少量循環、血流 - と水没型チャンバー システムで管理急性海馬スライスにおけるシナプス可塑性を記録

この手順の全体的な目標は、少量リサイクルACSFのカーボゲン化の簡素化された手段を確保し、蛍光顕微鏡に取り付けられた記録チャンバーを使用して電界電位の長期記録を達成する方法を提供することです。この方法は、学習と記憶の細胞モードにおける記憶のシナプス伝達と形成を調節する根底にあるリグニン経路に関連する神経可塑性の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、特定のアンタゴニストまたはアゴニストを使用した実験のコスト効率を高めるために、小さなバイオリザーバーの酸素レベルを安定させるのに役立つことです。

急性海馬スライスの調製は、私たちの研究室の博士課程の学生であるXiaとWeiguangによって実証されています。この手順を開始するには、冷間手術用ブレードを使用して、各半球の背側縁に沿って70度の角度で背側皮質の一部を解剖します。冷たい歯科用セメントスパチュラで、各半球を濾紙に移し、表面を短時間乾燥させます。

2つの半球を、速効性の接着剤を使用して氷冷スライシングプラットフォームに切断したばかりの表面で取り付け、半球の尾側の端がかみそりの刃に面するようにします。次に、スライスプラットフォームをビブラトームの冷却チャンバーに入れます。チャンバーに2〜4°Cのスライスバッファーを充填し、カルボギネートします。

その後、適切なバイブロトーム設定を使用して350マイクロメートルのスライスをカットします。海馬の形成を、2つの注射カニューレをはさみとして使用して、小眼球と嗅内皮質から分離します。パスツールピペットを使用して、事前に準備したインキュベーションチャンバーのスライス保持メッシュから気泡を取り除きます。

次に、ピラミッド型層である程度の透明度を持つスライスを、インキュベーションチャンバーのメッシュ上のスライスプラットフォームから大口パスツールピペットで移します。このステップでは、リサイクルシステムの流出に三方チューブコネクタを追加します。三方管コネクタの中央アームをカルボゲン供給管に接続し、エアフローメーターで流量を調整します。

その後、リサイクルシステムの流入に2番目の三方チューブコネクタを追加します。ミドルアームをインラインヒーターに面したチューブに、アッパーアームを細いシリコンチューブに、ロアアームをリザーバーからの流入チューブに接続します。次に、チューブスクイーザーを細いシリコンチューブに、チューブに沿って、ペリストルポンプによって生成されるスライスチャンバー内のACSFの脈動が最小になる位置に配置します。

次に、レンズクリーニングペーパーの小片とU字型のプラチナワイヤーに固定されたナイロンメッシュを水没スライスチャンバーに数分間予浸します。その後、U字型のプラチナ線を外します。リサイクルのスイッチを切り、レンズクリーニングペーパーにスライスを置きます。

次に、スライスを保持しているメッシュをすぐにスライスの上に配置します。ポンプのスイッチを入れ、対物レンズをACSFに浸さずにスライスを30分間平衡化させます。その間に、記録電極にACSFを充填し、ピペットホルダーに取り付けます。

金属刺激電極を重炭酸ナトリウム溶液に入れて、金属刺激電極の絶縁性を確認します。電極を直流電圧発生器の負極に接続し、先端の気泡の形成を解剖顕微鏡で観察します。次に、試験したアポキシ絶縁タングステン刺激電極をマニピュレータホルダーに、基準線をスライスチャンバーに入れます。

チャンバーに2つ目の参照電極を追加し、記録電極のヘッドステージの参照ソケットに接続します。アンプ制御ソフトウェアで、ゼロclをクリックしますamp モードボックスをクリックし、次に出力ゲインリストボックスをダブルクリックします。ゲインを100に選択し、ハイパスフィルターボックス容器をダブルクリックし、3キロヘルツを選択し、ローパスフィルターリストボックスACをダブルクリックして0.1ヘルツを選択します。

録音ソフトウェアで、取得、プロトコルを開くをクリックします。エピソード刺激と10〜20キロヘルツで50〜100ミリ秒の増幅電位のデジタル化を可能にする設定があり、エピソード録音の開始から10ミリ秒後に刺激アイソレータを自動的にトリガーするプロトコルを選択してください。刺激電極と記録電極をピラミッド型層と平行に並べて配置します。

続いて、[acquire]、[edit protocol]の順にクリックし、ポップアップウィンドウでトリガータブを選択します。トリガーソースボックスをクリックし、トリガーソースとしてスペースバーを選択します。次に、[OK]ボタンをクリックし、[記録]ボタンをクリックして取得を開始します。

刺激アイソレータソフトウェアで、電圧制御ボックスをクリックし、ゼロを入力します。ダウンロードボタンをクリックします。その後、録音ソフトウェアウィンドウをクリックし、スペースバーを押します。

このサイクルを繰り返して、1000 から 8000 までの値を順番に入力します。刺激強度をFEPSPスロープ値と相関させ、FEPSPスロープの最大40%を取得するために必要な刺激強度を決定します。電圧制御ボックスをクリックし、決定された値を入力します。

次に、ダウンロードボタンをクリックします。録音ソフトウェアで、停止ボタンをクリックしてから、取得メニューをクリックします。[プロトコルの編集]をクリックし、ポップアップウィンドウでトリガータブを選択します。

その後、トリガーソースボックスをクリックし、トリガーソースとして内部タイマーを選択します。[OK]ボタンをクリックしてから、60秒ごとに電界電位の自動記録を開始する録音ボタンをクリックします。30〜60分後に停止ボタンをクリックします。

録音ソフトウェアで、[取得]、[プロトコルを開く]の順にクリックし、ベースライン録音と同じプロトコルを選択します。[OK]ボタンをクリックし、[録音]をクリックします。フィールドの潜在的な録音を2〜4時間自動的に実行し続けます。

終了したら、停止ボタンをクリックして録音を終了します。この図は、流出カルボゲン化と小さなACSFリザーバーのリサイクルによるリザーバーカルボジェンゼーションを使用したシナプス伝達の活動依存性増強の代表的な記録を示しています。増強は、時点ゼロの後に100ヘルツ/秒の列車の3倍で誘導されました。

この図は、小さなACSF貯留層のリサイクルによる流出カルボゲン化が、リザーバーカーボゲンのみの実験と比較してLTD誘導を改善したことを示しています。マスタリングが完了すると、スライスの準備は5〜10分で完了し、適切に実行すれば、安定した電界電位記録を何時間も達成することもできます。この手順を試行する際には、カルボゲン化レベル、灌流速度、電極の位置、および特定の同等性の刺激ストレスを調整することが重要です。

この手順に続いて、パッチクランプのような他の方法、法医学顕微鏡検査を実行して、活性依存性シナプス可塑性の誘導に応答してラビンプローブの樹液細胞局在化のような追加の質問に答えることができます。この技術の開発後、この技術は、神経可塑性の分野の研究者が、ウェルタブおよびトランスジェニックマウス遺伝子のin vitro海馬スライスにおける学習および記憶の細胞モードとして活動依存的なシナプス可塑性を探求する道を開きます。このビデオを見れば、側頭海馬から急性スライス調製を行う方法と、少量のリサイクルACSFを使用してシナプス伝達を長期間記録するための安定した条件を得る方法について十分に理解できるはずです。

動物や化合物を扱う作業は危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、手袋の着用や適切な消毒などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。