リン酸化と大腸癌細胞におけるタウ蛋白の局在と微小管結合の試金

この手順の全体的な目標は、結腸直腸癌細胞の共焦点顕微鏡を使用して、タウのリン酸化、タウの微小管結合能力、およびタウの局在を研究することです。この方法は、ほとんどの生物学研究分野、特にリン酸化と微小管結合が重要な要素である癌や認知症の研究に効果的です。提示されたホスホラターゼアッセイの主な利点は、タンパク質サンプルのリン酸化全体を知覚する簡単な方法を提供することです。

主な利点は、微小管結合アッセイは、微小管結合タンパク質を非結合画分から分離する簡単な手順であることです。しかし、タウ局在化技術の主な利点は、比較的少量の一次抗体と二次抗体を必要とすることです。この手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されているすべての試薬を準備します。

約100万個のHCT 116細胞を、10%ウシ胎児血清と1%ペニシリンストレプトマイシンを添加した最小限の必須培地を含む培養皿に移します。細胞が65%のコンフルエンスに達したら、アスピレーターを使用してFBSを添加した培地を取り除きます。次に、クルクミンまたは塩化リチウムを含む無血清MEMを添加します。

%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気で摂氏37度で24時間インキュベートします。この後、10ミリリットルの氷冷PBSで細胞を洗浄します。氷冷PBSを1ミリリットル加え、次にセルスクレーパーを使用して細胞をこすり落とし、1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。

Gの1800倍、摂氏4度で4分間遠心分離します。細胞ペレットを摂氏4度の100マイクロリットルの完全RIPA緩衝液に20分間懸濁し、チューブを定期的にタップして細胞を溶解します。次に、サンプルを10%の振幅で短時間超音波処理し、0.2秒間パルスをオンに、0.2秒間オフに、合計2秒間

細胞ホモジネートを22倍、Gの570倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。上清を新しい標識チューブに移し、テキストプロトコルに概説されているように、Bradfordアッセイでタンパク質濃度を測定します。総タンパク質20μgを含むサンプルを調製した後、それぞれに2マイクロリットルのアルカリホスファターゼ緩衝液と10マイクロリットルのアルカリホスファターゼを加えます。

次に、各サンプルの最終容量が20マイクロリットルになるように蒸留水を追加します。サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。サンプルをインキュベートしている間に、同じ濃度で追加のサンプルを調製しますが、比較のためにホスファターゼは使用しません。

1時間後、最終濃度50ミリモルのEDTAまたは最終濃度10ミリモルのオルトバナジン酸ナトリウムのいずれかを添加して反応を停止します。.新たに調製した4XSDSゲルローディングバッファーを400ミリモルDTTで追加します。ヒートブロックを使用して、サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートします。

サンプルをボルテックスし、室温で10〜15分間冷却します。次に、ウェルあたり13マイクロリットルのサンプルをロードし、分子秤量したはしごを10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。電気泳動システムを電源に接続し、電圧を70ボルトに20分間設定して、タンパク質サンプルをスタッキングゲルから分離ゲルに移動します。

この後、125ボルトに増やし、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。湿式エレクトロブロッティングシステムを使用して、ゲルをポリフッ化ビニリデンメンブレンに100ボルトで約100分間移します。次に、メンブレンをインキュベートして、室温で90分間4%ウシ血清アルブミンにブロットします。

ブロットを一次抗体溶液(摂氏4度)で一晩インキュベートします。翌日、ブロットをPBSTで3回、毎回7分間洗浄します。不確かな二次抗体溶液で室温で90分間インキュベートします。

次に、PBSTで4回洗浄し、各洗浄は7分間続きます。ブロットは、メーカーの指示に従って化学発光キットを使用して現像します。現像したブロットを透明なラップで覆い、市販の化学発光イメージングシステムでブロットの化学発光画像を取得します。

新鮮なサンプルを調製した後、摂氏37度で30分間インキュベートします。サンプルをGの100,000倍、摂氏25度で60分間超遠心分離します。次に、結合していないタウを含む各上清の120マイクロリットルを、分離、洗浄、および標識されたチューブに移します。

結合したタウを含むペレットに120マイクロリットルのFibicサンプルバッファーを加えます。十分に混合した後、ボルテックスとピペッティングにより、混合物を清潔な標識付きチューブに移します。同等のタンパク質濃度のサンプルを調製した後、400ミリモルDTTを含む新しい4XSDSゲルローディングバッファーを添加します。

ヒートブロックを使用して、サンプルを摂氏100度で5分間インキュベートします。サンプルをボルテックスし、室温で10〜15分間冷却します。ウェルあたり13マイクロリットルのサンプルと分子量ラダーを10%ポリアクリルアミドゲルにロードします。

電気泳動システムの正極と負極を電源に接続し、電圧を70ボルトに20分間設定します。この後、125ボルトに増やし、サンプルとタンパク質ラダーがゲルの端に達するまで、ゲルを約70〜120分間泳動します。湿式エレクトロブロッティングシステムを使用して、ゲルをポリフッ化ビニリデンメンブレンに100ボルトで約100分間転写します。

メンブレンをインキュベートして、室温で90分間4%ウシ血清アルブミンにブロットします。その後、一次抗体溶液で摂氏4度のインキュベートを行います。翌日、ブロットをPBSTで4回洗浄し、各洗浄を7分間続けます。

洗浄したブロットを関連する二次抗体溶液で室温で90分間インキュベートします。その後、PBSTで7分間、合計4回洗濯を繰り返します。化学発光キットを使用してブロットを現像します。

透明ラップで覆い、化学発光イメージングシステムを用いて画像を取得します。まず、カバーを6ウェル組織カバープレートのウェルに滑り込ませ、次に推奨される培地の各ウェルに250,000個の細胞を播種します。24時間後、PBSで細胞を2回すすぎます。

クルクミンを含む無血清MEMを添加し、5%の二酸化炭素を含む加湿雰囲気で摂氏37度で24時間インキュベートします。この後、再び氷冷したPBSで細胞を洗浄します。暗所で細胞を摂氏37度のインキュベーターで3.7%ホルムアルデヒドに固定します。

細胞をPBSで洗浄し、次に細胞を氷冷したメタノールで摂氏20度で15分間固定します。この後、細胞を3%BSAおよび0.1%Triconex 100のPBS溶液で氷上で10分間インキュベートします。細胞をPBSで洗浄し、ブロッキングバッファーで室温で1時間インキュベートします。

次に、各ウェルで切断したポリフッ化ビニリデン片に60マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。細胞が抗体溶液に接触するようにカバースリップを置きます。暗湿のチャンバーで摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、PBSで細胞を4回洗浄します。ポリフッ化ビニリデンの各片に80マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、細胞が抗体溶液と接触するようにカバースリップを配置します。暗湿チャンバー内で室温で2時間インキュベートします。

この後、PBSで細胞を4回洗浄します。DAPIでサンプルを封入剤に封入し、カバースリップをスライドガラスに固定します。その後、暗室で室温で1時間半インキュベートします。

共焦点顕微鏡を使用してスライドを調べます。この研究では、引用特異的なタウのリン酸化をリン酸化抗体を用いて評価します。クルクミンで処理した細胞は、クルクミンの濃度が増加するにつれて、タウの発現が減少することが見られます。

一方、ホスホタウの発現は、クルクミンの濃度が低いと増加し、非常に高濃度でのみ減少すると見られています。次に、塩化リチウムで処理した細胞を検査します。見てわかるように、タウとリン酸化タウの両方の発現は、塩化リチウム処理下で有意に減少します。

次に、全体的なリン酸化をホスホターゼアッセイによって評価します。タウは、ホスホターゼ処理されたサンプルでは、未処理のコントロールサンプルと比較してより速く移動することが見られ、コントロールサンプルがリン酸化されていることを示しています。クルクミン処理細胞サンプルは非常に類似した結果を示し、治療された結腸直腸癌細胞株がタウリン酸化を減少させなかったことを示しました。

ホスファターゼ処理サンプルと未処理サンプルの両方で、塩化リチウムで処理した細胞サンプルでほぼ同じ範囲に電気泳動が見られ、タウリン酸化の減少が示されました。次に、タウ352をポジティブコントロールとして用いて、細胞サンプルの微小管結合アッセイを成功裏に確立します。ここに示すように、クルクミンと低濃度の塩化リチウム処理はどちらも、微小管の結合活性を阻害します。

その後、共焦点顕微鏡検査を行います。クルクミン治療後、タウは核に移行するのが見られます。これは、核タウがニューロンDNA保護の主要なプレーヤーであると報告されている以前の研究を裏付けています。

このビデオを見れば、タンパク質サンプルの全リン酸化を測定するためのホスフォターゼアッセイの実施方法と、微小管結合アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。免疫蛍光アッセイを、さまざまな少量の抗体を用いた共焦点顕微鏡法で実施する方法を理解できるはずです。ここで紹介する手順は費用対効果が高く、さまざまなタウフォレーゼやがんを治療するための新しい治療法の発見と開発に役立つ可能性があります。