Name: マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶFACSを用いたマウス骨格筋からのI型およびII型ペリサイトの単離法。特定のトランスジェンを必要とせず、同時に2つのサブ集団を分離でき、血管生物学や再生医療の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、筋緊張性ジストロフィー基金（MDF-FF-2014-0013）の基金とアメリカ心臓協会（16SDG29320001）の科学者開発助成金によって部分的に支えられました。

野生型およびネスチン-GFPトランスジェニックマウスを、ミネソタ大学の動物施設に収容した。すべての実験手順は、ミネソタ大学の施設動物実験および使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のためのNIHガイドに従っていた。 1.筋肉解離と単細胞分離<ol><li>トリブロモエタノール（250mg / kg、腹腔内）で成体マウス（男性および女性の両方）を安楽死させ、腹部皮膚を70％エタノールで滅菌する。 注：ケタミンはNMDA受容体と相互作用することが知られているので、試験に影響を与える可能性があるため、ここではトリブロモエタノールを麻酔/安楽死のためにケタミンの代わりに使用した。 </li><li>マウスを仰臥位に置き、メスを使用して腹部の皮膚を水平に切開する。後ろの筋肉を露出させるために反対方向に引っ張って手で皮膚を剥がします。 </li><li>コレク鉗子とハサミを使用して両方の後肢から筋肉を取り除く。氷上で1％ペニシリン - ストレプトマイシン（P / S）を補充した滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）にそれらを保存する。 </li><li> 1％P / Sを補充した氷冷PBSで解剖した後肢筋肉を2回洗浄し、滅菌10cmプレートに移す。 </li><li>慎重に2倍の倍率で解剖顕微鏡下で鉗子とハサミを使用して、筋肉から神経、血管、および結合組織を切開する。 </li><li>滅菌はさみと刃を使用して細かく切って筋肉を小さな片（1〜2mm 3 ）に切ります。必要に応じて、少量のダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えて、筋肉が乾燥しないようにします。 </li><li>機械的に10mLの血清学的ピペットを10回上下にピペッティングすることにより組織を破壊する。 </li><li>新鮮な消化溶液（0.2％タイプ2コラゲナーゼを補充したDMEM）を混合物に加える。 gentlと37℃で2時間インキュベートする35回転/分で攪拌する。 </li><li>混合物を均質化するために18G針を用いて粉砕する。次に、500 xgで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを0.25％トリプシン/ EDTAに再懸濁する。 37℃で10分間インキュベートする。遠心分離を2回以上繰り返します。 </li><li> 20％ウシ胎児血清（FBS）を添加したDMEM 10mLを加え、500xgで5分間遠心する。上清を捨て、ペレットを赤血球溶解緩衝液（155mM NH 4 Cl、10mM KHCO 3および0.1mM EDTA）に再懸濁する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを選別バッファー（20mM HEPES、pH7.0; 1mM EDTA;およびCa / Mg 2+フリーPBS、pH7.0中の1％BSA）に再懸濁する。混合物を40μmセルストレーナに通して濾過して、単一細胞懸濁液を得る。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離する。上清を捨て、ペレットを1 mLの分取バッファーに再懸濁する。 </li><li>カウント血球計数器で細胞数を測定し、単一細胞懸濁液を選別緩衝液中で5×10 6 / mLに希釈する。 </li></ol> 2.細胞染色および選別<ol><li> 表1に記載されているようにコントロールとサンプルを準備する。 表1に記載されているように、氷上でそれぞれの抗体を含む単一細胞懸濁液を30分間染色する。 </li><li> 500xgで5分間遠心分離し、ペレットを選別バッファーで2回洗浄する。 </li><li>表1に示すように、DAPIを単一細胞溶液に添加する.DAPI単色対照については5μg/ mLのDAPI（最終濃度）を使用し、PDGFRβ-PE-FMO対照および試料については1μg/ mLのDAPIを使用する。実験を通して、すべてのチューブを氷上に保つ。 </li><li>ソーターとソフトウェアをオンにします。プロンプトが表示されたら、100μmのソーティングチップをスキャンして挿入します。 </li><li>自動セットアップ（ すなわち、チップアライメント、液滴較正、サイドストリーム較正、およびソート遅延較正自動セットアップビーズをロードすることにより、オンにすることができます。 </li><li>自動設定が完了したら、[テスト]タブの[新規作成]をクリックし、[パブリックテンプレート]から[空のテンプレート]を選択します。 </li><li> 「測定設定」で、「FL1」に「DAPI」、「FL2」に「Nestin-GFP」、「FL3」に「PDGFRβ」を入力します。「FL4」 - 「FL6」のチェックボックスをオフにします。 </li><li> 405、488、および561レーザーを有効にして[新しい実験を作成]をクリックすると、そのボックスにチェックマークが付いています。 </li><li> 「補正ウィザードの開始」オプションを選択し、補正ウィザードを実行して補正を設定するプロンプトに従います。 <ol><li>染色されていないコントロールを読み込み、「開始」をクリックします。 &quot;Detector＆Threshold Settings&quot;をクリックし、FSCおよびBSC検出器のセンサーゲインを調整して、人口をスケールに配置します。 </li><li>広告FL1-FL3蛍光チャネルのゲインレベルのみで、ヒストグラムの左側に陰性集団を配置する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>プロンプトが表示されたら、単色のコントロールを1つずつ読み込みます。 &quot;Start and Record&quot;をクリックしてデータを記録します。ヒストグラム上の陽性集団のゲートを調整する。 [次へ]をクリックします。 </li><li> [補正]タブの[計算マトリックス]に移動し、[補正設定の計算]パネルで[計算]をクリックして補正を実行します。 「終了」をクリックして、「補償ウィザード」を終了します。 </li></ol></li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールをロードし、 &quot;Start&quot;をクリックします。 「すべてのイベント」プロットの下で、関心のあるセルの周囲にポリゴンゲート（ゲートA）を描画します。 </li><li> Gate Aの内側をダブルクリックして、子プロットを作成します。 Y軸をDAPIに変更し、ライブ（DAPI 低 ）セルの周囲にポリゴンゲート（ゲートB）を描画します。 iをダブルクリック子のプロットを作成するにはGate Bの横にある。 X軸をFSC-Hに変更し、Y軸をFSC-Wに変更し、ダブルレットを除去するためにシングレットの周りにポリゴンゲート（ゲートC）を描画します。 </li><li>ゲートC内をダブルクリックして子プロットを作成します。 X軸をNestin-GFPに、Y軸をPDGFRβ-PEに変更する。 「記録」ボタンをクリックしてデータを記録します。 </li><li>サンプルをロードし、ステップ2.11-2.12を繰り返します。記録後、 &quot;Pause&quot;をクリックしてサンプルを保存します。 </li><li> PDGFRβ-PE-FMOコントロールに基づいて、PDGFRβ +およびNestin-GFP +細胞のゲーティング境界を定義する。 PDGFRβ +ネスチン-GFP -およびPDGFRβ +ネスチン-GFP +集団のためのゲートを描く。 </li><li> 「選別方法」で「2-way Tubes」を選択し、「PDGFRβ + Nestin-GFP - 」および「PDGFRβ + Nestin-GFP + 」細胞を左右の採取管に割り当て、明らかに。収集バッファーに充填した15 mLの収集チューブをコレクションステージにマウントし、 &quot;Load Collection&quot;ボタンをクリックします。 </li><li>サンプルを実行し続けるには、「Resume」ボタンをクリックしてください。 PDGFRβ +ネスチン-GFP - （タイプI周皮細胞）およびPDGFRβ +ネスチン-GFP + （タイプII周皮細胞）を収集するために、「ソート開始」をクリックしてください。 </li></ol> 3.ソート後の分析<ol><li>選別した細胞を500 xgで5分間遠心分離し、ペリサイトをペリサイト培地（ 材料表を参照）1 mLに再懸濁し、血球計数器を使用して細胞密度を数えます。 </li><li>約1×10 4細胞/ cm 2で、ポリ-D-リジン（PDL）被覆したカバースリップ上の種I型およびII型周皮細胞を接種する。 5％CO 2を含む37℃で3日間、周皮細胞で増殖させる。 </li><li> 3日目に、ペリサイト形態（位相差下）および内在性Nestin-GFP発現を蛍光マイクロ（励起レーザー：488nm、励起フィルター：470 / 40nm、発光フィルター：515 / 30nm）。 20倍の対物レンズ（0.45 NA）で画像を撮影します。 </li><li>以前に記載されているように、脂肪細胞培地を脂肪生成（マウスMSC基礎培地+脂肪生成刺激補助）および筋原性（DMEM + 2％ウマ血清）培地で置換して脂肪生成および筋原分化を開始する。 2〜3日ごとに培地を交換する。 </li><li>室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）中の17日目（脂肪生成/筋原性分化の14日後）に細胞を固定する。 注：注意、PFAは発癌物質です。 </li><li> 以前の刊行物19,20に記載されているように、ペリリピン（脂肪細胞マーカー）およびS-ミオシン（成熟筋管/筋線維マーカー）に対する免疫細胞化学を行う。 <ol><li>室温で10分間、固定した細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li>ブロッキング緩衝液（PBS5％ロバ血清、3％BSA、および0.3％Triton X-100を補充したもの）を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>細胞を抗ペリリピン（2μg/ mL）および/または抗S-ミオシン（2μg/ mL）抗体と共に4℃で一晩インキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>室温で1時間、Alexa 555ロバ抗ウサギ（4μg/ mL）および/またはAlexa555ロバ抗マウス（4μg/ mL）抗体と細胞をインキュベートする。 </li><li>室温で10分間、PBS中で細胞を3回洗浄する。 </li><li>免疫染色された細胞をDAPIを含むマウント培地でマウントします（材料の表を参照）。蛍光顕微鏡（励起レーザー：543nm; 540 / 45nm励起および600 / 50nm発光）を用いてペリリピンおよびS-ミオシン発現を調べ、40倍対物レンズ（0.60NA）下で画像を撮る。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+recruitment+after+injury%3A+lessons+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine.</a> Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Relaix, F., Zammit, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+are+essential+for+skeletal+muscle+regeneration%3A+the+cell+on+the+edge+returns+centre+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage.</a> Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).</li>
<li>von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+is+critical+for+the+normal+function+of+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+Pax7+and+Pax3+in+adult+regenerative+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis.</a> J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+persistence+and+migration+of+myogenic+cells+injected+into+pre-irradiated+muscles+of+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice.</a> J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).</li>
<li>Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+myoblast+transplantation+reveal+a+discrete+minority+of+precursors+with+stem+cell-like+properties+as+the+myogenic+source%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source.</a> J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).</li>
<li>Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+review%3A+myoblast+transfer%3A+a+possible+therapy+for+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies.</a> Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+specification+of+side+population+cells+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle.</a> J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).</li>
<li>Tamaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+CD34%2B%2F45-+and+CD34-%2F45-+stem+cells+are+situated+hierarchically+upstream+of+Pax7%2B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells.</a> Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+resident+in+postnatal+skeletal+muscle+differentiate+into+muscle+fibres+and+generate+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells.</a> Nat Commun. 2, 499(2011).</li>
<li>Mitchell, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+non-satellite+cell+muscle+resident+progenitor+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development.</a> Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).</li>
<li>Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+skeletal+muscle+resident+progenitors+and+their+cell+fate+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials.</a> Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).</li>
<li>Dellavalle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+of+human+skeletal+muscle+are+myogenic+precursors+distinct+from+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells.</a> Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).</li>
<li>Kostallari, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+the+myovascular+niche+promote+post-natal+myofiber+growth+and+satellite+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence.</a> Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+pericytes+in+skeletal+muscle+regeneration+and+fat+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation.</a> Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).</li>
<li>Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminin+regulates+PDGFRbeta%28%2B%29+cell+stemness+and+muscle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development.</a> Nat Commun. 7, 11415(2016).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Dore-Duffy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+pluripotent+cells+of+the+blood+brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier.</a> Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).</li>
<li>Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+microvascular+pericytes+exhibit+multipotential+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+pericyte+subtypes+differ+in+their+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential.</a> Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).</li>
<li>Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28(2017).</li>
<li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+multitasking+cells+in+the+regeneration+of+injured%2C+diseased%2C+and+aged+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle.</a> Front Aging Neurosci. 6, 245(2014).</li>
</ol>

すべての著者は、開示する利害の衝突はありません。

角質細胞は、毛細血管21,26の管腔外表面上に位置する多分化能血管周囲細胞22,23 である。骨格筋において、周皮細胞は、脂肪生成経路および/または筋形成経路19,20,24に沿って分化することができる。最近の研究により、異なるマーカー発現および明確な分化能を有する周皮細胞の2つの亜集団が明らかになった（19,24,25）。タイプI（NG2 +ネスチン- ）周皮細胞は脂肪生成性であり、タイプII（NG2 +ネスチン+ ）周皮細胞は筋原性である。 インビトロ研究のためのこれらの亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウス系統を必要とする。この精製の依存性プロトコールは、その適用を著しく制限し、従って、周皮細胞亜集団の生物学に関する研究を制限する。 このビデオ記事は、マウスの骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の単離の代替方法を示しています。この新しい方法は、依然とし...

筋ジストロフィーは、これまでのところ有効な治療法を持たない筋変性疾患である。組織の再生を促進する治療法の開発は、常に大きな関心を集めています。損傷後の組織の再生と修復は、幹細胞/前駆細胞に依存する1 。衛星細胞は、筋肉再生に寄与する筋原性前駆細胞である2,3,4,5,6,7。しかしながら、それらの臨床的使用は、制限された移動および注射後の低い生存率、ならびにインビトロ増幅後のそれらの減少した分化能力によって妨げられる8,9,10,11。サテリに加えて骨格筋はまた、血小板由来成長因子受容体 - ベータ（PDGFRβ） - 陽性間質細胞などの筋原性ポテンシャル12,13,14,15,16を有する多くの他の細胞集団を含む。筋肉由来のPDGFRβ +細胞が筋原性細胞に分化し、筋病変および機能を改善することが示された証拠がある14,17,18,19,20。 PDGFRβは、主に多能性を有する血管周囲細胞である周皮細胞21を標識する22,23。 PDGFRβに加えて、Neuron-Glial 2（NG2）およびCD146を含む多くの他のマーカーもiに使用される周皮細胞を鑑定する21 。しかしながら、これらのマーカーのいずれも周細胞特異的21ではないことに留意すべきである。最近の研究では、異なる分子マーカーを発現し、異なる機能を果たすタイプIおよびタイプIIと呼ばれる筋肉周皮細胞の2つのサブタイプが明らかになった19,24,25。生化学的には、タイプIの周細胞はNG2 +ネスチンであり、タイプIIの周細胞はNG2 +ネスチン+19,24である。機能的には、I型周皮細胞は脂肪蓄積および/または線維化に寄与する脂肪生成分化を受けることができるが、II型周皮細胞は筋再生経路に沿って分化し、筋再生に寄与する19,24,25。これらの結果は、（1）I型の周皮細胞は、b（2）II型周皮細胞は、筋ジストロフィーに対して大きな治療可能性を有する。これらの集団のさらなる調査および特徴付けは、高レベルの純度でI型およびII型周皮細胞の分離を可能にする単離プロトコルを必要とする。 現在、周皮細胞亜集団の単離は、NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスに依存している19,24。 NG2-DsRedマウスの利用可能性およびほとんどのNG2抗体の品質は、この方法の広範な使用を制限する。すべてのNG2 +周皮細胞もまた骨格筋19,20,24においてPDGFRβを発現することを考慮すると、我々は、NG2が、周皮細胞およびそれらの亜集団の単離のためにPDGFRβによって置換され得ると仮定する。この作業では、FACSベースのプロトコルについて説明します。PDGFRβ染色およびネスチン-GFPシグナルを使用する。この方法は、（1）NG2-DsRedバックグラウンドを必要とせず、（2）よく特徴付けられた市販のPDGFRβ抗体を使用するため、研究者の要求が少ない。さらに、これは、I型およびII型の周皮細胞を高純度で同時に単離することを可能にし、これらの周皮細胞亜集団の生物学および治療可能性をさらに調査することを可能にする。精製後、これらの細胞を培養で増殖させることができ、その形態を可視化することができる。この研究はまた、二重トランスジェニックマウスから精製されたものと同様に、この方法を用いて単離されたI型およびII型の周皮細胞が脂肪生成性および筋原性であることも示している。

<table><tbody><tr><td>セルソーター</td><td></td><td>ソニー SH800</td><td></td></tr><tr><td>自動セットアップビーズ</td><td></td><td>ソニー LE-B3001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>Avertin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>周皮細胞増殖培</td>地 <td>ScienCell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>MSC 基礎培地 (マウス)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5501</td><td></td></tr><tr><td>脂肪産生刺激サプリメント (マウス)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5503</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>馬血清</td><td>Σ</td><td>H1270</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ2型</td><td>ワーシントン</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>0.25%トリプシン/ EDTA&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&β;-PE 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-1402</td><td></td></tr><tr><td>ペリリピン抗体</td><td>Σ</td><td>P1998</td><td></td></tr><tr><td>S-ミオシン抗体</td><td>DSHB</td><td>MF-20</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-anti-rabbit 抗体&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-31572</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 555-抗マウス抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>封入剤 DAPI</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP120</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A661</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>P184</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>18 G ニードル</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>10 mL セロジカル・ピペット</td><td>BD</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-1111</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス骨格筋からのi型およびii型ペリクルの単離

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

角質細胞は血管周囲多分化能細胞であり、異なる器官または同じ組織内でさえも異質性を示す。骨格筋には、異なる分子マーカーを発現し、明確な分化能力を有する、少なくとも2つの周皮細胞亜集団（I型およびII型と呼ばれる）が存在する。 NG2-DsRedおよびNestin-GFP二重トランスジェニックマウスを用いて、I型（NG2-DsRed + Nestin-GFP-）およびII型（NG2-DsRed + Nestin-GFP + ）の周皮細胞が正常に単離された。しかしながら、これらの二重トランスジェニックマウスの利用可能性は、この精製方法の広範な使用を妨げる。この研究は、骨格筋からのI型およびII型の周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にする代替プロトコールを記載する。このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別（FACS）技術を利用し、Nestin-GFPシグナルと共にNG2ではなくPDGFRβを標的とする。分離後、I型とTy型pe II周皮細胞は異なる形態を示す。さらに、この新しい方法で単離されたI型およびII型の周皮細胞は、二重トランスジェニックマウスから単離されたものと同様に、脂肪生成性および筋原性である。これらの結果は、このプロトコルを用いて、周皮細胞亜集団を骨格筋から、場合によっては他の組織から単離することができることを示唆している。

レーザ強度およびチャネル補償を含むFACSパラメータは、無染色対照および単色対照の結果に基づいて補正される。 PDGFRβ-PE-FMOコントロールを用いてPDGFRβ-PE +集団のゲーティングを設定する（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE-細胞の中で、Nestin-GFP +およびNestin-GFP-細胞を表す2つの集団が明確に分離されている（ 図1A ）。 PDGFRβ-PE +ネスチン-GFP +およびPDGFRβ-PE +ネスチン-GFP集団のゲーティング境界は、PDGFRβ-PE +およびネスチン-GFP +のゲーティングに基づいて設定される（ 図1A ）。これらの境界は、PDGFRβ-PE +ネスチン-GF...

この研究は、骨格筋からのI型およびII型周皮細胞の容易かつ同時の単離を可能にするFACSベースのプロトコールを記載する。

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

この手順の全体的な目的は、FACSを用いて骨格筋からペリサイトのサブポピュレーションを単離することです。この手法は、タイプIおよびタイプIIペリサイトの生物学的な違いは何かという、ペリサイト生物学における主要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルの主な利点は、NG2 dsREDトランスジーンを使用せずに、タイプIおよびタイプIIペリサイトを同時に単離できることです。本プロトコルの適用範囲は骨格筋に限定されません。脳などの他の臓器からペリサイトを単離する場合にも利用可能です。まず、nestin-GFPトランスジェニックマウスから目的の組織を採取し、抗生物質を含む氷冷PBSで組織を2回洗浄します。その後、サンプルを滅菌済みの10cmプレートに移します。次に、滅菌済みのハサミとメスを用いて、筋肉を1〜2mm³の細かい断片に切り刻みます。必要に応じて、組織の乾燥を防ぐために少量のDMEMを添加してください。組織を10 mmのセロロジカルピペットでピペッティングし、機械的に分散させます。次に、0.2% Type 2 collagenaseを添加したDMEMである新鮮な消化液を混合物に加え、37 °Cで35 RPMにて2時間インキュベートします。2時間のインキュベーション後、18ゲージの針を用いて混合物をトリチュレーションし、得られた懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します。次に、ペレットを0.25% trypsin-EDTAに再懸濁し、サンプルを37°Cで10分間インキュベートします。続いて、20% FBSを添加したDMEMを10 mL加え、サンプルを500 x gで5分間遠心分離します。ペレットが形成されたら、細胞を10 mLの赤血球溶解バッファーに再懸濁し、懸濁液を500 x gで5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを10 mLのソーティングバッファーで再懸濁します。次に、混合液を40 µmのセルストレーナーでろ過し、得られた単一細胞懸濁液を500 x gで5分間、再度遠心分離します。ペレット化した細胞を1 mLのソーティングバッファーで再懸濁し、ヘモサイトメーターで細胞数を計数した後、さらに希釈して5 × 10⁶ cells/mLの懸濁液にします。セルソーティングを行う前に、テキストプロトコルに従ってコントロールを準備し、サンプルの染色を行ってください。ソーターとソフトウェアを起動し、指示に従って100 µmのソーティングチップをスキャンして挿入します。その後、自動セットアップ用ビーズをロードし、自動セットアップを実行してください。自動セットアップが完了したら、「Experiment」タブを開き、「Blank Template」をクリックします。次に、「Measurement Settings」で、FL1にDAPI、FL2にNestin-GFP、

isolation-of-type-i-and-type-ii-pericytes-from-mouse-skeletal-muscles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオは、マウスの脳から脳周皮細胞を分離する方法を示しています。単離した細胞は、ペリサイト特異的培地で培養され、ペリサイト増殖を促進します。...

マウス脳周皮細胞の単離と培養

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。...

筋衛星細胞の単離、培養、および移植

我々は、それによって新生児の平滑筋細胞の収縮と弛緩に関与するシグナル伝達経路のより良好な研究を可能にする、新規かつP7の幼いマウスからの肺動脈平滑筋細胞の初代培養物（PASMC）を単離するための再現可能な技術を開発した。...

新生児マウスから肺動脈平滑筋細胞の単離

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

私たちは、基礎研究と生物学と治療の可能性の研究のために、マウス心膜を分離し、精製するためのプロトコルを最適化しました。...

マウス心ペリサイトの単離と精製

我々は、マウス脳ペリサイトの抽出のためのプロトコルを提示する。抗生物質フリー濃縮指向のペリサイト抽出に基づいて、このプロトコルは、高純度と高収率を提供するインビトロ研究のための貴重なツールであり、したがって、使用される実験動物の数を減少させる。...

マウスから脳ペリサイトを分離する高出力法

ここでは、出生後初期の発達段階で単一の筋線維を効率的に得る方法を、エメリー・ドレイフス型筋ジストロフィー(EDMD)の非常に重篤なモデルであるホモジューザイゴウス変異体ラミンΔ8-11マウスモデルから提案する。...

出生後初期の発達におけるエメリー・ドレイフス型筋ジストロフィーのマウスモデルからの単一の筋繊維の分離と培養

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

マウス脳皮質ペリサイトがscRNA-seqの要求を満たすために、CD13⁺/CD31⁻選択に基づく極めて最適化されたFACSプロトコルを提示します。私たちの主要な改良により、細胞の生存率とRNAの完全性が大幅に向上し、信頼性の高いトランスクリプトムプロファイリングが可能になります。...

FACSを用いたマウス皮質組織からのペリサイト分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

学ぶFACSを用いたマウス骨格筋からのI型およびII型ペリサイトの単離法。特定のトランスジェンを必要とせず、同時に2つのサブ集団を分離でき、血管生物学や再生医療の研究に応用可能です。

マウス骨格筋からのI型およびII型ペリクルの単離

さらに動画を探す