Name: Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在現場でハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶRNAインサイチュハイブリダイゼーション法でイナゴ触角における低発現嗅覚受容体遺伝子の局在解析。DIGまたはビオチン標識プローブを用いて、神経科学と昆虫生理学における遺伝子発現の可視化技術を習得する。

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この研究は、中国国立自然科学財団（No.31472037）からの助成金によって支えられている。この記事の商号または商用製品についての言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、推薦を意味するものではありません。

注：RNA分解を制限するために、湿式オートクレーブ蒸留水（121℃で60分間）および湿式オートクレーブ材料を使用して溶液を調製します。 RNA ISHアンチセンスプローブおよびセンスプローブの調製<ol><li> 標的遺伝子増幅および精製 <ol><li>断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migratoria OR1（JQ766965 LmigOR1、GenBankの）の387 bpの二本鎖断片を生成します。 <ol><li> 50μLの2x反応混合物、4μLのセンスおよびアンチセンスプライマー（ 表1 ）、1μLのプラスミドテンプレート、および41μLのRNaseフリーH 2 Oを含む100μLの最終反応容量を使用します。以下のPCRプロトコル：94℃で5分間、続いて94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル続いて72℃で10分間インキュベートした。 </li><li>これらのステップを繰り返して、 LmigOR2 （GenBank：JQ766966）の1,303bp二本鎖フラグメントおよびLmigorco （GenBank：JN989549）の1,251bp二本鎖フラグメントを作製する 。これらの実験で使用したプライマーを表1に示す 。 </li><li> 1.2％アガロースゲル上で1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液中でPCR産物を泳動し、エチジウムブロマイド染色を用いて視覚化する。 </li></ol></li><li>これらのPCR産物をゲル抽出キットを用いて抽出する。 <ol><li>電気泳動後、ゲルからDNAバンドを切り出し、ゲルスライスを1.5mLチューブに入れる。次に、0.1 gのゲルスライスあたり100μLの結合バッファー（Buffer PN）を添加する。ボルテックスし、ゲルスライスが完全に溶解するまで50℃でインキュベートする。 </li><li>コレクションチューブにCA2吸着カラムを挿入し、500μLの平衡バッファー（Buffer BL）を添加する。これにより、シリカ膜の吸収能力およ​​び安定性が改善される。セントリ12,400×gで1分間フュージします。 </li><li>溶解したゲル混合物を吸着カラムアセンブリに移し、室温で2分間インキュベートする。次に、チューブを12,400 xgで1分間遠心します。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li> 600μLの洗浄液（エタノール添加、Buffer PW）を2回加える。 12,400×gで1分間遠心分離する。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li>回収チューブを空にし、カラムアセンブリを12,400 xgで2分間遠心分離して、残留エタノールを蒸発させます。 </li><li>慎重に、吸着カラムを清潔な1.5 mL遠心チューブに移す。ペレットを5〜10分間空気乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水の適切な容量（ 例えば、 30μL）でDNAを再溶解する。 </li><li> RTで2分間インキュベートする。 12,400×gで2分間遠心分離する。吸着カラムを捨て、DNAを4℃または-20℃で保存します。 </li></ol></li></ol></li><li> 組換えプラスミドを構築する <ol><li>個別LmigOR1、LmigOR2の1303 bp断片及びT7（上流）及びT4 DNAリガーゼを用いて挿入されたDNAに隣接するSP6（下流）RNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するTベクターへLmigORcoの1,251 bp断片の387 bp断片を連結。以下の10μLの反応液を調製する：2×ライゲーションバッファー5μL、Tベクター1μL、挿入遺伝子DNA3μL（〜100ng）およびT4 DNAリガーゼ1μLを加え、4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を、滅菌1.5mLチューブ中の50μLのコンピテントエシェリヒア・コリ DH5α細胞に別々に含む各組換えプラスミド5μLを加える。 <ol><li>静かに混合し、30分間氷中にチューブを入れ、42℃で90秒間インキュベートする。℃。それらを3分間氷の中に戻す。 </li><li>すべてのチューブにアンピシリンなしルリア-ベルターニ（LB）液体培地450μLを添加し、 大腸菌 DH5αを復元するために、37℃で1時間、150rpmで振とう機でそれらをインキュベートします。 </li><li> 50μg/ mLアンピシリン、24μg/ mLイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）、および40μg/ mL 5-ブロモ-4を含むLB固体基質プレートに接種するために、各形質転換体の100μLアリコートを取り、 - クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）である。 </li><li>これらのプレートを一定のインキュベーター内で37℃で18時間インキュベートする。青 - 白スクリーニング法を用いて標的組換えプラスミドをスクリーニングする。サンガー配列決定を用いて標的組換えプラスミドを配列決定し、3つのOR遺伝子の挿入方向を同定する。 </li></ol></li></ol></li><li> 制限エンドヌクレアーゼを選択して組換えプラスミドを線状化する <ol><li>制限エンドヌクレアーゼの使用ベクターは、ベクターの複数のクローニング部位を消化するだけでなく、挿入DNAを切断しない。この実験では、3つの遺伝子すべてが、ベクターの方向に対応する方向でTベクターに挿入される。 </li><li>アンチセンスプローブを生成するためにLmigOR1の387 bp断片、LmigOR2の1303 bp断片とLmigORcoの1,251 bpの断片を含む組換えプラスミドを線形化するためのNco I制限エンドヌクレアーゼを使用します。 Spe I制限エンドヌクレアーゼを用いてセンスプローブを作製する。 注：挿入方向がベクターの挿入方向と一致する場合、T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。そうでない場合、挿入方向がtに対応しない場合SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。 </li></ol></li><li> 線状化された組換えプラスミドの精製 <ol><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を含む10個の10μLの反応液にNcoI制限エンドヌクレアーゼを用いた3種の組換えプラスミド20μgを10μlの緩衝液、 40μlの0.5μg/μLのプラスミド、 3μLのNcoIおよび47μLのRNaseフリーH 2 Oを添加し、続いて37℃で3時間インキュベートした。 </li><li>同様に、20μgのこれらの3つの組換えプラスミドuSpe I制限エンドヌクレアーゼを歌う。 </li><li>これらの消化したプラスミドを1.1.2に記載のゲル抽出キットを用いて精製する。抽出した線状化組換えプラスミドの濃度を分光光度法で測定し、0.5μg/μLに調整する。 </li></ol></li><li> アンチセンスとセンスプローブの準備 <ol><li> T7 / SP6 RNA転写システムを使用して、アンチセンスプローブおよびセンスプローブを生成する。 SP6 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで鋳型としての線状化組換えプラスミドを用いて、これら3つのOR遺伝子のDIGおよびビオチン標識アンチセンスプローブの二本鎖RNAを転写する。 T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを生成する。 10倍のNTPミックス2μL、10X転写バッファー2μL、RNaseインヒビター1μL、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ2μL、0.5μg/μLの線状化プラスミド4μL、および2μLの線状化プラスミドを含む20μLの最終容量で反応を行い、 9μLのRNaseフリーH 2 O、続いて37℃で3時間インキュベーションすることにより実施した。 </li><li> DIGおよびビオチン標識したアンチセンスおよびセンスプローブを37℃で1μLのDNaseで30分間インキュベートする。 2.5μLの5 M LiClと75μLの無水エタノールを添加し、反応物を-70°Cで30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間、15,000×gで遠心分離する。慎重に上清を傾瀉する。沈殿剤を洗浄するために150μLの70％エタノールを加える。滅菌蒸留水（263.2mL）に95％エタノール（736.8mL）を加えて70％エタノール（1L）を調製する。 </li><li>再び4℃で15,000 xgで30分間遠心分離し、ペレットを室温で5〜10分間風乾します。 25μLのRNaseフリーH 2 Oを添加して、RNAアンチセンスおよびセンスプローブを溶解させます。 </li><li>挿入された遺伝子の長さが1kbより長い場合は、続いて重炭酸塩 - 炭酸塩緩衝液中でのインキュベーションによって〜300bpの平均長さまでプローブRNAアンチセンスおよびセンスプローブを断片化する。 50μLの最終容量で反応を実施する.cRNAプローブのontaining 25μLおよび重炭酸塩-炭酸塩緩衝液25μL（80mMのNaHCO 3を、120mMののNa 2 CO 3、pHは10.2）60℃。必要とされる加水分解時間は、以前に公表された式17によって与えられる。 </li><li> 5μLの10％酢酸を加えて反応を停止する。この実験では、 LmigOR2およびLmigORcoのアンチセンスおよびセンスプローブをそれぞれ24および23分間断片化する。 T =（L 0 -LのF）/ KXL O XL F L oは KB中の初期断片長= L f = kbでの最終断片長さ k =加水分解速度定数、約0.11 kb -1 min -1 t = minにおける加水分解時間</li><li>最後に、250μLのハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、-80℃で保存する。 </li></ol></li></ol> 2.クライオスタットセクションの準備<ol><li>プレクールフリーズミクロトーム、すなわち-24℃。 </li><li>活発で、元のままのアンテナを持っている新しい脱皮成虫のイナゴを選択してください。滅菌カミソリを使用してアンテナを2〜3mmの部分に切断します。 </li><li>凍結ミクロトームホルダーにOCT化合物を入れ、1〜2個のサンプルを化合物上に水平に置く。次にホルダーを-24℃で凍結ミクロトームに移し、化合物が凍結するまで平衡化させます。ホルダーを取り出し、少量の化合物でサンプルを覆います。ホルダーを凍結ミクロトームに-24℃で少なくとも10分間再度移す（ 図1 ）。 注：化合物に泡が入らないようにしてください。 </li><li>サンプルが入ったホルダーを凍結ミクロトームに固定し、凍結したサンプルを-24℃で厚さ12μmの切片に分ける。 </li><li>スライスをスライド（25 x 75 mm;ヌクレアーゼフリー）に1枚ずつ解凍し、10分間風乾します。 </li></ol> 3.固定部<ol><li>クライオスタットを準備した後スライドをプラスチック容器（約100 x 40 x 80 mm）に入れ、スライドを4％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）中で4℃で30分間インキュベートすることによって組織を固定する。 </li><li>スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1分間洗浄する。 </li><li>アルカリ性タンパク質を除去するために、スライドを0.2M HClに10分間移す。 </li><li>核酸の表面タンパク質を除去するために、スライドを1％Triton X-100を含む1XPBSに2分間移す。 </li><li> 1×PBSで30秒間スライドを2回洗浄する。 </li><li>最後に、4℃で10分間ホルムアミド溶液でスライドをすすいでください。 </li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> アンチセンスプローブとセンスプローブの準備 <ol><li>ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、1.5 mLのヌクレアーゼフリーチューブでRNAアンチセンスまたはセンスプローブを希釈します。この実験では、すべてのアンチセンスプローブおよびセンスプローブ（ LmigOR1、LmigOR2、およびLmigOrco ）について、 99μにプローブ1μLを添加するLハイブリダイゼーションバッファーを含む。一般に、アンチセンスプローブの1：100希釈物の使用は、このプロトコールを用いて有意な陽性シグナルおよび低いバックグラウンドを産生する。 </li><li>色素産生検出のために、DIG標識プローブを個別に希釈する。 </li><li> TSA検出のために、ハイブリダイゼーション緩衝液中で一緒にビオチン標識LmigOR1プローブとビオチン標識LmigOrcoプローブまたはDIG標識LmigOR2とDIG標識LmigOR1を希釈します。 </li><li>希釈液を65℃で10分間加熱し、少なくとも5分間氷上に置く。 </li></ol></li><li> ハイブリダイゼーション <ol><li>スライドを排出し、100μLの希釈アンチセンスおよびセンスプローブ（ステップ4.1）を組織切片に加える。次に、組織切片上にカバースリップ（24mm×50mm;ヌクレアーゼフリー）を置く。 </li><li>カバーされたスライドを湿ったボックス（〜300 x 180 x 50 mm 3 ; 図2 ）に水平に置き、t 55℃で22時間。箱の底にホルムアミド溶液または1X PBSを加えて湿らせた状態に保ちますが、スライドを液体に浸しないでください。 </li></ol></li><li> 洗濯およびブロッキング。 <ol><li>ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを注意深く取り除きます。 60℃で0.1×生理食塩水（SSC）中で30分間スライドを2回洗浄する。 注：洗浄とは、スライドホルダーにスライドを入れ、プラスチック容器に入れ、ロッカーでゆっくりかき混ぜることです（約50 rpm、 図2 ）。 </li><li>スライドを30秒間、1×トリス緩衝食塩水（TBS）ですすいでください。 </li><li>各スライド上の0.03％Triton X-100を添加したTBS中の1％ブロッキング試薬1mLを加え、30分間インキュベートする。次に、ブロッキング溶液を捨てる。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学。 <ol><li>色素産生検出のために、TBS中のブロッキング試薬を使用して、750単位（U）/ mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗生物質1.5U / mLのAP溶液に希釈する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP溶液を加える。 </li><li> TSA検出のために、750U / mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗体および抗ビオチンストレプトアビジンHRP結合抗体をAP / HRP溶液に希釈するために、TBS中のブロッキング試薬を使用する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP / HRP溶液を加える。 </li><li>スライドを湿った箱（ 図2 ）にインキュベートし、37℃で60分間インキュベートする。ホルムアルデヒド溶液または1X PBSを使用して、箱をしっとりとした状態に保ちます。 </li></ol></li></ol> 5.染色<ol><li>カバーガラスを注意深く取り外します。 0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。スライドをDAP緩衝液（色素生成検出：pH9.5; TSA検出：pH8.0）で5分間すすぐ。 </li><li> 染色（発色検出） <ol><li> 100μLのNBT（375μg/ mL）/ BCIP（188μg/ mL）基質溶液（DAPで希釈;pH 9.5）を各スライドに添加した。カバーガラス（24 x 50 mm）を注意深くスライドに置きます。 </li><li>スライドを、基質溶液を含む湿った箱に10分間インキュベートする（37℃でO / N）。 注：スライドを顕微鏡で随時見ることで開発を確認してください。 </li><li>展開が完了したら、スライドを水に移すことによって反応を停止する。 </li></ol></li><li> 染色（TSA検出） <ol><li>シリンジフィルター（0.22μm; 図2 ）からHNPP（100μg/ mL）/ Fast Red（250μg/ mL）基質を移動するためにシリンジを使用してください。 </li><li>カバースリップ（24×50mm）で覆われたスライドあたり100μLのHNPP / Fast Red基質を加える。 RTでHNPP / Fast Red基質と30分間スライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1X TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li><li> 100μLのTSA基質/被覆（24×50mm 2 ）スライド。室温で10分間、TSA基質とスライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li></ol></li><li> PBS /グリセロール（1：3）にスライドを埋め込みます。 注：これらの手順を完了した後、蛍光シグナルが急速に消光するため、スライドをできるだけ早く観察する必要があります。 </li></ol> 6.観測<ol><li> クロモジェニック検出 <ol><li>組織切片を光学顕微鏡で観察する。 10X、20X、40Xの対物レンズを選択して、発色検出の結果を観察します。 </li><li> DP-BSWソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li><li> TSA検出 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて組織切片を観察する。 DIG標識遺伝子は543nmの光下で観察され、赤色を呈し、ビオチン標識遺伝子は488nm光下で観察され、緑色を呈する。彼らが出現すると、彼らは黄色を呈する。 </li><li> 20Xと40Xの対物レンズを選択して、それぞれTSA検出の結果を観察します。 </li><li> FV1000ソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li></ol>

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著者は開示すべき事項やその他の利益相反はありません。

ORCO以外のOR遺伝子の発現レベルが非常に低く、昆虫アンテナの組織学的スライスを保存することが非常に困難であるため、昆虫のアンテナでOR遺伝子を局在化するRNA ISHを行うことは困難である。さらに、TSAの検出も非常に難しいです。これらの問題に対処するには、以下の措置を講じる必要があります。アンテナは、スライド上に形態を維持する薄く柔らかい触角鞘を有する新しく成虫の成虫から選択される。凍結サンプルを厚さ12μmのスライスに切る。高感度かつ特異的なビオチン標識プローブおよびDIG標識プローブが使用される。 Tween-20およびTriton X-100などの洗剤は、多くの段階でバックグラウンドを減少させるために使用されます。 TSAの検出では、低発現遺伝子と比較して高発現遺伝子をビオチン-16-UTPで標識する必要があります。蛍光シグナルは急速に消光するため、できるだけ早くスライドを観察する必要があります。 DIG- aNDビオチン標識プローブは、放射性プローブ18、19</s...

最も重要な化学感覚器官である昆虫のアンテナは、嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって神経支配されている多くの髪のような構造（感覚器と呼ばれる）で覆われています。昆虫ORN類の膜上に、嗅覚受容体（ORS）、7つの膜貫通領域を含むタンパク質の種類は、臭気物質依存性イオンチャネル1、2、3として機能するヘテロマーを形成する共受容体（ORCO）で表されます。異なる論理和は、化学化合物4、5、6の異なる組み合わせに応答します。 Locusts（ Locusta migratoria ）は、主に嗅覚の手掛かりに基づいて重要な行動を誘発します7 。 Locust ORは、分子嗅メカニズムを理解するための重要な要素です。特定のイナゴまたは遺伝子をaのニューロンに局在化させるRNAによる形態特異的な感覚型RNA in situハイブリダイゼーション（RNA ISH）は、ORs機能の探索の第一歩である。 RNA ISHは、標識された相補的RNAプローブを使用して、組織、細胞または全身の部位の特定のRNA配列をインサイチュで測定し、局在化させ、生理学的プロセスおよび疾患の病因への洞察を提供する。ジゴキシゲニン標識（DIG標識）およびビオチン標識RNAプローブは、RNAハイブリダイゼーションにおいて広く使用されている。ジゴキシゲニン-11-UTPまたはビオチン-16-UTPによるRNA標識は、SP6およびT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって調製することができる。 DIGおよびビオチン標識RNAプローブは以下の利点を有する：非放射性;安全;安定した;高感度;非常に特異的。 PCRおよびインビトロ転写を使用して産生が容易である。 DIGおよびビオチン標識されたRNAプローブは、色原体および蛍光で検出することができます。 DIG標識されたRNAプローブは、抗ジゴキシゲニンアルカリ高感度化学発光基質ニトロブルーテトラゾリウムクロライド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェートトルイジン塩（NBT / BCIP）、または光学顕微鏡を使用して2つの視覚化できるホスファターゼ（AP）共存顕微鏡を用いて4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ - 塩化亜鉛塩（ファストレッド）とカップリングした4-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2&#39;-フェニルアニリドリン酸塩（HNPP）ビオチン標識RNAプローブは、共焦点顕微鏡を使用してフルオレセイン - チラミドで視覚化することができる抗ビオチンストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） - コンジュゲート抗体で検出することができる。したがって、二色蛍光in situハイブリダイゼーションを実施して、DIGおよびビオチン標識RNAプローブを用いて、1つのスライス中の2つの標的遺伝子を検出することができる。 DIGおよび/またはビオチン標識プローブを用いたRNA ISHは、嗅覚関連遺伝子、例えばOR 、イオノトロピック受容体、匂い物質結合タンパク質感覚ニューロン膜タンパク質、 キイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、L.のmigratoriaと砂漠バッタSchistoceraグレガリア 8、9、10、11、12、13、14、15、16、これらに限定され昆虫のアンテナではなく、です。 （1）OR遺伝子（ ORcoを除く）が低レベルで、少数の細胞でのみ発現され、シグナル検出を非常に困難にし、（2）昆虫組織を保存するためのRNA ISHを行う際に、2つの大きな課題がある。形態学が保存され、背景雑音が低いような組織学は、困難であり得る。この論文では、昆虫におけるOR遺伝子の局在化のためのRNA ISHを説明する詳細で効果的なプロトコル発色およびTyramide Signal Amplification（TSA）検出の両方を含むアンテナが提示されます。

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&times;TSINGKETM Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H2O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN、中国</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td>TIANgel Midi精製キット、TIANGEN、中国</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Tベクター</td><td>プロメガ、米国</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>プロメガ、米国</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coliDH5&alpha;</td><td>天元、中国</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ、米国</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &beta;-D-1-チオガラクトピラノシド</td><td>イナルコ、米国</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-&β;-D-ガラクトピラノシド</td><td>SBS Genetech、中国</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>Nco I</td><td>BioLabs、ニューイングランド</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>Spe I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sinopharm、中国</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY、中国</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT化合物</td><td>Sakura Finetek Europe、Zoeterwoude、オランダ</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO.、LTE、中国</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm、中国</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue テトラゾリウムクロリド / 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸トルイジン塩</td><td>ロシュ, スイス</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社<</td><td>strong>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&times;トリス-アセテート-EDTA</td><td>シグマ、米国</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L トリスベース</td></tr><tr><td>1&times;トリス-アセテート-EDTA</td><td>北京化学リージェンツ会社、中国</td><td>10000292</td><td>0.12%酢酸</td></tr><tr><td>1倍;トリス酢酸EDTA</td><td>シグマ、米国</td><td>03677エ</td><td>チレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩(EDTA)</td></tr><tr><td>ルリアベルタニ(LB)液体培地</td>シ<td>ノファーム、中国</td><td>10019392</td><td>10 g / L NaCl</td></tr><tr><td>ルリアベルタニ(LB)液体培地</td><td>メルク、ドイツ</td><td>VM335231</td><td>10g / Lカゼイン(トリプトン)</td></tr><tr><td>ルリアベルタニ(LB)液体培地</td><td>メルク、ドイツ</td><td>VM361526</td><td>5g / L酵母抽出物</td></tr><tr><td>LB固体基板プレート</td><td>シノファーム、中国</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB固体基板プレート</td><td>MERCK、ドイツ</td><td>VM335231</td><td>10 g/L カゼイン(トリプトン)からのペプトン</td></tr>LB<tr><td>固体基板プレート</td><td>MERCK、ドイツ</td><td>VM361526</td><td>5 g/L 酵母抽出</td></tr><tr><td>物 LB固体基板プレート</td><td>WISENT ING、カナダ</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L 寒天細菌学グレード</td></tr><tr><td>10回;リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.1)</td><td>シノファーム、中国</td><td>10019392</td><td>8.5%NaCl</td></tr><tr><td>10&times;リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.1)</td><td>Sigma、USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH2PO4</sub</td></tr><tr><td>>10&times;リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na2HPO4</td></tr><tr><td>10&times;トリス緩衝生理食塩水(TBS、pH 7.5)</td><td>シグマ、米国</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M トリス塩基</td></tr><tr><td>10回;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>中国シノファーム</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>検出バッファー(DAP) &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;発色検出 pH 9.5&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TSA検出 pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;発色検出 pH 9.5&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TSA 検出 pH 8.0</td><td>シノファーム、中国</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>検出バッファー (DAP) &nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;発色検出 pH 9.5&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;TSA検出 pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl2&middot;6H2O</td></tr><tr><td>20回;生理食塩水-クエン酸ナトリウム(pH 7.0)</td><td>Sinopharm、中国</td><td>10019392 3</td><td>M NaCl</td></tr><tr><td>20&times;生理食塩水-クエン酸ナトリウム (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Nadium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO3</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム緩衝液(pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na2CO3</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&times;TBSロシュ、スイスの生理食塩水-クエン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td></td><td>11175041910</td> TBSアムレスコの<td>1%ブロット</td></tr><tr><td>ブロッキングバッファー</td><td>、米国</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% TBS</td></tr><tr><td></td><td></td>のトリトンX-100<td>ブロッキングバッファー</td><td>1&times;トリス緩衝生理食塩水</td></tr>アルカリ<tr><td>ホスファターゼ溶液</td> ロ<td>シュ、</td><td>スイス 11175041910</td><td>1.5 U/mL 抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ標識抗体</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ溶液</td><td></td><td></td><td>TBS中のブロッキングバッファー</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ/セイヨウダイオスワサーゼペルオキシダーゼ溶液</td><td>ロシュ、</td><td>スイス 11175041910</td><td>1.5 U/mL 抗ジゴキシゲニンアルカリホスファターゼ結合抗体</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ/西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液</td><td>TSAキット、Perkin Elmer、米国</td><td>NEL701A001KT</td><td>1%抗ビオチンストレプトアビジンワサディッシュペルオキシダーゼ-標識抗体</td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ/ワサビペルオキシダーゼ溶液</td><td></td><td></td><td>TBS</td></tr><tr><td></td><td>ハイブリダイゼーション</td><td>バッファーMPBIOのブロッキングバッファー MPBIO、米国</td><td>FORMD002 50%脱イオンホルムアミド</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファ</td><td></td><td></td><td>2&times;生理食塩水-クエン酸ナトリウム</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファーSigma</td><td>、米国</td><td>D8906-50G</td><td>10%デキストラン硫酸</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファーinvitrogen</td><td>、米国</td><td>AM7119</td><td>20 & micro;g/mL 酵母 t-RNA</td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションバッファー</td><td>シグマ、米国</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL ニシン精子 DNA</td></tr><tr><td>2-ヒドロキシ-3-ナフト酸-2'-フェニルアニリドリン酸/ 4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウム ヘミ-塩化亜鉛塩基質</td><td>スイス、ロシュ</td><td>11758888001</td><td>1% 2-ヒドロキシ-3-ナフト酸-2'-フェニルアニリドリン酸 (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-ヒドロキシ-3-ナフト酸-2'-フェニルアニリドリン酸/ 4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ-塩化亜鉛塩基質</td><td>ロシュ、スイス</td><td>11758888001</td><td>1% 4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ-塩化亜鉛塩 (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-ヒドロキシ-3-ナフト酸-2'-フェニルアニリドリン酸/ 4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ-塩化亜鉛塩基質</td><td></td><td></td><td>検出バッファー</td></tr><tr><td>チラミドシグナル増幅基質</td><td>TSAキット、Perkin Elmer、米国</td><td>NEL701A001KT</td><td>2%フルオレセインチラミド</td></tr><tr><td>チラミド信号増幅基質</td><td>TSAキット、Perkin Elmer、米国</td><td>NEL701A001KT</td><td>増幅希釈液</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結ミクロトーム</td><td>ライカ、ヌスロッホ、ドイツ</td><td>ユングCM300 クライオスタット</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>オリンパス、東京、日本</td><td>オリンパス IX71顕微鏡</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンパス、東京、日本</td><td>オリンパスBX45共焦点顕微鏡</td><td></td></tr></tbody></table>

locust antennaeにおけるrnaによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

昆虫は、外因性の化学信号を感知するための洗練された嗅覚受容系を進化させてきた。これらの化学シグナルは、アンテナのケモソーム（chemosensilla）と呼ばれる髪のような構造に収容された嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって形質導入される。 ORNの膜上で、嗅覚受容器（OR）は匂いのコード化に関与していると考えられている。したがって、OR遺伝子に局在する遺伝子を同定できることは、OR遺伝子を認識するために必要であり、さらなる機能的in situ研究の基礎を提供する。昆虫のアンテナにおける特定のORのRNA発現レベルは非常に低く、組織学的に昆虫組織を保存することは困難である。したがって、RNA in situハイブリダイゼーションを使用して特定タイプの感覚器にORを局在化することは困難である。この論文では、特に昆虫の低発現OR遺伝子のための詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコールが導入されている。さらに、特定のOR 遺伝子WAOrcoをマーカーとして共発現する受容体遺伝子を用いた二重蛍光蛍光in situハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定された。

色素産生の検出では、すべての成人の触角部分における触角細胞の小さなサブセットを、DIG標識LmigOR1およびLmigOR2アンチセンスプローブで示した（ 図3 ）。 LmigOR1とLmigOR2を局在化するために連続切片上のRNA ISHは、二つの遺伝子を発現する触角細胞が推定LmigOR1とLmigOR2が実際ORN類（ 図4aの -4D）で発現させたことを示す、LmigORcoを発現ORNクラスターに位置していたことを示しました。場合によっては、標識された樹状様構造が視覚化された（ 図 4e〜4f ）。 LmigOR1とLmigOR2は、両方ともbasiconi...

この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

この手順の全体的な目標は、ジゴキシゲニン標識プローブまたはビオチン標識プローブを使用して、昆虫のアンテナ内の低レベルで発現する匂い受容体遺伝子およびその他の遺伝子を局在化することです。この手順を開始するには、活動的で触角が無傷の新しい脱皮成虫バッタを選択し、滅菌カミソリを使用して触角を2〜3ミリメートルの断片に切断します。次に、OCT化合物を凍結ミクロトームホルダーに塗布し、サンプルを化合物に水平に置きます。ホルダーをマイナス24°Cの凍結ミクロトームに移し、化合物が凍結するまで平衡化します。その後、ホルダーを取り出し、サンプルを少量の化合物で覆います。ホルダーをマイナス24°Cの凍結ミクロトームに再度10分間少なくとも10分間移し、凍結したサンプルを12マイクロメートルの厚さのスライスに切片化します。その後、スライドで1枚ずつ解凍し、10分間風乾します。クライオスタット切片を調製した後、スライドをプラスチック容器に入れ、スライドを4%PFA溶液で摂氏4度で30分間インキュベートして組織を固定します。30分後、スライドを1つのX PBSで1分間洗浄します。アルカリ性タンパク質を除去するには、スライドを0.2モル塩化水素に10分間移し、次にスライドを1%Triton X-100を含む1つのX PBSに2分間移し、核酸の表面タンパク質を除去します。次に、スライドを1つのX PBSで30秒間2回洗浄します。その後、スライドをホルムアミド溶液で摂氏4度で10分間すすぎます。スライドを排出し、希釈したアンチセンスプローブとセンスプローブ100マイクロリットルを追加し、カバースリップを組織切片に置きます。その後、ホルムアミド溶液またはX PBSを箱の底に追加して、環境を湿らせますが、スライドを液体に浸さないでください。その後、蓋をしたスライドを湿った箱に水平に置き、摂氏55度で22時間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後、カバースリップを慎重に取り外します。ロッカーで0.1 X SSCを60°Cで30分間静かに攪拌して側面を2回洗い、次に1つのX TBSで30秒間スライドをすすぎます。各スライドに0.03%Tritin X-100を添加したTBS中の1%ブロッキング試薬1ミリリットルを添加し、30分間インキュベートします。その後、ブロッキング溶液を廃棄します。発色検出には、TBS中のブロッキング試薬を使用して、750単位/ミリリットルの抗ジゴキシゲニン-AP標識抗体を1ミリリットルあたり1.5単位に希釈します。続いて、100マイクロリットルのAP溶液を各カバースライドに加えます。TSA検出では、TBS中のブロッキング試薬を使用して、1ミリリットルあたり750ユニットの抗ジゴキシゲニン-AP標識抗体および抗ビオチンストレプトアビジンHRP標識抗体をAP HRP溶液に希釈し、100マイクロリットルのAP HRP溶液を各カバースライドに添加します。ホルムアミド溶液またはX PBSを1つ加えて、ボックスを湿らせますが、ねっとりしないようにします。その後、スライドを湿った箱の中で摂氏37度で60分間インキュベートします。ロッカーに0.05%TWEEN 20を添加した1つのX TBSでスライドを5分間3回洗浄します。その後、プラスチック容器をロッカーに置き、穏やかに攪拌してスライドをDAPバッファーで5分間すすぎます。発色検出には、各スライドに100マイクロリットルのNBT/BCIP基質溶液を添加します。カバースリップをスライドに慎重に置き、次にスライドを基質溶液を入れた湿ったボックスでスライドを摂氏37度で10分間から一晩インキュベートします。顕微鏡で時々スライドを見て、展開を確認してください。現像の準備ができたら、スライドを水に移して反応を停止します。TSA検出では、シリンジを使用してHNPP/Fast Red基板をシリンジフィルターから移動させ、カバースリップで覆われた各スライドに100マイクロリットルのHNPP/Fast Red基板を追加します。その後、スライドをHNPP/Fast Red基質と室温で30分間インキュベートします。30分後、カバースリップを慎重に取り外し、0.05%TWEEN 20を添加した1つのX TBSでスライドを5分間3回洗浄します。カバー付きスライドあたり100マイクロリットルのTSA基質とスライドを室温で10分間インキュベートします。カバースリップを慎重に取り外し、0.05%TWEEN 20を添加した1つのX TBSでスライドを5分間3回洗浄してから、スライドをPBSグリセロールに埋め込みます。発色検出のためには、光学顕微鏡を用いて組織切片を観察します。ここに示されているのは、ローカストアンテナの連続セクション上のLmigOR1およびLmigORcoアンチセンスプローブのラベリングパターンです。これは、ローカストアンテナの連続したセクション上のLmigORcoおよびLmigOR2アンチセンスプローブのラベリングパターンです。時々ラベル付けされる樹状突起のような構造の図をここに示します。TSA検出には、共焦点顕微鏡を使用して組織切片を観察します。ここでは、LmigOR1とLmigORcoの発現を示すために、縦方向の触角部分で2色のin situハイブリダイゼーションを行いました。LmigORcoを発現する細胞クラスターにおけるLmigOR1発現細胞の局在により、その神経同一性が確認され、ここでは四角形の領域を詳しく見ています。時折ラベル付けされた樹状突起様構造は矢印で示され、丸で囲まれた領域は、LmigORcoを発現し、同じ感覚を共有する嗅覚受容体ニューロンクラスターを示しています。

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。...

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

ここでは、ショウジョウバエのアンテナの全マウント免疫染色のプロセスについて説明し、これにより、嗅覚受容体ニューロン(ORN)の多様化に関与する分子メカニズムをよりよく理解することができます。...

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

私たちは、自律型ロボットで昆虫の触角を電気アンテナ図(EAG)の形で使用するためのプロトコルを記述します。当社の実験設計により、1日以内に安定した録音が可能になり、最大10Hzの個々の臭気パッチを解決します。嗅覚検索のためのEAGセンサーの効率は、ロボットを臭気源に向かって運転することで実証されています。...

嗅覚検索用自律型ロボットに昆虫Electroantennogramセンサを用いた

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

トコジラミは、触角の嗅覚感覚に収容された嗅覚受容体ニューロンに依存して、環境中の記号化学物質を検出します。シングルセンシラム記録を利用して、セミオケミカルに対するトコジラミの反応を評価する方法を示し、関連するコーディングプロセスを探求します。...

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

ここでは、ステージし、解剖ショウジョウバエ種から嗅覚の組織を開発するためのプロトコルを提案する.解剖組織は、免疫組織化学または上皮内などの生体内解析だけでなく、定量的 RT-PCR (逆転写ポリメラーゼ連鎖反応) や RNA 配列 (RNAseq)...

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

昆虫の口器の palps で単一ゴキブリ触角 basiconica...

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

本研究では、シルクモスアンテナを用いたバイオハイブリッド臭気検出ドローンの実験プロトコルを紹介する。シルクモスアンテナを用いた実験的な電気アンテノーグラム装置の動作は、スパイラルサージアルゴリズムを用いて臭気源局在化用に設計されたバイオハイブリッドドローンの構造に加えて提示される。...

電気解析ベースのバイオハイブリッド臭気検出ドローンは、臭気源の局在化のためのシルクモスアンテナを用いた

本稿では、ハイブリダイゼーション、連鎖反応、RNA、ホールマウント蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(HCR、RNA、WM-FISH)を行い、蚊の触角と上顎触覚における化学感覚受容体遺伝子の空間的および細胞的分解能に関する洞察を明らかにするために必要な方法と試薬について説明します。...

ハイブリダイゼーション連鎖反応RNAホールマウント蛍光 蚊の嗅覚付属器における化学感覚遺伝子の in situ ハイブリダイゼーション

このプロトコルは、非放射性の関係...

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

学ぶRNAインサイチュハイブリダイゼーション法でイナゴ触角における低発現嗅覚受容体遺伝子の局在解析。DIGまたはビオチン標識プローブを用いて、神経科学と昆虫生理学における遺伝子発現の可視化技術を習得する。

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在

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