Name: リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: 学ぶタウ蛋白のリン酸化と微小管結合、大腸癌細胞における局在解析法。共焦点顕微鏡を用いたこの手法は、がんや認知症研究における治療標的の探索に貢献します。

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この研究を行ったプロジェクトの一部タイトルの 『 開発と価値の高い化粧品原料海洋微細藻類からの工業化 』、省の海洋と水産、韓国、によって資金を供給、学内グラント (2Z04930) によって支えられました。天然物の KIST 陵所。

1 試薬調製 プロテアーゼ阻害剤カクテル溶液の <li>(1 mM) 特異フッ化物溶液、10 の追加の 10 μ <ol>μ l (100 x の在庫から 1 x) とホスファターゼの 10 μ l (100 x の在庫から 1 x)。完全な RIPA 溶解バッファーを準備する 1 x radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファーの 1 mL に阻害剤カクテル ソリューションです</li>。
	<li>一般的なチューブリン バッファー (PEM) x 10 の準備。
	<ol><li>追加 800 mM (6.0474 g) ピペラジンの N &#39; - ビス - 2-ethanesulfonic 酸, 10 mM (95.1 mg) エチレング リコール-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N &#39;、N &#39;-四酸、10 mM (51 mg) MgCl 2、および 50 mL のチューブで 1.25 M (10 m 3 mL) NaOH、15 mL の蒸留水水とミックスし、渦を使うことで溶かします。(6.9 はず) pH を確認してください。場合 pH &#62; 6.9, バッファーを破棄し、新鮮な多くのリメイクします 。
		注: 水酸化ナトリウムは pH に 6.9 がオーバー シュートしないように 1.25 メートル以下でなければなりません。HCl を使用して pH を調整するためにお勧めできません &#62; 6.9</li>。
		<li>追加 NaOH pH は 6.9 まで滴下。10 X PEM バッファーの最大 25 mL に蒸留水を追加します。最後に、注射器と注射器にある、0.2 μ m のフィルターを使用してフィルターします。1.5 mL チューブの因数にこのバッファーを分割し、4 で保存 ° C</li>
	</ol></li> <li>準備 5 x サンプルバッファーの還元剤と染料。
	<ol><li>ミックス 300 μ L (60 mM) 1 M トリス-HCl (pH 6.8)、2.5 mL (25%) 50% グリセロール、10% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) の 1.2 ml の蒸留水 1 mL (2%) の SDS のサンプルバッファー x 5 の 5 mL を補うため。デパート &#8722; 20 ° C 
		注: ためグリセリンは、粘性が、測定 1.25 mL グリセリン困難です。100% のグリセロールの 1 mL の重さ 1.26 g。したがって、100% のグリセロールの 1.575 グラムの重量を量る (1.25 mL の 100% に相当する 50% のグリセロールの 2.5 ml) 15 mL のチューブ。他のコンポーネントとミックスします</li>。
	</ol></li></ol> 2。細胞培養、クルクミンによる治療または LiCl 治療と蛋白質の表現の検討 10% 胎児牛を添加した最低限不可欠なメディア (MEM) を含む <ol><li>追加 1 ~ 10 細胞 6 HCT 116 x 100 mm にティッシュ文化皿血清 (FBS) および 1% ペニシリン-ストレプトマイシン。培養 1 日後電池が 60-70% の合流点に達するされます 。
	注: 必要な枚数下記の治療法の数によって異なります</li>。
	<li>細胞 (顕微鏡を用いた近似) ~ 65% の合流点に達する補完 MEM 培地を取り除き、5 μ M、10 μ M と 30 μ M のクルクミンや 25 mM、50 mM と 100 mM LiCl と無血清 MEM を追加します。37 ° C 5% CO 2 を含む加湿雰囲気の中で 24 時間インキュベートします</li>。
	<li>治療後 24 時間は、1 mL 冷たいリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と細胞を洗浄し、細胞スクレーパーを使用して細胞をこすり。転送 1.5 mL に無断複製されたセル管を遠心し、細胞ペレットを取得する 4 ° C で 1,800 x g で 4 分間遠心します</li>。
	<li>は、定期的にチューブをタップしながら 4 ° C、20 分で完全な RIPA バッファーを 100 μ l 添加の餌を中断することにより、細胞を溶解させます。サンプルを簡単に超音波照射します</li>。
	<li>4 で 22,570 x g で 20 分間のベンチトップ遠心で細胞ホモジネートを遠心分離機 ° C は、ピペットを使用してその他のラベルの付いた管に培養上清を転送します</li>。
	<li>ブラッドフォードの試金 45 商業蛋白質の試金キットを使用して培養上清タンパク質濃度を測定します</li>。
	<li>4 のセル lysates の等しい蛋白濃度 (10 μ g のタンパク質/13 μ L のサンプル) の準備サンプル X SDS ゲル読み込みバッファー。4 x 400 mM ジチオトレイトール (DTT) を含む新鮮な SDS ゲル読み込みバッファーを準備します 。
	注: この時点で、サンプルで保存できます &#8722; 20 ° C が必要される場合</li>。
	<li>加温 5 分間 100 ° C で熱ブロックのサンプル渦を使用してサンプルを混合し、10 ~ 15 のそれらを冷却するを待つ分</li>
	<li>電気泳動システムのアセンブル。
	<ol><li>ロード 10 μ g タンパク質電気泳動 (SDS-PAGE) 用 10 %sds ポリアクリルアミドのゲルのウェルあたり (13 μ L サンプル)。一車線にゲル分子はしごをロードします 。
		注: 電気泳動が開始すると、蛋白質の梯子は見かけの分子量のタンパク質のバンドに解決されます。未知の蛋白質バンドの分子量を推定するこれらのバンドを使用します</li>。
		<li>サンプルをロードした後、電気泳動システムのプラスとマイナスの電極を一定の電圧を維持するために電源に接続します。最初は、スタッキングのゲルから解決のゲルに蛋白質のサンプルを移動する 20 分間 70 V で開始します。サンプルおよび蛋白質の梯子のゲルの端に達するまで、約 70-120 分の 125 V に電圧を高める</li>。
		<li>電気泳動の終了後、湿式電気的ブロッティング法を用いたポリフッ化ビニリデン (PVDF) 二フッ化膜にゲルを転送します。転送ブロック対 100 ~ 100 分 4% ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で約 25 の 90 分のブロック バッファー内膜 ° C</li>
	</ol></li> <li>分子量の梯子の側にそれを切断することによって、しみをマークします。しみを切断するため、透明プラスチック シートと鋭いカッターを使用します。(1:5, 000 反タウ; 反-リン-タウ 1:4, 000) の一次抗体ソリューションを準備し、この溶液中の 4 ° C でしみを一晩インキュベートします</li>。
	<li>一晩インキュベートした後 7 分しみ 4 回で洗うリン酸緩衝生理食塩水-トゥイーン-20 (pbst;) ソリューション</li>。
	<li>(ヤギ抗うさぎまたは抗マウス IgG 1:5, 000)、関連する二次抗体ソリューションを準備し、4 回、7 分の 90 分間室温 pbst; 約 25 ° c. に洗浄のためのこのソリューションでしみをインキュベートします</li>。
	<li>を開発、メーカーによると化学発光キットを使用してしみ &#39; 推奨値。透明なプラスチック製のラップを使用してしみをカバーします。イメージング システム関連ソフトウェアと化学発光の発光により画像を取得します</li>。
</ol> 3。脱燐酸化酵素アッセイ <ol><li>アルカリホスファターゼ バッファーのアルカリホスファターゼ (ステップ 2.5) からのセル lysates を扱う。
	<ol><li>両方を制御し、処理された試料準備 20 μ L のサンプルを含む 20 μ g 総蛋白。20 μ g 総蛋白、続いて 2 μ L アルカリホスファターゼ バッファーと 10 μ L アルカリホスファターゼを含むセル lysates のボリュームを追加します。20 μ L に蒸留水を追加します</li>。
	</ol></li> <li>1 h. 最終濃度 50 ミリメートル、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を追加するか、最終濃度 10 mM バナジン ナトリウム (Na 3 VO 4) を追加することによって反作用を停止し、37 ° C でサンプルをインキュベートします。5 分 75 ° C で加熱することにより反応を停止することも</li>
	<li>ホスファターゼによるサンプルの培養が完了すると、前に脱燐酸化酵素フォスファターゼで処理したサンプルとの比較を追加せずに同じ濃度の試料を準備します</li>。
	<li>400 mM DTT を含む追加作りたての 4 X SDS ゲル読み込みバッファーします</li>。
	<li>は、渦を使用してサンプル 5 分ミックス 100 ° C で熱ブロックのサンプルをインキュベートします。室温でクールな 〜 10-15 分</li>
	<li>SDS-PAGE によって 10% のポリアクリルアミドゲルを実行するための電気泳動システムを構築します。
	<ol><li>10 %polyacry の井戸あたりロード 10 μ g 蛋白質 (13 μ L サンプル)lamide ゲル。分子量の梯子をロードします</li>。
		<li>サンプルをロードした後、電気泳動システムのプラスとマイナスの電極を一定の電圧を維持するために電源に接続します。最初は、スタッキングのゲルから解決のゲルに蛋白質のサンプルを移動する 20 分間 70 V で開始します。その後、125 V に電圧を高めるし、サンプルおよび蛋白質の梯子のゲルの端に達するまで約 70 120 分のためのゲルを実行します</li>。
		<li>電気泳動の終了後、湿式電気的ブロッティング法を用いた PVDF 膜にゲルを転送します。(動) 100 ~ 100 分の転送</li>
		<li>は、小さな分子量の梯子側に切り傷を作り、しみをマークします。しみを切断するため透明なプラスチック シートとシャープなカッターを使用します</li>。
	</ol></li> <li>、90 分の室温で 4 %bsa ブロック バッファー内膜をブロックします</li>。
	<li>は、4 ° C で一次抗体溶液 (1:5, 000 反タウ) でしみを一晩インキュベートします。7 分 4 回 PBST でしみを洗うです</li>。
	<li>は、関連する二次抗体溶液 (ヤギ抗マウス IgG 1:5, 000) を準備し、室温で 90 分のしみを孵化させなさい。7 分 4 回 PBST で洗うです</li>。
	<li>を開発、メーカーによると化学発光キットを使用してしみ &#39; 推奨値。透明なプラスチック製のラップの内でしみをカバーします。イメージング システム関連ソフトウェアと化学発光の発光により画像を取得します</li>。
</ol> 4。微小管結合の試金 <ol><li>微小管結合の試金のため手順 2.1 2.6</li>。
	<li>準備 1 X 10 X PEM バッファーから (2 mL) PEM バッファーは、20 μ M (40 μ L) パクリタ キセルと 1 mM (20 μ L) GTP を追加して 4 ° C で保存。微小管 (MT) みる &#8722; 80 ° C のフリーザーと 大腸菌 タウ在庫から &#8722; 20 ° C のフリーザー</li>。
	<li>の表 1 に従ってサンプルを準備します</li>。
	<li>100,000 × g で 60 分の 25 ° C で 30 分を超遠心機 37 ° C でインキュベートします</li>。
	<li>転送 120 μ L を含む上清中のタウをきれいにするを非連結し、チューブのラベルします</li>。
	<li>追加 120 μ L (上澄みと同じボリューム) 5 X のサンプル バッファー バインドされたタウを含むペレットにし、よく混ぜます。ラベルの付いた管をきれいにし、徹底的にミックスするソリューションを転送します</li>。
	<li>タンパク質濃度の測定 (手順 2.6 参照). 
	注: サンプル準備中、ペレットと上澄みの両方のサンプルを準備するためソリューション (ステップ 4.6) のボリュームを使用します</li>。
	<li>相当の蛋白質の集中のサンプルを準備し、作りたての 4 x DTT (400 mM) を含む SDS ゲル読み込みバッファーを追加します 。
	注意: サンプルで格納することができます &#8722; この段階で 20 ° C.</li>
	<li>3.5 3.10、手順を繰り返します</li>。
</ol> <table border="1"fo:keep-together.within-page="1"fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>サンプル</td> <td colspan="2"> 名</td> <td colspan="2"> に必要な微小管</td> <td colspan="2"> 主な蛋白質が必要な</td> <td colspan="2"> PEM GTP PTX</td></tr> <tr><td>1</td> <td colspan="2"> HCT 116 コントロール (6.21 μ g/μ l)</td> <td colspan="2"> 2 μ l</td>
			<td colspan="2"> 9.66 μ l (60 μ g)</td>
			<td colspan="2"> 108.34 μ l</td></tr>
		<tr><td>2</td> <td colspan="2"> HCT 116-クルクミン 10 μ M (4.81 μ g/μ l)</td> <td colspan="2"> 2 μ l</td> <td colspan="2"> 16.63 μ l (80 μ g)</td> <td colspan="2"> 101.37 μ</td></tr> <tr><td>3</td> <td colspan="2"> HCT116-クルクミン 20 μ M (3.28 μ g/μ l)</td> <td colspan="2"> 2 μ l</td> <td colspan="2"> 30.49 μ l (100 μ g)</td> <td colspan="2"> 87.51 μ</td></tr> <tr><td>4</td> <td colspan="2"> HCT 116 LiCl 25 mM (5.43 μ g/μ l)</td> <td colspan="2"> 2 μ l</td> <td colspan="2"> 18.42 μ l (100 μ g)</td> <td colspan="2"> 99.58 μ</td></tr> <tr><td>5</td> <td colspan="2"> 大腸菌 タウ</td> <td colspan="2"> 2 μ</td> <td colspan="2"> μ l 1タウ 352</td> <td colspan="2"> 117 μ l</td></tr> <tr><td>6</td> <td colspan="2"> MT のみ</td> <td colspan="2"> 2 μ l</td> <td colspan="2"> X</td> <td colspan="2"> 118 μ l</td></tr> <tr><td></td> <td colspan="2"></td> < td colspan ="2"></td> <td colspan="2"></td> <td colspan="2"> 120 μ</td></tr></tbody></table> テーブル 1: 微小管結合の試金のための試料調製。
 5 です。 ローカリゼーションとクルクミンと細胞の治療後トー式 <ol><li>70% エタノールを使用して観察をきれいにし、研究室のティッシュを使用してそれを乾燥。ラベル 6 ウェル培養プレートの各ウェルに単一 coverslip を挿入します。キャビネットの生物学的安全性のプレートを置き、少なくとも 3 h の紫外線のスイッチ</li>
	<li>サブカルチャー セル推奨培地の 10 の 5 細胞/ウェル x 2.5 で 6 ウェル プレートの関連性の高い井戸にそれらの種子と</li>。
	<li>~ 24 h 後細胞の形態学的変化をチェックする 10 X と 40 X の目標の両方を使用して、倒立顕微鏡を用いた細胞を調べます。必要な場合は、写真を記録します</li>。
	<li>は、PBS を使用する 2 回細胞をすすいでください。暗闇の中で 37 ° C の定温器で 3.7% ホルムアルデヒドにセルを修正します 。
	注: 室温でホルムアルデヒドによる固定、よく働くも。ホルムアルデヒドを取り扱うときは、適切な個人用保護具を着用します</li>。
	<li>は、PBS のセルを洗浄します。冷えたメタノールのセルを修復する &#8722; 20 ° C、15 分 Permeabilize セル PBS のセルを洗浄しているトリトン X-100 PBS で 10 分間氷の上で 0.1% と 3 %bsa にそれらをインキュベートし</li>。
	<li>インキュベート ブロック バッファー内セル (0.1% と 3% BSA PBS 溶液トゥイーン 20) 室温で 1 時間 。
	注: 4 ° C で 2 時間インキュベーション作品も、あまりにもです</li>。
	<li>0.1% と 3 %bsa 一次抗体 (1: 200 で反タウ) ソリューションの準備 (例えば、0.4 mL バッファーに 2 μ L タウ 13 抗体) PBS でトゥイーン 20</li>。
	<li>、PVDF の小さな部分をカット膜部分に 6 ウェル プレートの各ウェル内で正しく収まるように水に浸す 5 分場所の各ウェルにカット PVDF</li>。
	各ウェルに <li>カットする一次抗体ソリューションの追加 60 μ L PVDF 作品。細胞は一次抗体溶液を触れることができるよう、coverslips を配置します。暗く、湿気の多い室内の 4 ° C で一晩インキュベートします。PBS で洗浄 4 回</li>。
	<li>準備 3 %bsa と 0.1% で二次抗体溶液 (フルオレセイン共役 594 抗マウス IgG 1: 400 で) PBS でトゥイーン 20</li>。
	<li>ピース 6 ウェル プレートの各ウェル内に正しく収まるよう、各ウェルに PVDF カット 5 分位水に浸すように PVDF 膜の小片をカットします</li>。
	<li>6 ウェル プレートで PVDF 作品のそれぞれに二次抗体溶液を追加 80 μ l 添加します。セルは、二次抗体溶液を触れることができるよう、coverslip を配置します。4 回 2 h. PBS で洗浄のため室温で暗く、湿気の多い部屋でインキュベートします</li>。
	<li>サンプル 4 でメディアをマウントをマウント &#39;、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と fix ガラス スライド coverslips。
	<ol><li>追加滴スライド ガラスの DAPI を取り付け中。各ウェルから、coverslips を外し、DAPI でメディアをマウントを含むスライド ガラスの上に置きます。鉱山機械染色の細胞を含む各カバーガラスの表面に触れていることを確認します。対応するスライド ガラスに頂中です</li>。
		<li>適用マニキュア各 coverslip シールし、それらを修正するすべての周りスライド ガラスに密閉。必要な場合は、2 回この手順を実行します</li>。
	</ol></li> <li>暗い部屋に室温で 1.5 h 間加温します</li>。
	<li>暗い部屋で coverslip のイマージョン オイルを用いた共焦点の顕微鏡を使用してスライドを確認します</li>。
</ol>

著者は、開示するものがあることを宣言します。

この原稿は、総タウを検出するためさまざまな手続き型条件を確立し、クルクミンと LiCl 大腸癌細胞で tau のリン酸化します。Tau 蛋白質のサンプルの全体のリン酸化状態を評価するために脱燐酸化酵素試金は記述されていた。この試金は、任意のタンパク質のリン酸化状態を調べる可能性があります使用できます。
この試金は非リン酸化状態より遅いタンパク質の動きをリン酸化の原則に基づいています。アルカリ性ホスファターゼ ・ アルカリ性ホスファターゼのバッファーは、このプロトコルで使用されます。セル lysates をアッセイ コンポーネントを追加したらサンプル培養特定の温度に特定の最適な期間にする必要があります。インキュベーション後、反応を停止する SDS サンプルバッファーでサンプルを煮沸する必要があります。以前は、さまざまな実験的プロトコルがタウの微小管への結合を評価するために使用されている可能性があります。ここで紹介する微小管結合の試金は実行しながら、清とペレットの分数を使用して品質保証を提供するために正と負の両方のコントロールを含む簡単です。MT だけ否定的な制御は、MT に任意のバイ...

タウはもともと共同チューブリン1で精製した熱安定性微小管関連タンパク質として同定されました。タウは、高等真核生物2,3,4でのみ表されます。タウの主な機能は、微小管アセンブリ1,5,6を制御することです。また、微小管7、軸索輸送8、9軸索直径の変化、神経変性疾患10神経極性の形成の重合化に貢献します。タウは、いくつかのシグナル伝達経路を制御するタンパク質の足場としても機能します。ラット脳研究は、タウを提案するニューロン固有でありそれが主に軸索11に局在すること。中枢神経の軸索の開発で主要な役割を果たすタウ タウが微小管重合と神経の開発に不可欠な仮説この仮説は後の in vitroとin vivoの実験により確認します。ニューロンに加えタウは異なる非神経細胞、肝臓、腎臓、筋肉細胞12,13などで表されます。また、ひと乳癌、前立腺、大腸、胃、膵癌細胞ラインおよび組織14,15,16,17,18,タウを表現します。19. タウ封入体筋炎、封入体20のツイスト tubulofilaments として分かった。
タウは、いくつかの翻訳後修飾を運ぶことができます。すべてのポスト翻訳の修正のリン酸化が最も一般的です。増加 tau のリン酸化は、最終的に不安定細胞骨格微小管の親和性を減少します。80-5 リン酸化サイトは、タウ蛋白のヒトのアルツハイマー病脳組織から分離されたに記載されています。これらのサイトの 53% は唯一 6% チロシン残基21,22,2341% トレオニン、セリンを構成します。Tau のリン酸化に影響を与える他のポスト翻訳の修正には感受性と溶解バインディング機能局在化。正常範囲以上にも tau のリン酸化 (またはリン酸基を完全に飽和させる) アルツハイマー病24の構造と機能特性を複製するタウとして知られています。タウは、軸索の微小管の正常な機能維持し、確実に生理学的な条件の下で正常な神経機能します。ただし、過リン酸化タウが微小管分解のため神経細胞の損失の原因とよく組織化された微小管結合を維持するために失敗します。リン酸化タウの正常なレベルに必要機能、適切なタウが、タウがその特徴的なリン酸化レベルが変更される、過リン酸化25の場合正常に機能に失敗します。アルツハイマー病と他の加齢に伴う変性疾患、タウ過リン酸化になり、ペアのヘリカル フィラメントと原線維変化26,27を形成します。したがって、tau のリン酸化と微小管結合を決定するための方法が重要です。
加齢関連のがんの場合、大腸がんは 3 番目は最も頻繁両方の男性と女性の28の第 3 著名な死の原因となる癌を診断です。大腸癌は、西部の世界29の主な死の原因となる癌の一つです。大腸がんとアルツハイマー病は、高齢化に関連付けられているため、両方起こる主に先進国の人々 が同じような食生活を楽しむ 2 つの病気は相関何とか可能性があります。また、タウ陽性とタウ陰性の癌細胞は、化学療法剤、例えば、パクリタ キセル16に異なる対応します。
クルクミンは、ウコン、インド スパイス ウコン30の主要な誘導体の 1 つです。何世紀にも南アジア人口は日常的に彼らの食事療法でウコンを消費しています。クルクミンは大腸癌、アルツハイマー病、糖尿病、嚢胞性線維症、炎症性腸疾患、関節炎、高脂血症、動脈硬化症、虚血性心疾患31,を含む、さまざまな病気の治療に使用します。32,33,34,35,36,37,38. リチウムできますも大腸癌細胞を殺すか39彼らの増殖を防ぐ。リチウムは、タウ凝集が減り、、トランスジェニック マウス モデル41,42,43に見られるそのタウを防止、アルツハイマー病40の治療にも使用できます。 44。
この原稿を目指して: 1) 総タウと扱われた細胞内リン酸化タウ発現レベルを測定します。2); リン酸化タウ全体を測定する脱燐酸化酵素試金を記述します。3); タウの微小管結合を調べる・ 4) クルクミンまたは LiCl で治療した大腸癌細胞株における共焦点顕微鏡によるタウをローカライズします。結果では、クルクミンと細胞治療、大腸癌のためおそらく良い化学療法剤であるし、LiCl による治療両方の総タウの式を減らすことができます大腸癌細胞株におけるタウをリン酸化を明らかにします。これらの治療法は、タウの核内移行を引き起こすことも。しかし、突然、クルクミンはタウの微小管への結合を改善するために失敗します。

<table><tbody><tr><td>HCT 116 cell</td><td>ATCC</td><td>CCL-247</td><td></td></tr><tr><td>MEM (EBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>ThermoFisher (Gibco)</td><td>16000044</td><td>-20°Cで保存。C</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>WelGene</td><td>LS 015-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ディッシュ</td><td>Corning</td><td>430161</td><td></td></tr><tr><td>6 well plate</td><td>Corning</td><td>Coster 3516</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau 13 antibody</td><td>abcam</td><td>ab19030</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Roche</td><td>10 708 984 001</td><td>保管温度2&ndash;8度;C</td></tr><tr><td>マイクロリットル遠心分離機</td><td>Hettich Zentrifugen</td><td>MIKRO 200 R</td><td></td></tr><tr><td>パクリタキセル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1912</td><td>保管温度 2&ndash;8度;C</td></tr><tr><td>クルクミン</td><td>シグマ-アルドリッチ(フルカ)</td><td>78246</td><td>保存温度2&ndash;8度;C</td></tr><tr><td>微小管 (MT)</td><td>Cytoskeleton</td><td>MT001</td><td>は 4 °C で保存します。C(乾燥)</td></tr><tr><td>DAPI封入剤</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>4°C;C 暗闇の中の水</td></tr><tr><td>酸化ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>-20 &deg;C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>WelGene</td><td>LB 001-02</td><td></td></tr><tr><td>音波記憶装置</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>モデル 500</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ L-100 XP</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>ス シグマ</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>分子イメージャー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>ケミドック XRS+</td><td>4°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>Protein assay dye reagent</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2125</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2118</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td><td>abcam</td><td>ab109390</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td> 室温<td>で保存</td></tr><tr><td>FastAP感温性アルカリホスファターゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651-20</td><td>°Cで保存。C</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤</td>カクテル<td>細胞シグナル伝達</td><td>5870</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Cell Signalling</td><td>5871</td><td>4°Cで保存。C</td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td>Σ</td><td>R 0278</td><td>保管温度 2&ndash;8度;C</td></tr><tr><td>Tau-352 ヒト</td><td>Sigma</td><td>T 9950</td><td>-20 °C;C</td></tr><tr><td>トリトン X-100&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X-100</td><td>約25°Cで保管。C</td></tr><tr><td>PVDF メンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0177</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG 二次抗体</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11005</td><td>4 °C で保存;C in the dark</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Leica Microsystem</td><td>Leica TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix</td><td>75819</td><td></td></tr><tr><td>Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td>4°Cで保存;ハ</td></tr></tbody></table>

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

微小管関連タンパク質 tau 主軸索に局在する神経蛋白質であります。一般的にタウの微小管重合と安定化になっているので正常な神経機能に不可欠です。ニューロンのほかにタウはひと乳癌、前立腺、胃、大腸、膵癌それはほぼ同じような構造を示していて、神経のタウとして同様の機能を発揮で表されます。タウとそのリン酸化の量は、微小管の安定剤としてその機能を変更でき、別の神経変性疾患、アルツハイマー病などのペアのヘリカル フィラメントの開発に 。タウとその微小管結合特性のリン酸化状態の判断が重要です。また、タウの細胞内の局在を調べることは、さまざまな病気で重要です。この原稿詳細標準プロトコル リン酸化タウとクルクミンと LiCl 治療の有無、大腸癌細胞の微小管のタウ バインディングを測定するため。これらの治療法は、癌細胞の増殖と開発を停止する使用ことができます。低量の抗体を使用している間免疫組織化学と共焦点顕微鏡を用いたタウの細胞内局在性を調べたこれらのアッセイは、タウ タウや微小管結合に影響を与える化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。関連抗癌剤は可能性のあるこれらのプロトコルを使用して特徴付けられるまたは異なるタウオパチーの治療薬が使用されます。

クルクミンの LiCl (図 1) 濃度の異なるセルを扱う後総タウとリン酸化タウの発現を調べた。クルクミンの濃度の異なる 3 つのセルの治療減少タウ発現;しかし、リン酸化タウ式低濃度クルクミンの投与により増加、クルクミン濃度が高いとセルを扱う時に減少しました。アンチ-リン-タウ (Ser396) は、リン酸化タウの検出に使われました。合計 tau のリン酸化タウのレベルを減らした LiCl (図 1) の 3 つの異なる濃度の細胞を処理。前の研究は、異なるがんの種類で、同じがんの種類の異なるサイトでタウの表現のレベルが異なることを示していた。大腸癌の以前のデータを示したそのタウ セルの 2 行で (HCT 116 および SW480) 大腸癌もリン酸化19が発現していた。5 μ M のクルクミンと細胞内リン酸化タウ レベルは未処理の細胞でより高かった。クルクミンの濃度が同じ細胞で総タウよりリン酸化タウのレベ...

本稿では、測定、微小管と薬物治療に続く細胞内のタウのローカリゼーションのタウ結合タウ タウを測定するための標準プロトコルについて説明します。これらのプロトコルは、薬やタウ タウや微小管結合を対象とする他の化合物をスクリーニングするため繰り返し使用できます。

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

本手順の全体的な目的は、大腸がん細胞において共焦点顕微鏡を用い、tauのリン酸化、tauの微小管結合能、およびtauの局在を解析することである。この手法は、リン酸化および微小管結合が重要な因子となる、がんや認知症研究を中心とした多くの生物学的研究分野において有効である。本法で提示するホスホラターゼアッセイの主な利点は、タンパク質サンプルの全般的なリン酸化状態を容易に把握できる点にある。微小管結合アッセイの主な利点は、微小管結合タンパク質を非結合分画から分離させる手順が簡便であることです。一方、tau局在化法の主な利点は、一次抗体および二次抗体の必要量が比較的少量で済むことです。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通りにすべての試薬を準備してください。約100万個のHCT 116細胞を、10%胎児牛血清および1%ペニシリン・ストレプトマイシンを添加した最小必須培地を含む培養皿に移します。細胞が65%コンフルエンスに達したら、アスピレーターを用いてFBS添加培地を除去します。その後、クルクミンまたは塩化リチウムを含む無血清MEMを加えます。5%二酸化炭素を含む加湿 atmosphere 下、37 °C で24時間インキュベートします。その後、氷冷した PBS 10 mL で細胞を洗浄します。氷冷した PBS 1 mL を加え、セルスクレイパーを用いて細胞を回収し、1.5 mL セントリフュージチューブに移します。1800 ×g、4 °Cで4分間遠心分離します。細胞ペレットを4 °Cで100 µLの完全RIPAバッファーに懸濁し、チューブを定期的にタッピングして細胞を溶解させながら20分間置きます。その後、振幅10%で、0.2秒オン、0.2秒オフのパルス動作で合計2秒間、サンプルを短時間ソニケーションします。細胞ホモジネートを22,570 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。上清を新しいラベル付きチューブに移し、テキストプロトコルに記載されている通り、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を測定します。総タンパク質量を20 µgに調整したサンプルを用意し、それぞれに2 µLのアルカリホスファターゼバッファーと10 µLのアルカリホスファターゼを加えます。次に、各サンプルの最終容量が20 µLになるように蒸留水を加えます。サンプルを37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベートしている間に、比較用にホスファターゼを含まない同濃度の追加サンプルを調製します。1時間後、最終濃度が50 millimolarになるようにEDTAを、または最終濃度が10 millimolarになるようにオルトバナジン酸ナトリウムを添加して反応を停止させます。400 millimolarのDTTを含む、調製直後の4XSDSゲルロード用バッファーを加えます。ヒートブロックを使用し、サンプルを100 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。サンプルをボルテックスし、室温で10〜15分間冷却します。次に、10%ポリアクリルアミドゲルに、1ウェルあたり13 µLのサンプルおよび分子量マーカーをロードします。電気泳動装置を電源に接続し、電圧を70 Vに設定して20分間泳動させ、タンパク質サンプルをスタッキングゲルからリゾルビングゲルへと移動させます。その後、電圧を125 Vに上げ、サンプルとプロテインラダーがゲルの末端に到達するまで、約70〜120分間電気泳動を行います。ウェット転写装置を用いて、100 Vで約100分間、ゲルからポリビニリデンフルオリド膜に転写します。次に、ブロッキングのため、膜を4%牛血清アルブミン中で室温で90分間インキュベートします。ブロットを一次抗体溶液中で4°Cで一晩インキュベートします。翌日、PBSTで7分間ずつ3回ブロットを洗浄します。その後、二次抗体溶液中で室温で90分間インキュベートします。その後、PBSTで4回洗浄し、1回の洗浄時間を7分とします。製造元の指示に従い、化学発光キットを用いてブロットを現像します。現像したブロットを透明なプラスチックラップで覆い、市販の化学発光イメージングシステムを用いてブロットの化学発光画像を撮影します。新鮮なサンプルを調製後、37 °Cで30分間インキュベートします。その後、サンプルを100,000 ×g、25 °Cで60分間超遠心分離します。次に、未結合のtauを含む各上清を120 µLずつ、別々の洗浄済みラベル付きチューブに移します。結合したtauを含むペレットに、Fibicサンプルバッファーを120 µL加えます。ボルテックスおよびピペッティングにより十分に混合した後、混合液をラベル付きの清潔なチューブに移します。タンパク質濃度を等しくなるようにサンプルを調製し、400 mM DTTを含む新鮮な4X SDSゲルローディングバッファーを加えます。ヒートブロックを使用して、サンプルを100°Cで5分間インキュベートします。サンプルをボルテックスした後、室温で10〜15分間冷却します。10%ポリアクリルアミドゲルに、1ウェルあたり13µLのサンプルと分子量ラダーをロードします。電気泳動装置の正極と負極を電源に接続し、電圧を70Vに設定して20分間流します。その後、電圧を125Vに上げ、サンプルとプロテインラダーがゲルの末端に到達するまで、約70〜120分間泳動させます。ウェット電写装置を用い、100Vで約100分間、ゲルからポリビニリデンフルオリド膜へ転写します。ブロットした膜を4%牛血清アルブミンで室温にて90分間インキュベートします。その後、一次抗体溶液中で4°Cにて一晩インキュベートします。翌日、PBSTで4回洗浄し、各洗浄時間を7分間とします。洗浄したブロットを適切な二次抗体溶液中で室温で90分間インキュベートします。その後、PBSTで7分間の洗浄を計4回繰り返します。化学発光キットを用いてブロットを検出します。透明なプラスチックラップで覆い、化学発光イメージングシステムを用いて画像を撮影します。まず、6ウェル用組織カバープレートの各ウェルにカバーガラスを配置し、推奨の培地を用いて各ウェルに250,000個の細胞を播種します。24時間後、細胞をPBSで2回洗浄します。クルクミンを含む無血清MEMを加え、5%二酸化炭素を含む加湿雰囲気下、37℃で24時間インキュベートします。その後、細胞を氷冷PBSで再度洗浄します。37℃のインキュベーター内にて、遮光状態で3.7%ホルムアルデヒドを用いて細胞を固定します。細胞をPBSで洗浄し、次いで氷冷したメタノールを用いて20 °Cで15分間固定します。その後、3% BSAおよび0.1% Triconex 100を含むPBS中で、氷上で10分間インキュベートします。細胞をPBSで洗浄し、ブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートします。次に、各ウェルの切り出したポリビニリデンフルオリド片に、一次抗体溶液を60 µL加えます。細胞が抗体溶液に接触するようにカバーガラスを配置してください。暗所で湿ったチャンバー内にて、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、細胞をPBSで4回洗浄します。ポリフッ化ビニリデン膜の各ピースに、二次抗体溶液を80 microlitersずつ加え、細胞が抗体溶液に接するようにカバーガラスを配置します。室温の暗所、高湿度チャンバー内で2時間インキュベートします。その後、PBSで細胞を4回洗浄します。DAPIを含む封入剤でサンプルを封入し、カバーガラスをスライドグラスに固定します。次に、室温の暗室で1時間30分間インキュベートします。共焦点顕微鏡を用いてスライドを観察します。本研究では、特定のtauリン酸化をリン酸化tau抗体を用いて評価します。クルクミンで処理した細胞では、クルクミンの濃度が増加するにつれてtauの発現が低下することが確認されます。一方で、リン酸化タウの発現は、低濃度のクルクミンにおいて増加し、非常に高い濃度においてのみ減少することがわかります。次に、塩化リチウムで処理した細胞を検討します。見ての通り、塩化リチウム処理下では、タウおよびリン酸化タウの両方の発現が著しく減少しています。その後、ホスファターゼアッセイによって全体のリン酸化を評価します。ホスファターゼ処理したサンプルでは、未処理のコントロールサンプルと比較してTauの移動速度が速くなっており、これはコントロールサンプルがリン酸化されていることを示しています。クルクミン処理した細胞サンプルでも非常に同様の結果が得られ、大腸がん細胞株への処理によってTauのリン酸化が抑制されなかったことが示されました。塩化リチウム処理を施した細胞サンプルにおいて、ホスファターゼ処理ありと処理なしの両サンプルで電気泳動の移動範囲がほぼ同様であったことから、tauのリン酸化が抑制されていることが示されました。次に、tau 352をポジティブコントロールとして用い、細胞サンプルの微管結合能アッセイを確立しました。ここで示されているように、クルクミンおよび低濃度の塩化リチウム処理の両方において、微管結合活性の抑制が認められました。次に、共焦点顕微鏡観察を行います。クルクミン処理後、tauが核へ移行することが確認できます。これは、核内tauがニューロンのDNA保護において重要な役割を果たすことを報告した先行研究を支持する結果となります。このビデオを視聴することで、タンパク質サンプルの全リン酸化を決定するためのホスファターゼアッセイの実施方法および、微小管結合アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。また、少量の抗体をさまざまな量で用いた、共焦点顕微鏡による免疫蛍光アッセイの実行方法を習得できるでしょう。ここで提示する手順は費用対効果が高く、さまざまなタウオパチーやがんを治療するための新しい治療薬の発見および開発に役立つ可能性があります。

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CRC細胞におけるホスファターゼアッセイ:結腸直腸癌細胞におけるタウタンパク質のリン酸化状態を調べる方法

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組織をホモジナイズして、タンパク質をバッファーに放出します。プロテアーゼ阻害剤はプロテアーゼ活性を阻害し、タンパク質の分解を防ぎます。...

ウェスタンブロット解析を用いたマウス脳サンプル中のリン酸化タウタンパク質の検出

このビデオでは、核磁気共鳴分光法(NMR)技術を使用してタンパク質内の複数のリン酸化を特定する方法を示します。特定のアミノ酸でのタンパク質のリン酸化は、隣接するアミド水素のシールド解除を引き起こし、スペクトルの違いを生じさせます。...

タンパク質中の複数のリン酸化を同定するための核磁気共鳴分光法

このビデオでは、pH感受性蛍光標識タウ凝集体を用いてマウスミクログリアによるタウの取り込みを定量化する細胞ベースのアッセイを紹介しています。これを蛍光活性化セルソーティングで分析し、定量的評価を行っています。...

ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

非修飾および高リン酸化タウタンパク質は、高リン酸化依存速い凝集速度論を明らかに二つのインビトロ凝集アッセイに使用した。これらのアッセイは、アルツハイマー病の進行の基礎となる原線維を形成する過リン酸化タウの性向を調節することができる化合物のための将来のスクリーンのための道を開く。...

高リン酸化タウタンパク質を用いたインビトロ凝集アッセイにおいて

&gt;jove_content&lt;ここでは、タウタンパク質をケーススタディとして、核磁気共鳴分光法(NMR)によって天然変性タンパク質の複数のリン酸化を特定する方法について説明します。組換えタウは、データ取得および解析の前に、キナーゼによって同位体的に濃縮および修飾されます。...

本質的に無秩序なタンパク質の複数のリン酸化の同定のための核磁気共鳴分光法

ここより反タウ抗体の作用のメカニズムを特徴付けるため治験ツールの作成目的とミクログリアによるタウ摂取量を定量的に評価する細胞に基づく試金を記述します。...

タウの抗体を介したミクログリアによってクリアランスを勉強するセルベースのアッセイ

タウは、細胞質に存在する神経タンパク質であり、そこで微小管を結合し、核の中で、アルツハイマー病関連遺伝子の変調を含む非伝統的な機能を発揮する。ここでは、細胞質タウからの干渉を排除しながら核タウの機能を調べる方法について述べる。...

疾患関連遺伝子の発現を調べるツールとしてのタウ小細胞局在の変調

チューブリンポリマーである微小管は、真核細胞の細胞骨格成分として重要な役割を果たしており、動的に不安定であることで知られています。本研究では、微小管を分画して安定微小管、不安定な微小管、遊離管に分離し、マウスの各種組織における微小管の安定性を評価する方法を開発しました。...

マウス組織における安定微小管、不安定な微小管、遊離チューブリンを分離するための定量的微小管分画技術

学ぶタウ蛋白のリン酸化と微小管結合、大腸癌細胞における局在解析法。共焦点顕微鏡を用いたこの手法は、がんや認知症研究における治療標的の探索に貢献します。

リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

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