ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

この手順の全体的な目標は、成人の骨格筋からヒト筋芽球の純粋な集団を取得することです。これらの細胞は、筋原性分化の評価や店舗運営のカルシウムエントリーの測定などの機能研究に使用されます。この技術の主な利点は、ヒトの初代筋芽細胞を迅速、簡単、かつ再現性よく単離できることです。

これらの筋芽細胞は、筋肉再生中のカルシウムシグナル伝達を研究するための新しい生体外細胞です。この方法は、イオンチャネルや筋肉の分化に関与する転写因子の特定など、筋肉分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法では、ヒトの筋原性分化中の遺伝子機能に関する洞察を得ることができます。

また、筋ジストロフィーの治療に筋原性幹細胞を使用する可能性など、他の研究にも適用できます。筋肉サンプルを滅菌済みの6cmプレートに移し、サンプルをPBSで2回洗浄します。残っている脂肪組織をすべて取り除き、サンプルを秤量します。

次に、トリプシンを加え、筋肉を2ミリメートル未満のサイズに細かく刻みます。ミンチにしたら、10ミリリットルのピペットを使用して、攪拌子が入った200ミリリットルの解離ボトルに組織を移し、解離ボトルが90ミリリットルに満たされるまで、ミンチした組織をトリプシン溶液に収集し続けます。次に、組織を摂氏37度の水浴中で60分間、穏やかに攪拌しながらインキュベー

1時間後、10ミリリットルのFCSを加えて反応を停止し、トリチュレーションを使用して混合物を均質化します。次に、70ミクロンのストレーナを2本の50ミリリットルチューブにロードし、懸濁液をフィルターにピペッティングして、細胞懸濁液の半分を各ストレーナーに通します。次に、成長培地で細胞の懸濁液を作り、4ミリリットルの培地を含む6センチメートルのプレートに200、000個の細胞をプレート

プレートをインキュベートし、3日ごとに培地を交換します。5〜7日後、細胞は70%〜80%コンフルエントになり、その後、それらを染色します。まず、コンフルエントセルのプレートをPBSですすいでください。

次に、1ミリリットルのトリプシン溶液を加え、酵素を3分間働かせます。2ミリリットルの培地を加えて反応を停止し、細胞を15ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞をスピンダウンし、1ミリリットルの培地に再懸濁します。

次に、細胞を氷上に保存しながら細胞数を取ります。ファクト分析のために、それぞれ100, 000個のセルを持つ7本のチューブをロードします。残りのセルを8本目のチューブに入れて選別します。

細胞を1ミリリットルのコールドファックスバッファーで洗浄し、チューブを遠心分離し、上清を吸引して廃棄します。適切な抗体を含む200マイクロリットルのファックスバッファーを再び加え、細胞を氷上で30分間インキュベートします。30分後、細胞を再度洗浄し、500マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁してから、フローサイトメーターを使用して細胞を選別します。

CD45陽性造血細胞を除外した後、CD56の発現に基づいてCD45陰性細胞を分離します。次に、CD34、CD144、およびCD146のCD56陽性集団をゲートします。選別された母集団の一部を再分析し、純度を確認します。

次に、人間の筋芽細胞を引っ張り、5ミリリットルの培地で洗います。次に、それらを1ミリリットルの培地に再懸濁します。懸濁液を4ミリリットルの培地を入れた6センチメートルプレートに移し、プレートを摂氏37度で7%の二酸化炭素とインキュベートします。

この手順では、培養した筋芽細胞を用意し、新鮮なトランスベクション培地を作成します。培地を室温で15〜20分間インキュベートします。培地インキュベーション中に、筋芽細胞を調製します。

まず、PBSで一度すすぎます。次に、接着細胞をトリプシンします。2ミリリットルの培地を追加して反応を停止します。

次に、細胞を50ミリリットルのチューブに集めます。それらをスピンダウンし、1ミリリットルの培地に再懸濁します。各トランスベクションについて、200マイクロリットルの培地に500, 000個の細胞を調製します。

トランスベクション培地500マイクロリットルごとに、200マイクロリットルの細胞アリコートを追加し、ピペットガンの2ストロークのみを使用して混合します。その後、室温で5分間反応を進行させます。5分後、反応を3.5センチメートルの培養皿に移し、それぞれにガラスカバースリップが1枚入っています。

次に、1.3ミリリットルの培地を加えて最終容量を2ミリリットルにし、皿をインキュベートします。分化の48時間後、細胞を免疫染色またはカルシウムイメージングを使用して分析できます。どちらのオプションでも、まず1ミリリットルの室温PBSを使用して細胞を2回慎重に洗浄します。

筋管を取り外すのは避けてください。カルシウムイメージングでは、洗浄した細胞をカルシウム含有培地中の2マイクロモルfura-2 AMと1マイクロモルのトレオン酸で覆います。その後、約30分間インキュベートしてから混合します。

次に、細胞を未修飾のカルシウム含有培地で2回洗浄し、エステル化のために10〜15分間インキュベートします。次に、培養プレートからカバースリップを取り外し、実験チャンバーに取り付けます。カルシウム含有培地をチャンバーにセットし、顕微鏡下に置いてから、データ記録を開始します。

Fura-2は340ナノメートルと380ナノメートルで交互に励起されます。発光光は510ナノメートルで収集されます。380枚の画像で340ナノメートルナノメートルの画像を潜水させ、変動とカルシウム濃度が比較的低いほどの画像比を提供し、2秒ごとに1つの画像比を取得する。

2〜3分後、培地をカルシウムを含まない培地と交換します。次いで、1〜2分間、細胞内の貯蔵操作カルシウムの活性をモニターする。次に、細胞内に蓄積されるカルシウムを1マイクロモルのタプシガルギンに加えます。

8〜10分待ってから、培地をカルシウム含有培地に迅速に交換し、カルシウムが成功チャネルを介して細胞に入る間5分間記録します。実験終了後、画像を解析します。背景を定義する領域1の細胞がない領域を選択し、次に領域2の細胞質の領域を選択します。

2つの領域は、シリーズのどの画像にも描画できます。次に、実験の実行タブに移動し、340チャンネルと380チャンネルの参照画像を選択し、領域1を選択してから、背景の減算をクリックします。次に、実験全体を実行して、すべての画像から背景を削除します。

完了したら、ログデータオプションをクリックして、時間と比率のデータが記録されているスプレッドシートを開きます。筋細胞を増殖させ、増殖させ、ファックスを使用して選別しました。筋芽細胞は、分析された人口の60%以上を占めていました。

次に、初代ヒト筋芽細胞を分化培地で培養し、MEF2およびミオシン重鎖タンパク質の転写因子について免疫染色しました。細胞の大部分はミオシン重鎖を発現し、融合指数値が約60%の筋管を形成し、残りの40%は未分化の単核細胞、予備細胞としても知られていました。記載の店舗運営型カルシウム侵入実験は、分化した細胞に対して成功裏に行った。

TRPCファミリーのカルシウム透過性チャネルに対して、小さな干渉RNAをトランスベクトした細胞に対して同じ実験を行ったところ、ノックダウンが店舗で操作されるカルシウムの侵入に測定可能な影響を与えたことが示されています。このビデオを見た後、成人の骨格筋からヒトの筋芽球を分離する方法を十分に理解しているはずです。これらの細胞を使用して、筋肉の分化の連続的なステップ、特に転写因子とカルシウムチャネルの不活性化を研究しています。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば3時間未満で完了できます。これは、ヒト筋芽細胞の収量を得るための迅速で、簡単で、再現性のある方法です。この手順を試みる際には、筋芽細胞の培養物が完全な信頼性に達するのを防ぐことが重要です。