Name: スマートフォンによるDNA断片分離のリアルタイム追跡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶSNAPゲル電気泳動法によるDNA断片分離のリアルタイム追跡。スマートフォンを用いて50〜1000塩基対のDNA断片を可視化し、化学薬品消費と実験時間を大幅に削減する革新的な生化学分析手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

中国国立自然科学財団（No 21205078）と中国高等教育博士号プログラム（No.20123120110002）の支援を感謝します。この研究は、中国の国家主要研究開発計画（2016YFB1102303）、中国の国家基礎研究計画（​​973プログラム2015CB352001）、および中国国立自然科学財団（61378060）によって部分的に支持された。

1. SGEチップの基本設計<ol><li>ポリメタクリル酸メチル（PMMA）やポリカーボネートなどの透明プラスチックを使用してください。 注：SGEチップは図1Bに示されています。 SGEチップは、TBEバッファー用の円筒状の穴と、DNA分離用のチャンネルと、電極用の穴に沿って埋め込まれた2つのレーンとからなる。 </li><li>レーザー彫刻機を使用して、PMMAブロック内のSGEチャネルのアレイを製作します。 注：チップの幾何学的パラメータは、分離されるべきDNAのサイズに依存する。例えば、DNAフラグメントが1,000bpよりも小さい場合、SGEチップの最適なチャネルパラメータは、2.5mm×4.0mm×90mm（幅×奥行き×長さ）である。 </li><li> SGEデザインに基づいて、DNAサンプルをロードするためのチップ内にウェルを作成するために櫛を作製する。 </li></ol> 2.アガロースゲルの調製<ol><li> 10×TBE（1×TBE =89mMのトリス、89mMのホウ酸、および2mMのEDTA; pH 8.4）および蒸留水を1:19の比で含む。 </li><li> 100-bp DNAラダーを分離するために1.0％アガロースゲルを調製する。 注：0.5×TBE緩衝液中のアガロースの濃度は、分離すべきDNA断片のサイズに依存する。 </li><li>フラスコに0.1gのアガロースを入れ、0.5x TBE緩衝液10mLを加える。 備考：調製した溶液の容量は、フラスコの容量の1/3未満でなければならない。 </li><li>フラスコを保存用フィルムでシールし、次いで、アガロース/緩衝液混合物をマイクロ波（培地、1.0分）中で加熱する。フラスコをマイクロ波に入れる前に、爆発の場合には防腐膜に穴をあけてください。 </li><li>融解したアガロース溶液2.7 mLをSGEチップの4チャンネルに注ぎます。櫛をアガロース溶液に入れてウェルを作成します。 注：融解したアガロース溶液は、室温で3分後にゲル状態に冷却される。 </li><li> gから櫛を取り除くゲルを覆うため0.9mLの0.5×TBE緩衝液を添加する。 </li></ol> 3. SGEチップにおける電気泳動の実行<ol><li> LED光源を点灯させ、425〜505 nmのバンドパスフィルターを光源の上に置きます。 </li><li>ボルテックス装置を用いて14.4μLの100 bp DNAラダーと1.6μLのSYBR Greenを混合する。 </li><li> 4μLの混合液をSGEチップのアガロースゲルの各ウェルにロードします（ 図2 ）。 </li><li>電極をSGEチップの2つのレーンに入れます。 </li><li> SGEチップの上に550〜700 nmのバンドパスフィルタを配置します。 </li><li>電源を入れます。電圧は180V（20V / cm）に設定してください。スマートフォンをオンにしてDNA断片分離プロセスを記録します（ 図3 ）。 </li><li> 10分後に電気泳動が終了したら、電源とLEDライトをオフにします。 </li><li> SGEチップを清掃してください。 </li></ol>

<ol><li>Carle, G. F., Olson, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+chromosomal+DNA+molecules+from+yeast+by+orthogonal-field-alternation+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis.</a> Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).</li>
<li>McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+restriction+fragments+of+T7+DNA+and+determination+of+molecular+weights+by+electrophoresis+in+neutral+and+alkaline+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels.</a> J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).</li>
<li>Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+very+large+DNA+molecules+by+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic.+Acids.+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis.</a> Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).</li>
<li>Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.1150080203/abstract">Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels.</a> Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).</li>
<li>Gödde, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+DNA+in+human+genetic+diagnostics-state-of-the-art%2C+alternatives+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects.</a> Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+bacteriophage+T7+early+RNAs+and+proteins+on+slab+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels.</a> J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).</li>
<li>Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+slab-gel+electrophoresis+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Agarose slab-gel electrophoresis equipment.</a> Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).</li>
<li>Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+gel+electrophoresis+in+proteomics%3A+Past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future.</a> J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Gasser, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+conformation+polymorphism+%28SSCP%29+for+the+analysis+of+genetic+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation.</a> Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).</li>
<li>Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+cyanine+dyes+with+nucleic+acids%3A+XXXI.+Using+of+polymethine+cyanine+dyes+for+the+visualization+of+DNA+in+agarose+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Methods%22%5BJournal%5D)">Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels.</a> J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).</li>
<li>Lunn, G., Sansone, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethidium+bromide%3A+destruction+and+decontamination+of+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions.</a> Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).</li>
<li>Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+electrophoresis+of+RNA+in+hydroxyethylcellulose+polymer+with+various+molecular+weights%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chormatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights.</a> J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).</li>
<li>Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2016/AY/C5AY02705E#!divAbstract">Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis.</a> Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+fluorescence-coupled+capillary+electrophoresis+based+method+to+probe+interactions+between+QDs+and+colorectal+cancer+targeting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides.</a> Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+capillary+electrophoresis+method+to+explore+the+self-assembly+of+a+novel+polypeptide+ligand+with+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots.</a> Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).</li>
<li>Miao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468616300342">Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA.</a> Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).</li>
<li>Heller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+DNA+separation+with+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Principles of DNA separation with capillary electrophoresis.</a> Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

アガロースゲル電気泳動は、DNA、RNAおよびタンパク質の分離に広く用いられている。この研究は、伝統的なゲル電気泳動プロトコルを置き換える新しい方法を提案している。結果は、50,100,1000bpのDNAラダーが、このように小型の組立装置で良好に分離できることを示している。この方法の大きな利点は、化学的消費の少ない核酸を分離できるだけでなく、分離プロセスも記録できることである。 図2ではDNA断片が広く見えますが、SGEチップのパラメータとアガロースゲルの濃度を最適化することで結果を改善できます。さらに、チップ内でプレキャストゲルを使用する場合、SGEプロセスの総量は10分を超えません。 チップ内のチャネル幅を変更すると、DNAラダーの分離性能が大きく異なる。例えば、1000 bpのDNAラダーを分離すると、DNAバンドはチャネルの幅は小さい。これはおそらく、アガロースゲル中のジュール加熱が非常に高く、分離性能に影響を及ぼすためである。 ここで提案されているSGE法...

<html>スラブゲル電気泳動（SGE）は、DNA断片分離1,2,3,4,5に最も有効な方法であり、生化学的および生物学的分析における多目的ツールであると考えられている6,7,8。しかし、多くの実験では、SGEが以下の4つの問題によって制限されていることが示されている。（1）分離に数時間および数日かかる。 （2）化学消費量が非常に高い。 （3）複雑な装置（ 例えば、 2D電気泳動セル、電気泳動電源、およびゲルイメージングシステム）を必要とする。 （4）ゲルイメージングシステムは、実験が終了したときにのみ、分離されたDNA断片を観察することができる。さらに、SGE9で一般的に使用されている臭化エチジウム（EtBr）は、突然変異原性であり、発癌性である11,12 。従って、EtBrを含むゲルを手渡すときは常に手袋を着用しなければならない。 キャピラリー電気泳動（CE）には、自動操作、短時間の分離、低消費など、SGEと比較して13,14,15,16,17の利点があります。しかし、CE機器は非常に高価です。従って、これらの制限を克服するために、DNAの分離のためのシステムが開発されている（ 図1 ）。このようなシステムは、化学物質の消費を大幅に削減し、SGE実験時間（8分未満）を節約するだけでなく、スマートフォンによるアガロースゲル中のDNA分離プロセスのリアルタイム追跡も行うことができる。このプロトコルに記載されている手順に従って、SGEチップの設計と製作、チップ内でのアガロースゲルの調製、スマートフォンによるシンプルなSGEシステムのセットアップ、アガロースゲルへのDNAマイグレーションプロセスの記録が可能です。

<table><tbody><tr><td>10回;TBE</td><td>北京ソーラーバイオサイエンス&テクノロジー株式会社</td><td>T1051</td><td></td></tr><tr><td>50 bp DNAラダー</td><td>タカラバイオ(株)</td><td>3421A</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNAラダー</td><td>タカラバイオ(株)</td><td>3422A</td><td></td></tr><tr><td>1 kbp DNAラダー</td><td>タカラバイオ(株)</td><td>3426A</td><td></td></tr><tr><td>SYBR GREEN</td><td>タカラバイオ(株)</td><td>5760A</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ-アルドリッチコーポレート</td><td>V900510</td><td></td></tr></tbody></table>

スマートフォンによるdna断片分離のリアルタイム追跡

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

スラブゲル電気泳動（SGE）は、DNAフラグメントの分離のための最も一般的な方法である;生物学などの分野に広く応用されている。しかし、従来のSGEプロトコルは非常に面倒であり、実験には長い時間がかかります。さらに、SGE実験における化学消費は非常に高い。この研究は、SGEチップに基づくDNA断片の分離のための簡単な方法を提案する。チップは彫刻機で作られています。 2つのプラスチックシートが、光信号の励起波長および発光波長に対して使用される。 DNAバンドの蛍光シグナルはスマートフォンで収集されます。この方法を検証するために、50,100および1,000bpのDNAラダーを分離した。この結果は、この方法を使用する場合、従来のSGE法の理想的な代替物であることを示しており、5,000bpより小さいDNAラダーが12分以内に高分解能で分離できることを示している。

<html> 図4 、 図5および図6は、 50,100および1,000bpのDNAラダーのゲル電気泳動後の典型的な結果を表す。実験後、DNA断片は十分に分離されていた。さらに、同じサンプルをSGEチップの4チャンネルで分離したところ、同じサイズのDNA断片が各実験において同じ距離を移動することが示された。 DNAラダーの分離性能は、移動距離とDNAサイズの対数の関係を分析することによって評価することができる。したがって、未知のDNA断片のサイズの計算にSGEを適用することができる。 図3において、DNAサイズが700bpより小さい場合、移動距離はDNAサイズの対数に直線的に関連することが見出された。 <html> jpg &quot;/&gt; 図1</st...

伝統的なスラブゲル電気泳動（SGE）実験は、複雑な装置および高い化学消費を必要とする。この研究は、短い時間枠内でDNA断片を分離する低コストの方法を記載したプロトコールを提示する。

スマートフォンによるDNA断片分離のリアルタイム追跡

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

本稿では、SNAPゲル電気泳動に関する新しいシステムを紹介します。このシステムは、化学的なコンセプト実証実験の時間を大幅に短縮できるだけでなく、スマートフォンを用いてアガロースゲル内での分離をリアルタイムで追跡することが可能です。これら3枚の写真は、ラダーにおける50 bp、100 bp、1,000 bpのゲル電気泳動後の典型的な結果を示しています。各DNA断片が十分に分離されました。SNAPゲル電気泳動はDNA断片を分離するための極めて革新的な手法であり、生化学および生物学的分析における優れた指導的手法であると考えられています。今回は、SNAPゲル電気泳動実験の新しい方法について解説します。それでは、開始します。まず、0.1 gのアガロースゲルを量り取ってフラスコに入れ、そこにTPEバッファーを加えます。調製した溶液の量は、フラスコの容量の3分の1以下にする必要があります。保存用パラフィルムでフラスコを密閉し、アガロース緩衝液混合物を電子レンジで加熱します。爆発を防ぐため、フラスコを電子レンジに入れる前に、パラフィルムにいくつか穴を開けます。準備したアガロース溶液をSNAPゲル電気泳動チューブのチャネル内に注入します。コームを溶液の中に置きます。設置した溶液は室温で数分後に冷却され、ゲル状態になります。コームを取り出してウェルを作成し、TBE Bufferを加えてください。スマートフォンでDNA断片の運動状態を観察するために、簡便なリアルタイム追跡DNA断片分離システムを構築しました。まず、DNAラダーとSYBR Green Oneを混合し、遠心分離します。次に、その混合液をアガロースゲルのウェルにロードします。次に、LED光源を点灯させ、LEDの上にバンドパスフィルターを配置し、電極をチップの2つのレーンに挿入します。続いて、その上に別のバンドパスフィルターを配置します。電源が入るまで待ちます。電力を180 wattに設定します。スマートフォンを起動し、DNA断片の分離過程を録画します。例として、ここではスマートフォンを用いて50 base pairs DNA ladderの分離を追跡します。SNAPゲル電気泳動は、DNA断片を分離するための最も効果的な方法です。しかし、過去の実験結果から、SNAPゲル電気泳動は全長の制限による問題があることが示されています。一つ目は、分離に数時間、あるいは数日かかることです。2点目に、化学的な感度が非常に高いことです。3点目に、多くの装置を必要とすることです。4点目に、ゲルイメージングシステムでは、実験終了後にのみ分離したDNA断片を観察できることです。さらに、SNAPゲル電気泳動で一般的に使用されるイリジウムおよび臭素は、変異原性と発がん性を有しています。実験後、各DNA断片は十分に分離されました。また、同一のサンプ

real-time-tracking-of-dna-fragment-separation-by-smartphone

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

この動画では、全自動キャピラリー電気泳動を用いて、無細胞DNAまたはcfDNA断片のサイズ分布を解析しています。この手法は、アポトーシス中にがん細胞によって放出されるDNA断片のプロファイルに関する洞察を得るのに役立ちます。...

自動キャピラリー電気泳動に基づくcfDNAのフラグメントサイズ分布解析:DNAマイクロチップを用いた生体液から単離されたDNAフラグメントのサイズ分布の研究法

このビデオでは、PCRアンプリコンをサイズに基づいて分離するマイクロ流体キャピラリー電気泳動技術について説明しています。この手法は、蛍光色素と標準的な分子サイズマーカーを使用したフラグメントサイジングに役立ちます。...

PCR産物のフラグメントサイジングのためのマイクロ流体キャピラリー電気泳動:サイズに基づいてDNAフラグメントを分離するためのマイクロチップベースの電気泳動分離技術

ここでは、の回復を可能にするために、一緒にワンステップ5μlのマイクロボリューム溶解/ STR増幅を含む強化された増幅プロトコルで、サンプル「DNA触れる」を中に存在するバイオ粒子の収集のために最適化され、効率的な除去戦略を説明短いタンデムリピート（STR）バイオ粒子ドナー（単数または複数）のプロファイル。...

法医学インチタッチDNA」の証拠から簡体マイクロマニピュレーションにより回収する単一のヒト生体粒子の強化された遺伝解析

このプロトコルは、DNA 分子の一次元 (1 D)...

シンプルで堅牢、かつ高スループットの単一分子 DNA 分子の輸送を研究するためのストレッチ法の実装を流れ

この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。...

In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット...

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

蛍光共鳴エネルギー移動に基づくリアルタイム観察システム DNA のストランドの Rad51...

Rad51 を介した DNA 鎖交換反応のリアルタイム観察

ここでは、上皮細胞DNAからVNTR遺伝子座 D1S80 を増幅することによりDNAフィンガープリントプロファイルを生成する簡単なプロトコルについて説明する。...

D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリントのラボクラスへの応用

この論文では、ブラッドフォードアッセイとスマートフォンを分析デバイスとして使用したタンパク質定量のためのプロトコルを提供します。サンプル中のタンパク質レベルは、スマートフォンで撮影したマイクロプレートの写真から抽出したカラーデータを使用して定量化できます。...

RGBradford:スマートフォンカメラによるタンパク質定量(英語)

このプロトコルは、CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しのライブ可視化のための単一分子アッセイの実施を示しています。(1)DNA基質の調製、(2)蛍光標識 されたDrosophila melanogaster...

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

信頼性が高く正確な現場展開可能なDNA分析は、多くの産業にとって非常に重要です。本論文では、現場での環境微生物分析のための2つの方法を提案します。1) 生物学的抽出フィールドキットを用いた環境サンプルから微生物DNAを分離する方法、2) フィールドqPCRユニットを用いたDNA解析です。...

生物学的抽出フィールドキットとフィールドqPCRユニットを用いた現地での微生物DNA解析

学ぶSNAPゲル電気泳動法によるDNA断片分離のリアルタイム追跡。スマートフォンを用いて50〜1000塩基対のDNA断片を可視化し、化学薬品消費と実験時間を大幅に削減する革新的な生化学分析手法です。

スマートフォンによるDNA断片分離のリアルタイム追跡

さらに動画を探す