をクリックして新しい選択を確認し、すべてのイメージがプラットフォームを適切に定義するまで手順を続けます。データを処理する前の最後のタスクは、フライの最小サイズを定義することです。これはテキストプロトコルで説明されています。

プラットフォームから逃げるハエを定量化するには、まず、最小のフライサイズを設定します。次に、実験シリーズ内のファイル内のハエの最大数を示します。analyze 関数を開始し、プロンプトで実験のメインディレクトリを選択します。

マクロの実行後、新しい結果ファイルと新しいイメージ スタックが各フォルダに表示されることに注意してください。これらのファイルを開いて、手順が正しく機能していることを確認します。RまたはRStudioソフトウェアパッケージを起動し、Island Assay分析スクリプトを開いて、すべての実験を同時に処理します。

解析を成功させるには、スクリプトを正しく編集する必要があります。スクリプトの 16 行目に、分析する実験を含むメイン ディレクトリへのパスを挿入します。解析出力ファイルを保存するフォルダーへのパスを 19 行目に挿入します。

後者は、解析する画像データを含むディレクトリとは異なる場所である必要があります。次に、ツールバーからスクリプトを実行し、結果の分析を続行します。スクリプトIsland Assay analysisは、各実験条件の折れ線グラフをエクスポートします。

グラフは、その条件の複製ごとに、時間の経過とともにプラットフォームに残っているハエの割合を示しています。エクスポートされた折れ線グラフ escape response:all conditions は、メイン フォルダーに存在する最初の 12 の実験条件の平均飛行脱出応答の平均誤差と標準誤差をまとめたものです。各実験反復の曲線下面積は、実験条件が互いに有意に異なるかどうかを判断するために計算されます。

各実験条件の曲線下面積と中央値はグラフとしてエクスポートされます。メイン フォルダに存在する条件の数に応じて、スクリプトは 2 つの条件に対して両側の不対応 Welch T 検定を実行するか、2 つ以上の条件に対して 2 つのキー補正を持つ分散分析を実行します。スクリプトIsland Assay解析によって計算されたすべての数値データもエクスポートされ、データ出力フォルダにcsvまたはtxtファイルとして保存されます。

毛細血管拡張性運動失調症は、ATM遺伝子の突然変異によって引き起こされる常染色体劣性運動障害です。この疾患は、小脳性運動失調の早期発症を特徴としています。ATMのハエオルソログをユビキタスにノックダウンする効果をIsland Assayで調べ、対照と比較しました。

全体として、ハエATMオルソログであるTefuのユビキタスノックダウンは、遺伝的バックグラウンドコントロールと比較して、Island Assayの自発運動能力を有意に低下させました。記録されたIsland Assayデータの手動分析では、自動分析と同じ結果が得られました。このビデオを見れば、Island Assayの実行方法、Drosophila Island Assayマクロの実行方法、Island Assay分析スクリプトの操作方法について十分に理解できるはずです。

このプロトコルを試行する際には、画像セグメンテーションの品質が映画の品質と相関していることを覚えておくことが重要です。コントラストが優れているほど、分析は滑らかになります。開発後、この技術は、研究者がショウジョウバエの運動能力をハイスループットで探求する道を開きます。

このアッセイを使用した後、ジオタクシスが陰性であることを示すアッセイなど、他のアッセイを使用して、自発運動障害をさらに調査することができます。