Name: 超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ超高解像度光コヒーレンストモグラフィーを用いたマウス網膜下腔遺伝子治療導入法。リアルタイム可視化と最小侵襲性により、ベクター送達効率と光受容体生存性を定量的に評価する技術です。

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この素材は、一部部門のベテラン出来事 (VA)、退役軍人健康庁、室の研究と開発 (生物医学研究および開発) によってサポートされる作業に基づいて (VA メリット助成金 1I01BX000669)。JMS に採用されての一部としてスタッフ医師・科学者、眼科、VA WNY;一部では、VA WNY に MCB を採用します。研究は、行われ、退役軍人管理ウエスタン ニューヨーク医療システム (ニューヨーク州バッファロー) によって一部にはサポートします。内容は、退役軍人局やアメリカ合衆国政府の見解を表していません。サポートも主要な部分は、NIH/ネイ R01 で付与 EY013433 (PI: JMS)、NIH/ネイ R24 付与 EY016662 (UB ビジョン インフラ センター、PI: M 虐殺、ディレクター-バイオフォトニクス モジュール: JMS)、無制限で与えるに部の眼科/大学で防ぐため失明 (ニューヨーク、ニューヨーク) に研究からバッファローと Oishei 財団 (ニューヨーク州バッファロー) からの助成金。我々 博士ジャニス ・ レム (タフツ ニュー イングランド医療センター, ボストン、マサチューセッツ) からローノックアウト、ヘテロ接合の状態で NHR E 遺伝子モデルのギフトには hC1 トランスジェニックローP347Sラインとエクソン 1 マウスのギフトを認める、マウス エクソン 2 RHOノックアウト背景夫妻 G. ジェーン ・ ファラーとピーター ・ ハンフリーズ (トリニティ ・ カレッジ、ダブリン、IRE) から。

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<li>Berger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+domain+optical+coherence+tomography+of+the+rodent+eye%3A+highlighting+layers+of+the+outer+retina+using+signal+averaging+and+comparison+with+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Spectral domain optical coherence tomography of the rodent eye: highlighting layers of the outer retina using signal averaging and comparison with histology.</a> PLoS One. 9 (5), 96494(2014).</li>
<li>Dysli, C., Enzmann, V., Sznitman, R., Zinkernagel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+mouse+retinal+layers+using+automated+segmentation+of+spectral+domain+optical+coherence+tomography+images%5BTitle%5D)+AND+%22TVST%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of mouse retinal layers using automated segmentation of spectral domain optical coherence tomography images.</a> TVST. 4 (4), 9(2015).</li>
<li>Bhootada, Y., Choudhury, S., Gully, C., Gorbatyuk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+caspase-12+to+preserve+vision+in+mice+with+inherited+retinal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Targeting caspase-12 to preserve vision in mice with inherited retinal degeneration.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 56, 4725-4733 (2015).</li>
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<li>Muhlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+technique+for+subretinal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized technique for subretinal injections in mice.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, NJ. (2013).</li>
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<li>Yan, Q. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-corneal+subretinal+injection+in+mice+and+its+effect+on+the+function+and+morphology+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Trans-corneal subretinal injection in mice and its effect on the function and morphology of the retina.</a> PLoS One. 10 (8), 0136523(2015).</li>
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<li>Ferguson, L. R., Grover, S., Dominguez, J. M., Balaiya, S., Chalam, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+thickness+measurement+obtained+with+spectral+domain+optical+coherence+tomography+assisted+optical+biopsy+accurately+correlates+with+ex+vivo+histology%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Retinal thickness measurement obtained with spectral domain optical coherence tomography assisted optical biopsy accurately correlates with ex vivo histology.</a> PLoS One. 9 (10), 111203(2014).</li>
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<li>Sullivan, J. M., Yau, E. H., Taggart, R. T., Butler, M. C., Kolniak, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottlenecks+in+development+of+therapeutic+post-transcriptional+gene+silencing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Bottlenecks in development of therapeutic post-transcriptional gene silencing agents.</a> Vision Res. 48, 453-469 (2008).</li>
</ol>

商業の関係: MCB: 何もない;JMS: どれも。イメージング システム (RIS)23本研究で使用される網膜は、実質的な使用マウス、齧歯動物、小動物の遺伝子療法配信研究を実施しようとすると、任意のグループへの新規デバイスです。著者には、この時点でこのデバイスに関して宣言する競合がない、SUNY バッファロー - と復員軍人援護局の大学は知的財産権があるし、将来的にこの楽器を実用化することを求めます。

HR-SD-10 月は、潜在的な治療のテストでその有用性を決定する人間の病気の動物モデルの潜在的な特性のための簡単な方法を提供します。迅速かつ確実に人間の病気の動物モデルすることができる (例えば、代替遺伝子治療、リボザイムや shRNA ノックダウン遺伝子療法、複合遺伝子治療) の治療薬探索プロセスに不可欠です。HR-SD-10 月は、網膜の健康を特徴付けるし、ほぼすべてのマウス モデルの網膜変性の進行をモニターするための評価のシンプル、迅速、かつ非侵襲的なメソッドを提供します。OCT 画像を使用して変性が時間をかけて外網膜 (視細胞) 変性症の詳細な評価や治療の救助試みの影響あります網膜の異なるレイヤーの一部またはすべての測定を取得できます。範囲またはキネティック タイムライン。HR-SD-10 月は配信されたベクターまたは材料の毒性を評価するために使用もできます。視細胞変性網膜研究プログラムによる最も大きな影響は、生きた動物で時間をかけて ONL の洗練された測定を行う能力です。1 つは、治療機会の時間ウィンドウの上効果と同じモデルで候補者治療の毒性を評価するための重要な第一歩である時定数を抽出する網膜変性タイム...

人間の病気1,2,3,4の治療法治療薬に翻訳を期待して様々 な網膜と網膜変性疾患に対する遺伝子治療を開発している研究者,5,6,7,8,9,10,11. 時間領域またはスペクトル領域光干渉断層法 (SD-10 月) は、外側の網膜変性疾患12,13,14 の特定のマウス ・ モデルでの側面を調査する使用されています.HR-SD-10 月、しかし、されていない広範囲率と網膜変性の空間的一様性を決定するマウス モデルの評価を最適化するコンテキストで使用や遺伝子の前臨床評価のコンテキスト ベースなどの治療に救助、毒性、またはベクトル配信8,15,16の空間範囲を評価します。マウス モデルは完全に特徴と、一度 10 月 HR-SD データは救助や網膜変性17のマウス ・ モデルにおける毒性を発揮する治療薬の影響を測定する有益で信頼性の高いリソースとして使用できます。多くのグループは、その視細胞と網膜色素上皮 (RPE) 細胞の伝達効率のためベクトル配信の方法として網膜注入を使用しています。しかし、これはマスターに難しい方法のまま角膜表面から無料手の外科によって通常行われますそれは多くの場合白内障、出血、および単に後方の操作によって発生する意図しない網膜剥離に満ちていることを考える硝子体。多くのグループはまだ盲目的に網膜の注射を試みるし、比較的大径ステンレス針 (34 G)8,17,と18,19 手動の注射を使用してウイルスを提供 ,20,21,22、およびいくつかを使用して光干渉断層計 (OCT) 網膜8,17,にベクトルの適切な配信を確認するイメージング20,22。 メソッドにいくつかの改善に最近マイクロマニピュレーター22によって駆動されるマイクロ針を使用して記載されています。
針の位置で支援する統合的なアプローチを提案して注射は、特にマウス17,の小さな眼の中を可視化するラボで設計されたカスタム監督ステレオ検眼鏡によって促進されます。23. 固定装置用マイクロマニピュレーターと共に引っ張られたガラス マイクロ針の使用前に必要な (すなわち、白い部分結膜と結合組織を通じて) ダウンないメスを入れると針の配置のよりよい制御を提供します。インジェクション。圧力の使用規制マイクロ インジェクターにより配信一貫した注入量とはるかに大きい安定性、精度と比べると手持ちの注射器、減らすによって実行される手動の注射で注入を行うことができます、目に気泡注入が発生します。小さい針は、針撤退次のパスはセルフシール漏れを防ぐのに役立ちます。注入/配信の程度を評価するために多くの調査グループで検索と実験の終わりに網膜 (表現の構成要素がベクターで配信) で強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式の面積範囲を評価するのに頼る(安楽死) をポイントすると、成功した注射11,19,20,24を確認します。これは、アプローチは、(10 月を利用していない) (不明) の手術失敗ですべての動物がまで反復的な措置に続いて、維持する必要があるので手術の手続き時間と動物、廃棄物資源の膨大な量の手術の成功を確認するには安楽死と目収穫 (EGFP を測定) する場合。網膜の注入の場所の確認は、注射が網膜 (すなわち下腔) の正しい層の間に位置することを示すに HR SD-10 月を使用して改善できます。HR-SD-10 月は、すぐにアプローチを改良する実際の手術時間で関連する変数を識別する (外科的障害) の不成功な試みを記述する使用できます。我々 が見つかりました、HR SD-10 月臨床遺伝子の多数の利点療法研究によって提供外側の網膜変性症の急速な定量的評価実験条件 (を満たしていない研究動物の同定/殺処分を許可します。例えば、不適切な網膜注入)、ベクトルが配信されなかった地域をコントロールし同様、直接フォロー アップの観察 (臨床効果は最も可能性が高い) をベクトルが配信された目の領域にして。その開発以来 SD 10 月の使用を受け入れ、眼科研究者によって使用される続けています今マウスまたは齧歯動物モデル13,25で網膜の科学的研究で眼底イメージングの標準と考えられています。HR-SD-10 月とそのソフトウェア機能が動物モデルの選択、選択の変性の評価など、プロセスのあらゆる段階でマウス モデルで成功した量的遺伝子療法の目標を促進するためのユニークな統合された方法で活かされて疾患モデル、治療薬デリバリー、ベクトル配信、および毒性/有効性評価のマッピング。HR-SD-10 月より効率的な創薬プロセスのあらゆるレベルでの使用します。ここで私たちの RNA 創薬プログラムで使用されるこれらのアプローチについて述べる.

<table><tbody><tr><td>C57BL6 (J)</td><td>Jackson Laboratories</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>N129R-N</td><td>/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>2HRho 1T/1T</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Envisu R-2200 Ocular Coherence Tomography Instrument (OCT)</td><td>Bioptigen</td><td>90-R2200-U1-120.&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>網膜イメージングシステム(RIS)</td><td>社内</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000C Microscope</td><td>Zeiss</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown micropipette puller</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>p-97</td><td></td></tr><tr><td>MMN-33 micro maniexchanger&nbsp;</td><td>ナリシゲ USA</td><td>MMN-33</td><td></td></tr><tr><td>PLI-100&nbsp; マイクロインジェクター</td><td>ハーバード製装置</td><td>64-1736</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットホルダー(回転式)</td><td>社内</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット収納容器</td><td>ワールド・プレシジョンズ社</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;ホウケイ酸ガラス毛細管1.5-1.8 X 100mm、&nbsp;</td><td>ハーバード装置</td><td>30-0053</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-トリブロモエタノール</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>tert-amyl アルコール</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>240486-100ML</td><td></td></tr><tr><td>アトロピン硫酸アトロピン点眼液、USP 1%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-215-05</td><td></td></tr><tr><td>Goniovisc</td><td>BioVision Limited</td><td>NDC 17238-610-15</td><td></td></tr><tr><td>シクロペントラート塩酸塩点眼液、USP&nbsp; 2%</td><td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-097-10</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン硫酸軟膏 USP, 0.1%</td> <td>Perigo</td><td>NDC 45802-046-35</td><td></td></tr><tr><td>Systane Ultra</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9006619-1013</td><td></td></tr><tr><td>テトラカイン塩酸塩</td><td>BauschおよびLomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>点眼液、USP 0.5%</td><td>Bausch and Lomb</td><td>NDC 24208-920-64</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>ウイルス調製物</td><td>ViGene /UNC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>金ナノロッド</td><td>NANOPARTz</td><td>D12M-850-1.75</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン硫酸塩 AK-FLUOR 25%</td><td>アコーン社</td><td>NDC 17478-250-20</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-548-A</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ミルトン</td><td>18-825</td><td></td></tr><tr><td>針30ゲージ</td><td>ベクトンディッケンソン&nbsp;&nbsp;</td><td>W11604</td><td></td></tr><tr><td>ベ</td><td>クトン・ディッケンソン注射器&nbsp;&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Bioptigen software Package</td><td>Bioptigen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution, USP 0.5%,</td> <td>Akorn Inc.</td><td>NDC 17478-263-12</td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>マイクロソフト</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>メトラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>ワールド精密計器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>耳パンチ</td><td>ナット'lバンド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CL 100 光源</td><td>ウェルチ アリン</td><td>CL100</td><td></td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>ジャクソン 溶接供給</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>温水浴</td><td>ネスラブ</td><td>RTE-140</td><td></td></tr><tr><td>暖房プレート</td><td>家</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>暖房マット</td><td>シンシナッティ サブゼロ</td><td>273</td><td></td></tr><tr><td>クレイ マウスホルダー</td><td>Plast.i.clayアメリカン・アート・クレイ・カンパニー</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>MedLine&nbsp;</td><td>NDC53329-938-06</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>アメリカンヘルスサービス</td><td>Ctag</td><td></td></tr><tr><td>EtOH 70%</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818-100</td><td></td></tr><tr><td>手袋ニトリル</td><td>VWR</td><td>89038-272</td><td></td></tr><tr><td>Diagnosys ERGカラードーム機器</td><td>Diagnosys Inc.</td><td>D125</td><td></td></tr><tr><td>コンタクトレンズ</td><td>社内</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>診断ソフトウェア</td><td>診断(株)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.1ソフトウェア</td><td>OriginLab Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>参照電極</td><td>Ocuscience</td><td>Fスレッド電極 (DTL) 24インチ</td><td></td></tr></tbody></table>

超高解像度マウス光コヒーレンストモグラフィー網膜遺伝子治療研究における眼内注入を支援するために

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-10 月は、ライブ マウス モデルにおける視細胞変性の進行を監視、下腔への治療薬の配達を評価と毒性と効果体内を評価するために活用されています。HR-SD-10 月近赤外光 (800-880 nm) を使用して、具体的には光学系を持ってサブミクロン 2 軸の解像度を持つマウス眼のユニークな光学系のために設計されています。病気の進行を評価するために外側の網膜 (視細胞) 変性およびコントロールのトランスジェニック マウス モデルをイメージしました。引っ張られたガラスのニードルは、強膜とトランス脈絡膜アプローチ アデノ随伴ウイルス (aav ベクター) または経由でナノ粒子 (NP) のサブ網膜注射を提供する使用されました。下腔に針の注意位置決めがサブ網膜領域に液体を提供する校正された圧力注入前に必要でした。私たちの網膜イメージング システム (RIS) リアルタイム網膜手術を行った。HR-SD-10 月実証、有害変異人間変異型ロドプシン (P347S) 式のための進歩的な制服網膜変性マウス (RHOP347S) 遺伝子。HR-SD-10 月では、すべての網膜の層の厳密な定量化をことができます。感光体活力、変性、または救助と相関する核外層 (ONL) 厚さと視細胞外側セグメントの長さ (OSL) 測定。RIS 納品システムにより新生児に、網膜下注射のリアルタイム可視化 (~ P10 14) つまりアダルト マウス、および HR SD-10 月配信の成功を決定する地域範囲をマップし、すぐに。HR-SD-OCT は、光受容体の生体の活力を測定するさらにマウスの網膜の手術の成功を評価する強力なツールです。HR SD OCT は、網膜変性、毒性、および前臨床遺伝子治療研究で治療救助の程度を評価する制服動物コホートを識別するために使用もできます。

プレゼンス、率およびモデル外網膜変性の均一性の評価 ONL の計測は、計測器のソフトウェアで提供されるキャリパー ツールを使用して ONL の制限の定義、elm OPL から記録されました。目標は、部分的にヒト adRP マウス モデルの外側の網膜変性の進行をマップすることでした。制御 C57BL/6(J) マウスと hC1/hC1//mWT から同等の画像コントロールの眼底所見と深刻なの両方を展示する示されていた突然変異体人間のロッド (RHOP347S) のオプシン遺伝子の 2 つのコピーを表現する mWT マウス モデル/と急速進行性の網膜変性の条件です。3 週齢 adRP (BL/6(J)) 動物、人間・ ローP347S遺伝子の単一コピーのみと WT マウスRHO遺伝子の 2 つのコピーを持つ x hC1 が通常 ONL 厚近くあった。ただし、フォロー アップ HR SD OCT スキャン 10、37 週間実証一時的漸進的かつ空...

網膜への遺伝子治療薬の配達をお手伝いし、その地域の範囲を評価する視細胞活力を特徴付ける高分解能スペクトル領域光干渉断層法 (HR-SD-OCT) を使用してへの新しいアプローチを示します。

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

この皮下注射手順の全体的な目標は、リアルタイムで観察可能な最小限の侵襲的で再現可能な方法で、ベクターをレチナに送達することです。こんにちは、この方法は、ベクター送達効果および治療剤毒性に関する遺伝子治療研究における主要な質問に答えるために使用することができる。この技術のいくつかの利点は、レティナおよび他の眼構造への損傷の最小限、正確な注射部位のマッピング、および固体統計的推論を可能にする厳密な定量的インビボ測定を含む。眼内トランスジーン注射の場合、まず麻酔マウスを眼球イメージングシステム顕微鏡の観察段階に置き、鉗子を開いたり下に押しながら、無菌鈍い虹彩鉗子の先端を眼瞼の7時位置と10時位置に置いて優しくプロトシスを誘導する。鉗子を使用して眼球の下のまぶたを同化し、針の先端を角膜の縁の下に約1〜1.5ミリメートルに向けます。次に、無菌PBS溶液を目に塗布し、滅菌カバースリップで目を覆います。強膜うつ病が生み出されるまで、結膜を通して針を慎重に眼に打ち込みます。マイクロマニピュレータを使用して、強膜のうつ病が焦点になるまで目を上に回転させ、針を前方に動かして針の先端でレナに鋭いピークを作り出します。針ホルダーを使用して、針の先端が白膜とRPEを通して穴が開くまで針を回し、針の先端の小麦粉を網膜下腔および網膜色素上皮細胞単層のすぐ近傍の網膜組織の下に見えるようにする。針の先端を下方に駆動して地球に接するようにし、フットペダルスイッチで注入ポンプを作動させます。0.5~1マイクロリットルのトランスジーン溶液が皮下腔に送達された後、針を抜いて血液が安定しており、液体が注射路部位から漏れないことを確認します。注入の成功を確認するには、長方形のボリュームOCTを記録し、画像をさまざまな種類の潜在的な射出結果の画像と比較します。適切な射出配置を確認した後、その長方形のOCT画像を使用して、ブレブの範囲を眼科画像にマッピングします。副レチンブの範囲をマッピングするには、眼内の認識可能なランドマークが画像に含まれるように、ブレブの矩形体積OCT画像を開きます。必要に応じて、Bスキャンの左右のエッジの位置、視神経ヘッド(存在する場合はONH)、網膜がRPEと脈絡膜から切り離され、データを保存する変曲点を特定するために、必要に応じて多くのキャリパーを追加します。次に、保存されたファイルをコンパイルしてデータをプロットし、効果的にEN面OCT画像に注入ブレブのマップを作成します。射出部位を含む眼の画像にプロットされたデータをオーバーレイし、マージされた画像を保存します。このイメージを使用して、OCT のフォローアップイメージング中に対象領域を特定します。射出後の逆変性を評価するには、記録された高解像度スペクトルドメインOCTまたはHRSD OCT矩形ボリューム画像を開き、測定するBス

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JoVE Journal

Medicine

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