Name: 機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶ機械的組織解離とフローサイトメトリーによる哺乳動物の精巣組織からの雄胚細胞のマルチシード精製法。Hoechst-33342とプロピジウムヨウ化物染色を用いて4種類の胚細胞集団を同時に単離し、精子形成の分子研究を促進します。

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著者らは、犬の精巣のためのヒルサイド動物病院（ミズーリ州セントルイス）に感謝する。 Jason ArandとDr. Ted Ciceroのワシントン大学（セントルイス）で、ラット精巣とBrianne Tabersを提供してくれました。モルモット精巣のためのWashUのJared HartsockとDr. Salt&#39;s Lab;小型ブタ精巣のためのWashUの比較医学部門のマイケル・タルコット博士。著者らはまた、職員による細胞選別サービスを提供するSiteman Flow Cytometry Coreの使用について、米国ミズーリ州セントルイスのワシントン大学医学部およびバーンズ - ユダヤ人病院のAlvin J. Siteman Cancer Centerに感謝しています。サイトマン癌センターは、NCI Cancer Center Support Grant＃P30 CA91842の一部でサポートされています。 この研究は、米国国立衛生研究所からの助成金[R01HD078641およびR01MH101810からDへ]のFCT博士論文[SFRH / BD / 51695/2011]FC]およびFCT研究契約[IF / 01262/2014 to AML]

下記の全ての手順は、セントルイスのワシントン大学の動物研究委員会の規則に準拠しています。 1.機械的解離プロトコルの準備<ol><li> マウス精巣全体の解離のために、50μmの使い捨て組織脱凝集カートリッジを予め湿らせておく。 注：この使い捨ての組織解離カートリッジには、組織を切断するために設計されたマイクロブレードと、約100個の六角形の穴を備えた不動のスチールメッシュが含まれています。組織解離カートリッジ用の異なるサイズのメッシュは、種および所望の細胞型に基づいてこのプロトコルを適合させるために利用可能である。このペーパーで言及されているすべての哺乳動物種について、50μmのカートリッジを使用した。 <ol><li>氷冷フェノールレッドフリー1×ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）1mLを50μm使い捨て組織脱凝集カートリッジに充填する。 注：赤色の蛍光の検出を妨げることがあります。FACS中に</li><li>シリンジポートから使い捨ての3 mLニードルレスシリンジで組織脱凝集カートリッジから1 x DMEMを吸引します。 </li></ol></li><li> &quot;ON&quot;ボタンを押して組織解離システムをオンにします。このシステムは「ウォームアップ」時間を必要としません。 </li><li>氷冷した1×DMEMを使用した3つの40μm使い捨てフィルターを予め湿らせます。各40μm使い捨てフィルターを50mLコニカルチューブに置きます。 1×DMEMの1mLをピペットし、液体を通過させる。 </li><li>精巣組織の収集のために100mm×15mmのペトリ皿を準備する。 1×DMEM500μLをペトリ皿にピペットで入れる。 </li></ol> 2.機械解離プロトコルのための精巣組織の調製<ol><li> 外科用はさみと鉗子で新鮮な全精巣または精巣断片（他の哺乳動物の種を扱う場合）を注意深く取り除くために、雄マウスを解剖する。 注：組織に脂肪や壊死がないことを確認してください。 Fr<html>睾丸組織は凍結組織より優れた単一細胞懸濁液品質を生じる。 <ol><li>収集した精巣/断片を、500μLの1×DMEMを含む調製した100mm×15mmペトリ皿に移す。 </li><li>赤血球（存在する場合）を除去するために、組織を1×DMEMでゆっくりすすいでください。 </li></ol></li><li> 慎重にtunica albugineaを除去する。 Tunica albugineaの厚さは種によって異なる。 <ol><li>鉗子で精巣の片端を掴む。 </li><li>前のステップの鉗子で精巣の一端を保持しながら、精巣のもう一方の端をメスで穿刺する。 </li><li>精巣の一方の端をステップ2.2.1の鉗子で保持したまま、メスを使用して精巣管を擦る。 </li></ol></li><li>メスを使用して、精細管を約2〜3mm 3に切断する。 </li></ol>精巣組織の機械的解離による単細胞浮遊液の取得ontent &quot;&gt;注：下記の解離ステップは、成体マウス精巣の1つです。若年マウスまたは非マウス種の精巣組織の体積は、それに応じて調整する必要があります。精巣組織の組成は、繁殖期に非交配期と比較して変化する。 <ol><li>小さな睾丸細管片を鉗子を用いて予め濡らした50μm組織脱凝集カートリッジに移し、1mLの1×DMEMを加える。 </li><li>組織解離カートリッジを組織解離システムにロードし、ノブを「スタンバイ」モードから「実行」モードにして5分間処理します。 </li><li> 組織解離システムから組織脱凝集カートリッジを取り出し、シリンジポートから使い捨ての3mLニードルレスシリンジで細胞懸濁液を吸引する。 <ol><li>数回吸引して組織脱凝集カートリッジからすべての液体を除去する。ない全ての1mLを組織脱凝集カートリッジから回収することができる。 </li></ol></li><li> 吸引された細胞懸濁液を、2つの使い捨ての予め湿潤された40μmのフィルターに通す。フィルターを2回フィルターをかけて細胞集合体を除去する。 <ol><li>予め湿らせた40μmフィルターを50mLコニカルチューブに入れます。吸引した細胞をシリンジに直接40μmフィルターに加える。使い捨てピペットでピペットパススルー単一細胞懸濁液。 </li><li>使用済みのプリウェット40μmフィルターを取り外し、別のプリウェット40μmフィルターを50 mLコニカルチューブに入れます。収集した単一細胞懸濁液をクリーン40μmフィルターにピペットで移します。 </li><li>きれいな使い捨てピペットでろ過した単一細胞懸濁液を回収する。 </li></ol></li><li>ピペットでろ過した細胞懸濁液を50μm組織解離カートリッジに戻し、組織解離系でさらに5分間処理する。 </li><li>組織の分離からすべての液体を回収するオンカートリッジ。 </li></ol> 4.ヘキストおよびヨウ化プロピジウム（PI）による染色<ol><li>回収された細胞懸濁液を50μmの組織分離カートリッジから清潔な1.5mLチューブに移す。約1-1.5mLの単一細胞懸濁液が回収される。 </li><li> 回収した単一細胞懸濁液を4本の1.5 mLまたは5 mLチューブに分注する。 <ol><li>最初の3本のチューブについては、150μLの単一細胞懸濁液およびピペットの残りの単細胞懸濁液を4本のチューブの最後（単一細胞懸濁液の約550μL）にピペットで移す。 注：最後のチューブの単一細胞懸濁液の量は、ステップ3.6での細胞懸濁液回収の効率に基づいて変化し得る。 </li></ol></li><li> FACSセッションのための染色されていないコントロールとして4つのチューブの最初のチューブを設定します。 </li><li>コントロールとして単一色素染色（PIまたはHoechst）細胞懸濁液を調製する。 2.5μLのHoechstまたは1μLのPIを各チューブに添加する（第2および第5rd）。 </li><li>二重染色チューブを準備する。これは、生殖細胞亜集団を収集するために使用されます。最後のチューブに2.5μLのHoechstと1μLのPIを加えます。 注：Hoechstの保存期間は2〜3ヶ月です。色素の古いストックを使用すると、FACSセッション中に重大な変化が起こります。 </li><li>室温で30分間、暗所でインキュベートする。チューブローテーターにサンプルを入れるか、5〜10分ごとに1.5 mLチューブを逆さにする。 </li><li>予め湿らせた40μmのストレーナーで細胞懸濁液をろ過し、ろ過した溶液を氷上および暗所でFACSセッションまで保持する。 注：濾過工程は、FACSの細胞塊を防ぐために必要です。さらに、DNase（ 図1参照）または2-ナフトール-6,8-ジスルホン酸二カリウム塩（NDA 20 ）での処理を用いて、細胞凝集を制限することができる。長期間の待機期間は、FACSの間に検出された蛍光シグナルに影響し、細胞死の増加をもたらす可能性がある。 </li&gt; </ol> 5.蛍光活性化細胞選別（FACS）精巣細胞のセットアップと精製<ol><li> FACS収集チューブを準備する。 <ol><li>細胞収集のために400mLのFBSを含む5mLのポリプロピレン丸底管または1.5mLの管をコートする。コーティング後に過剰のFBSを傾瀉する。 </li><li>チューブにFACS回収培地（1x DMEM + 10％ウシ胎仔血清、FBS）を加える：5mLチューブ用に1mLまたは1.5mLチューブ用に100μL。 </li></ol></li><li> セルソーターとソフトウェアで適切なソート条件を設定します。 注：他の細胞選別機および分析ソフトウェアは、以下に説明する同様のセットアップおよびゲーティング戦略と共に使用することができる。ここに記載された条件は、Gaysinskaya and Bortvin 2 、Geisinger and Rodriguez-Casuriaga 3 、およびGetun、 et al。 4 <ol><li>紫外レーザーを463/2でロードするHoechst blueを検出するための5 nmバンドパスフィルターと、Hoechst redを検出し、PIを検出するための680 nm LPバンドパスフィルター。 </li><li> 555DLPダイクロイックミラーを使用して、青と赤の蛍光を区別します。 </li><li> 70μmのノズルを使用し、1000-2000細胞/秒の割合で細胞を分類する。 注：効率のソートは流量に直接影響されます。高い流速（&gt; 3500事象/秒）は、選別の速度を増加させるが、集団の汚染をもたらす。詳細については、参考文献12を参照してください。 </li></ol></li><li> コントロールサンプルを使用してゲートを設定します。 <ol><li>染色されていないサンプルをロードして実行します。 </li><li> FSC対SSCプロットパターンに基づいて細胞破片を除外する。プロットの左下象限に細胞破片が現れます。ユーザーまたはセルソーター技術者がセル破片の閾値を任意に設定します。 </li><li> FSCとパルス幅のしきい値を調整することにより、単一セルのゲート。異なる細胞選別器は異なる方法を持っています独身の騎士。パルス幅は細胞がレーザーを横切る時間を反映するので、単一細胞は多細胞凝集体と比較して低い値を有する。 FSC対パルス幅のプロットの閾値を調整することで、シングレットを選択することができます。 </li><li>最適光電子増倍管（PMT）電圧を設定します。 </li><li> PIまたはHoechst蛍光シグナルの閾値を確立するために、非染色および単一色素染色細胞の両方を使用する。 注：各色素の適切な蛍光範囲を確立するために、目的の細胞のベースラインPTM電圧を最適化することが重要です。これは、最適な信号検出と感度にとって重要です。染色されていない単染色対照細胞を使用して、PIおよび/またはHoechst色素で陰性および陽性に染色された細胞の範囲を確立し、シグナルのノイズを最小限に抑えます。コントロールセルを使用したPMT電圧の最適化の詳細については、Gaysinskaya and Bortvin 2 </li><li>生細胞の門PI染色（PI陰性）およびFSCプロットに基づく。死細胞はPI蛍光に対して陽性である。 </li><li> Hoechst blueの蛍光に基づいて細胞数のヒストグラムをプロットしてDNA含有量ゲートを設定する。一倍体（1C）、二倍体（2C）、および四倍体（4C）細胞を表すHoechst青色蛍光の濃度が増加する3つのピークが現れるはずである。 3つのゲートを1つずつ設定します。 </li><li>生殖細胞集団のゲーティングに進む前に、少なくとも50万件のFSC対SSCプロットを観察する。 </li></ol></li><li> ゲートの異なる生殖細胞集団。 <ol><li> Hoechst / PI染色サンプルをロードする。 </li><li>すべての人口に共通の最初の3つの親ゲートを設定します。 <ol><li> FSC対SSCプロットに基づいて細胞破片を除外する。 FSC対パルス幅プロットに基づいてシングレットを選択します。 PI陰性細胞をゲーティングして生細胞を選択する。 </li></ol></li><li> spermatogoniaゲートを定義します。 </li><li> Hoechst青色および赤色蛍光に基づくPI陰性細胞のプロット強度。 Spermatogoniaは側方集団として現れる（ 図1参照）。 </li><li>残りの生殖細胞集団のゲートを定義する。注：視覚的な詳細については、図1および補足図2を参照してください。 </li><li> DNA含量ゲートにPI陰性細胞をプロットする。 <ol><li>精子については、最も低いHoechst蛍光（1C）でピークをゲートする。 </li><li>精母細胞IIについては、中間のHoechst蛍光（2C）でピークをゲートする。 </li><li>精母細胞Iでは、最高のHoechst蛍光（4℃）でピークをゲートする。 </li></ol></li><li> Hoechstの青色と赤色の蛍光強度をプロットして、DNA含有量ゲートからの精細胞および精細胞集団を精製する。 </li></ol></li><li>選択された亜集団ゲートを、予め用意された収集チューブに集める。各精巣は、各亜集団について約0.5-6.0×10 6個の細胞を収集するために平均45分から1.5時間かかる。 注：Hoechst maへの長期間の細胞暴露yは時間とともに人口の位置をわずかにシフトさせる。 FACSの20〜30分後に設定を更新してください。各亜集団の最大収量は、解離ステップの効率に左右される。 </li></ol> 6.精製された細胞の顕微鏡評価<ol><li> 4℃で10分間500-600 xgで細胞を回収した。 </li><li> 1mLの氷冷1Xリン酸緩衝液（PBS）または1×DMEMで細胞ペレットを再懸濁する。 注：再懸濁液量は、選別された細胞の数および所望の最終濃度に従って調節することができる。 </li><li>洗浄した細胞40μLをきれいなスライドガラスにピペットで移し、カバースリップを入れる。 </li><li> 残りの細胞を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定し、固定した細胞を暗所で4℃で保存しておく。 <ol><li>コレクションチューブに100μL4％PFAをピペットで直接注入する。 </li><li>チューブまたはピペットを短時間ボルテックスして、細胞懸濁液がよく混合されるようにします。 </li></ol></li><li> 63Xの対物レンズの下でHoechst蛍光を検出するために、UVランプを備えた顕微鏡で準備したスライドを視覚化する。特定の生殖細胞タイプを特定する方法の詳細については、 結果セクション - 選別された生殖細胞集団の形態学的評価を参照してください。 </li></ol>

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すべての著者は競合する利益を宣言していません。

哺乳動物の精子形成過程における高度に保存されたクロマチン動態を考慮して、この研究の目的は、異なる哺乳動物精巣組織からの分化の異なる段階で雄性生殖細胞を単離するためのプロトコールを開発することであった（ 図1 ）。異なる動物モデルへの単一のワークフローの適用における主な障害の1つは、特に組織解離プロトコルに関して、種特異的調整の必要性である。現在の方法は、ほとんどが酵素組織消化に依存しており、プロトコールは種内でさえ変わることが多い12 。この問題を克服するために、ここに記載されたプロトコルは、異なる哺乳動物種の精巣試料から単細胞懸濁液を得るための機械的組織解離の適用を示す。結果は、この系と新鮮な精巣組織の機械的解離が良好に機能することを示している（ 図 2A〜2B </strong&gt;）、これはげっ歯類20における先の出願と同様である。重要なことに、Hoechst染色は、単細胞懸濁液の品...

精子形成の進行を示すin vitro系の欠如および精巣における大きな細胞異種性の存在を考慮すると、雄性生殖細胞生物学の研究は、特定の細胞型の豊富な集団を単離するための堅牢な技術を必要とする。蛍光活性化細胞選別（FACS）が広く、高い収率および純度を提供するように、この目的の1、2、3、4、5のために使用され、それは識別することができ生殖細胞型の数の他の単離方法を上回るされています6、7、8を選択します。フローサイトメトリー分析の原理は、単一細胞のレーザービーム励起後の異なる光パターンの検出に基づく。細胞がレーザーを通過すると、光を反射/散乱させる細胞の大きさ（前方散乱; FSC）および細胞内の複雑さ（側方散乱; SSC）に比例するあらゆる角度で、フローサイトメトリーの詳細については、Ormerod 9を参照してください。 雄性生殖細胞は、精子形成の異なる段階を通じてDNA含量、染色質構造、サイズおよび形状に特異的な修飾を受ける。従って、異なる細胞集団を同定し、蛍光色素10、11と光散乱とDNA染色を組み合わせることにより分離することができます。いくつかの色素は、ヘキスト33342（ヘキスト）しばしば、過去十年間1ため精巣細胞のフローサイトメトリー分析に使用される2、4、10れているように、（Geisingerとロドリゲス-Casuriaga 3に概説）は、この目的のために使用することができます、 12 。ウポUV光を有するN個の励起遠赤色蛍光は、クロマチン構造及びコンパクション1、13、14の変動を反映しているのに対し、ヘキストは、細胞のDNA含有量に比例した青色の蛍光を発します。その結果、分化の異なる段階における雄性生殖細胞は、ヘキスト染色単一細胞懸濁液のFACS中に特定のパターンを示す（HO-FACS; 1、12）。興味深いことに、精子による段階の間のみ有効である染料流出の機構に、ヘキスト青色蛍光の強度は、これらの細胞におけるクロマチン含有量に比例しないが、それらはホ- FACS 15時側集団としてクラスタ。また、非浸透性色素ヨウ化プロピジウム（PI）でヘキスト染色を組み合わせ、ユーザーがFACS 1中に死んだ（PI陽性）細胞から（PI陰性）ライブ区別することを可能にします&lt;SUP&gt;、2、10、12。以前にフローサイトメトリーに使用されています。この戦略は、精巣生殖細胞の分析および減数分裂I 1、2、4、16の4つの異なる段階における細胞を含む9生殖細胞型まで区別するために、マウスで広く最適化。この研究の目的のために、Hoechst染色は3つの主な利点を有する。まず、ホー-FACSは、正常マウスモデル1、2、12に雄性生殖細胞、及びそのようなラットおよびモルモット17、18、19のような他のげっ歯類の単離に適用されています。第二に、Hoechstは細胞浸透性色素であり、膜の透過性を必要としないため、vesセルの完全性。ヘキストは、（D [AT]）RNAは保存され、DNAおよびタンパク質に加えて、胚のさらに下流分子の研究に使用することができることを意味するDNA配列1、20、ポリ優先的に結合するので、最終的に、何のRNase処理を必要としません細胞分化。 哺乳動物種（GeisingerおよびRodriguez-Casuriaga 3で概説）のフローサイトメトリー分析で観察されたDNA倍数性および/または染色性の類似性にもかかわらず、フローサイトメトリーによる雄性生殖細胞単離について記載されたプロトコールにはかなりの可変性があった。異なる研究では、組織解離のための特定のプロトコールが用いられ、異なるモデル生物（主にマウス、ラットおよびモルモット）における異なるDNA結合色素（単独または組み合わせ）およびFACSゲーティング戦略が用いられている。したがって、異なる種について収集されたデータの直接の比較は、方法論間のバラツキから生ずる未成熟の技術的成果物。重要なことに、哺乳類の精子形成（2N-4N-2N-1N）におけるクロマチン動態の顕著な保存は、標準化されたプロトコールが様々な哺乳動物種に横方向に適用できることを示唆している。 本研究の目的は、以前に発表された技術2、20を組み合わせて適応させることによって、異なる哺乳動物種に適用可能であり、単一のワークフローを開発することでした。組織処理のための方法の標準化は、酵素消化に必要な種特異的調節の必要性を克服するために機械的解離を行うことによって達成された5 。齧歯類精巣組織の機械的解離は、酵素消化組織20との両方の方法のexhibによって生成された単一細胞懸濁液のホー-FACSよりも良好に機能することが示されたことは注目に値しますそれに匹敵する結果5 。原則の証明として、このプロトコールは、5つの生殖細胞集団を分離するために用いられる設定を記載する：精原細胞（SPG）; （SPC I）および二次精母細胞（SPC II）、および精子（SPD） - ラウンド（rSPD）および伸長（eSPD）を含む。重要なことは、組織解離システムとUVレーザーを備えたセルソーターへのアクセスが主な要件であり、ラボでの実装が容易であることです。このワークフロー（ 図1 ）は迅速かつ簡単で、2時間以内に新鮮な精巣組織から4つの生殖細胞集団を同時に分離することができます。減少した処理時間は、さらなる下流手順のために細胞の完全性を維持するために重要である。さらに、5種の異なる種におけるその成功した性能は、それが哺乳類のクレード内に広く適用され得ることを示唆し、哺乳動物の雄性生殖生物の比較研究のための生殖細胞を単離するための理想的な方法であるおやすみ。 このプロトコルは、（1）精巣組織の機械的解離、および（2）HoechstおよびPIによる精巣細胞の染色、（3）関連する精子形成細胞のFACS選別からなる3つの主要セクションから構成される。一旦集められると、様々な哺乳動物精巣生殖細胞のこれらの豊富な集団は、広範囲の用途に使用することができる。このプロトコルは、多くの異なる哺乳動物種からの雄性生殖細胞を精製するための「ワンサイズ適合」解離方法を記載している。単離された生殖細胞で行うことを希望する研究のタイプに応じて、他の培地または緩衝液を使用することができる。以下のプロトコールステップは、1つの全マウス精巣から単細胞懸濁液を生成するためのものである。

<table><tbody><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>VWR</td><td>#15710</td><td>4% PFA, 選別細胞の固定用</td></tr><tr><td>Medimachine</td><td>BD Biosciences</td><td>#340588;</td><td>精巣解離のためのシステム</td></tr><tr>1X Dulbecco modified Eagle medium <td>Life Technologies</td><td>#31053</td><td>DMEM, for testis dissociation</td>Medicon BD Biosciences#340591 Disaggregation cartridge for testis dissociation Fetal bovine serum Thermo Scientific#10082139 FBS, for FACS collection Hoechst 33342 Invitrogen #H3570 Hoecsht, For FACS staining(<td>1X ダルベッコ改変イーグル medium</td> Life Technologies#31053 DMEM, 精巣解離</tr>用) <tr><td>Medicon</td><td>BD Biosciences</td><td>#</td><td>Disaggregation cartridge for testis dissociation</td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Scientific</td><td>#</td><td>FBS, for FACS collection</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td></td> <td>Hoecsht, For FACS staining</td></tr><tr><td>(英語)40 &マイクロ;m細胞ストレーナー</td><td>GREINER BIO-ONE</td><td>#89508-342</td><td>睾丸解離用</td></tr><tr><td>100x 15 mm ペトリ皿</td><td>Falcon</td><td>#351029</td><td>睾丸解剖用</td></tr><tr><td>5mLポリプロピレン丸底チューブ</td><td>Falcon</td><td>#352063</td><td>FACS採取用</td></tr><tr><td>1.5mL エッペンドルフチューブ</td><td>VWR</td><td>#20170-650</td><td>FACS採取用</td></tr><tr><td>3mL 不要シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>#309657</td><td>精巣解離用</td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ</td><td>MIDSCI</td><td></td> #C50R <td>精巣解離用&nbsp;</td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Invitrogen</td> <td>#L7011</td><td>PI、FACS染色用</td></tr><tr><td>MoFlo Legacyセルソーター</td><td>ベックマン・コールター</td> <td>#ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>サミット用 セルソーティングソフトウェア</td><td>ベックマン・コールター</td> <td>#ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td>用 <td>サーモサイエンティフィック</td> <td>#AM9625</td><td>PBS、顕微鏡用</td></tr><tr><td>顕微鏡ガラススライド</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>#12-544-4</td><td>顕微鏡用</td></tr><tr><td>ガラスカバーガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>#12-548-87</td><td>顕微鏡用</td></tr><tr><td>使い捨てトランスファーピペット (3mL)</td><td>Samco Scientific</td><td>#225</td><td>睾丸解離</td></tr><tr><td>用 DNase I</td><td>Roche</td><td>#10104159001</td><td>睾丸解離用</td></tr><tr><td>炭素鋼製外科用ブレード</td><td>Miltex</td><td>#4-111</td><td>睾丸解離用</td></tr><tr><td>Countess 全自動セルカウンター</td><td>Invitrogen</td> <td>#C10227</td><td>自動細胞計数用</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Sigma</td> <td>#T8154</td><td>生存率染色用</td></tr></tbody></table>

機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

蛍光活性化細胞選別（FACS）は、哺乳類の精巣生殖細胞の豊富な集団を単離するための選択方法の1つである。現在、9個までのネズミ生殖細胞集団を高収率および高純度で識別することができます。精子形成を通してのクロマチン構造および量のユニークな変化のために、識別および精製におけるこの高分解能が可能である。これらのパターンは、Hoechst-33342（Hoechst）のような蛍光DNA結合色素で染色した雄生殖細胞のフローサイトメトリーによって捕捉することができる。ここには、哺乳類精巣生殖細胞を単離するために最近開発されたプロトコルの詳細な説明がある。簡単に述べると、単一細胞懸濁液は、機械的解離によって精巣組織から生成され、Hoechstおよびヨウ化プロピジウム（PI）で二重染色され、フローサイトメトリーによって処理される。異なるDNA含有量（Hoechst強度）を有する生存細胞（PI陰性）の選択を含む連続ゲーティング戦略、iFACSソーティング中に5つの生殖細胞型を区別するために使用される。精子細胞（66％）、原発性（71％）および二次性（85％）の精母細胞および精子細胞（90％）を含み、さらに円形（93％）および伸長性（87％）の亜集団に分類された。ワークフロー全体の実行は簡単で、4つの細胞タイプを適切なFACSマシンで同時に分離することができ、2時間未満で実行できます。 エキソビボ細胞の生理学を保存するためには処理時間の短縮が重要であるため、この方法は雄性生殖細胞生物学の下流ハイスループット研究には理想的です。さらに、哺乳類の生殖細胞の多種の精製のための標準化されたプロトコルは、方法論的な変数の源を排除し、単一のセットの試薬を異なる動物モデルに使用することを可能にする。

精巣組織の機械的解離による単細胞懸濁液 図2は 、異なる条件下でのマウス精巣組織の機械的解離によって得られた単細胞懸濁液を比較する。 （ 図2A ）またはHoechst（ 図2B ）で染色された新鮮な組織を処理することによって得られた試​​料は、分化の様々な段階で単一細胞の存在を示し、重要なことには、精子の鞭毛を含む細胞構造が保存されているように見える。これらの結果は、Hoechst染色が単細胞懸濁液の品質を有意に変えないことを示している（ 図2D ）。これらの結果は、解離後にDNaseを添加することによって減少した染色サンプルにおいて観察された。興味深いことに、単細胞懸濁液マウスの凍結組織（ <strong class=...

この研究は、異なる哺乳動物種の精巣組織から精製された生殖細胞集団を得るための方法の標準化を記載している。 Hoechst-33342とヨウ化プロピジウムで染色し、FACSソーティングを組み合わせた単純なプロトコールで、男性の生殖生物学の比較研究に幅広く使用されています。

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

この標準化された手順の全体的な目的は、単一のプロトコルを用いて、異なる哺乳類種から個別の雄性生殖細胞型を分離することです。本手法は、異なる生殖細胞型のハイスループット解析を通じて、精子形成の分子生物学的研究を促進するのに役立ちます。この技術の主な利点は、単一の試薬セットをさまざまな哺乳類種に適用し、4つの異なる雄性生殖細胞集団を同時に分離できることです。この手法を考案したのは、さまざまな哺乳類における特定の遺伝子発現調節パターンの進化を調査することに決めた時でした。Siteman Flow Cytometry Coreの医療技術者であるChris Holleyが、セルソーターの操作方法とゲートの設定方法について実演します。まず、マウスの精巣を1つ取り出し、組織を小さく切断することから始めてください。次に、ピンセットを使用して、小さな組織片をあらかじめ濡らしておいた50 µmの組織分散カートリッジに移します。カートリッジに1 mLのDMEM培地を加え、組織分散カートリッジを組織分散システムにセットします。ノブを待機（standby）から運転（run）に回し、5分間組織を処理します。次にカートリッジを取り出し、3 mLの使い捨てシリンジを使用して、シリンジポートから細胞懸濁液を吸引します。すべての液体を回収した後、細胞凝集塊を除去するために、あらかじめ濡らした2個の使い捨て40 µmフィルターで細胞をろ過し、懸濁液を分散カートリッジに戻します。その後、さらに5分間細胞を処理します。フローサイトメトリー（FACS）用の細胞染色を行うため、解離させた細胞懸濁液を1.5 mLチューブに回収します。次に、細胞液150 µLを3本の新しい1.5 mLチューブにそれぞれ分注し、残りの量を4本目の1.5 mLチューブに加えます。1本目のチューブを未染色のコントロールとして除けておき、2本目のチューブにHoechstを2.5 µL、3本目のチューブにpropidium iodideを1 µL、そして4本目のチューブにHoechstとpropidium iodideの両方を添加します。室温かつ暗所にて緩やかに回転させながら30分間静置した後、細胞懸濁液を個別の、あらかじめ濡らした40 micronストレーナーでろ過し、5 mLのラウンドボトムチューブに回収します。次に、FBSを添加したDMEMを入れた4本の回収チューブをフローサイトメーターのソートノズル下に配置し、未染色のコントロールチューブを解析のためにロードします。前方散乱光（FSC）対側方散乱光（SSC）プロットを用いて細胞 debris を除外し、前方散乱光の閾値とパルス幅を調整して、単一細胞のゲーティングが行えるようにします。収集したサンプルの品質を最適化するには、厳格なゲーティングが不可欠です。細胞碎片や多細胞凝集塊を除外することで、単一細胞が確実に選択されるようにしてください。単色染色細胞を用いて、未染色サンプルに対するHoechstおよびプロピジウムヨードの蛍光強度の閾値を設定します。次に、二重染色の実験サンプルをロードし、先ほど示した通りに3つの親ゲートを設定します。3つの親ゲートを設定した後、プロピジウムヨード染色されていないことから生細胞を選択し、Hoechst blue蛍光に基づく細胞数のヒストグラムをプロットしてDNA含有量を設定します。倍数性が単倍体、二倍体、および四倍体細胞に対応する、Hoechst blue蛍光強度がそれぞれ増加する3つのピークにゲートを設定し、前方散乱光（forward scatter）対側方散乱光（side scatter）プロットで少なくとも500,000イベントを観察します。プロピジウム йоウ化物を陰性とする細胞を、Hoechstの青色および赤色の蛍光強度に従ってプロットします。精原細胞はサイドポピュレーションとして現れます。Hoechstの青色蛍光強度はDNA量と相関します。したがって、Hoechstブルーおよびレッドのプロットを作成する前にこのゲートを設定することで、目的の倍数性を持つ細胞を確実に選択できます。精細胞（spermatid）を単離する場合は、半数体ピークにゲートをかけ、Hoechstブルーおよびレッドの蛍光をプロットした際に現れる集団を選択します。二次精母細胞（spermatocytes II）を単離する場合は、二倍体ピークにゲートをかけ、Hoechstブルーおよびレッドの蛍光をプロットした際に現れる集団を選択します。精細胞Iの単離では、4倍体ピークにゲートを設定し、Hoechstの青色および赤色蛍光をプロットした際に現れる集団を選択します。次に、選択したサブポピュレーションを個別の回収チューブにソートし、各細胞サブセットあたり約0.5〜6×10⁶個の細胞を回収します。新鮮な組織を機械的に解離させて得られた、未染色のまたはHoechstで染色した細胞懸濁液では、さまざまな分化段階にある単一細胞の存在が確認できます。重要な点として、精子の鞭毛を含む細胞構造は維持されていると考えられます。細胞残渣の排除後、細胞の95〜98%が単一細胞であり、そのうち86〜93%が生存しています。FACSにおいてHoechstの青色および赤色の蛍光機能をプロットすることで、特定の精巣生殖細胞集団の特定が容易になります。予想通り、半数体精細胞の集団が最も多く、次いで二倍体第2精母細胞、四倍体第1精母細胞の順となっており、このパターンは種を越えて保存されています。分取した細胞の顕微鏡分析により、精原細胞はHoechstで強く染色される、明瞭で小さく丸い中心体周囲ヘテロクロマチンを示すことが明らかになりました。精母細胞はより大きく顆粒状の細胞であり、核の識別が容易です。第1精母細胞のサブポピュレーションでは減数分裂細胞に特徴的なクロマチンの変化が見られ、第2精母細胞のサブポピュレーションでは核形成期またはダイアキネシス期の核が見られます。精細胞（spermatids）は、円形または長楕円形の小さな半数体細胞であり、局在化したクロモセンターの存在によって精原細胞（spermatogonia）と区別できます。この手法を習得すれば、適切に実施することで2時間で完了させることが可能です。本手順を行う際は、Hoechstが非常に感度が高く、かつ遺伝毒性を持つこと、また、必要に応じてインキュベーション時間を長くすることで、細胞集団の解像度を向上させることができる点に留意することが重要です。この手順に従い、ハイスループットオミクス法を実施することで、進化的な文脈における哺乳類種のエピジェネティックな修飾や、転写産物およびタンパク質の量と多様性に関する疑問を明らかにすることができます。本手法の開発により、雄性生殖生物学の分野の研究者が、複数の哺乳類種における精子形成の進行を駆動する調節メカニズムを探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、Hoechst FACSのために精巣サンプルを処理する方法、およびHoechstシグナルに基づいて異なる雄性生殖細胞型を同定し、単離する方法について十分に理解できるはずです。HoechstやプロピジウムヨードなどのDNA結合染料は、極めて危険な場合があります。これらの試薬を取り扱う際は、常に個人用保護具を着用してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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機械的組織解離およびフローサイトメトリーによる哺乳動物雄胚細胞のマルチシード精製のための標準的アプローチ

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