A Caenorhabditis elegans栄養状態ベースの銅回避アッセイ
July 26th, 2017
ここでは、有機体がよく摂食された状態から飢えた栄養状態に進行するにつれて、銅回避行動の変化および共通の食物源を見つける能力を評価するために設計されたCaenorhabditis elegans特異的アッセイを提示する。
この栄養状態に基づく銅嫌悪アッセイの全体的な目標は、嫌悪化学物質と食物源に反応する線虫を4時間にわたって評価することです。これにより、栄養状態の同時評価が可能になります。この方法は、飢餓状態にもかかわらず、運動パターンと嫌悪化学物質への反応を調節できない突然変異体を特定することにより、行動神経科学の分野を支援することができます。
この手法の主な利点は、長期間にわたって実施できるため、4時間で線虫が徐々に飢餓状態になる際の栄養状態を分析できることです。アッセイ用の実験生物を準備するには、アッセイ開始の24時間前にストリームごとに10個のL4ステージ線虫を選択し、試験時に生物が若年成人であることを確認する。試験した変異体または対照線虫ごとに、10個のL4を選択します。
アッセイの24時間前に、OP50 E.Coliを播種した標準的な寒天プレート上で、標準的な方法を用いてL4生物を24時間維持し、定規と太い油性マーカーを使用して、事前に調製した線虫増殖培地またはNGMプレートの下側に外縁に沿って線を引きます。プレートの各エッジから等距離に正中線バリアをマークします。
銅バリアの片側だけに50マイクロリットルのOP50 E.Coliをプレートに播種して、均一な芝生を作ります。プレートの下側にあるマークされた線を使用して、バクテリアが銅溶液に接触しないようにします。銅溶液がプレートの端を裏打ちし、正中線バリアを形成し、細菌を移動させて、銅溶液が食品源に接触しないようにします。
OP50 E.Coliを含まないプレートの2番目のセットをマークし、ネガティブコントロールとして機能します。バクテリアを乾燥させてから、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。線虫を摂氏37度のインキュベーターに移すときに、細菌パッチが乱されないようにしてください。
過度の乱れは、フードパッチの位置や形状を変える可能性があります。一晩インキュベートした後、インキュベーターからプレートを取り出し、プレートのマークされた下側をガイドとして使用して、寒天の端に新たに調製した0.5モルの硫酸銅(II)硫酸塩溶液100マイクロリットルをピペットで動かし、外側の銅バリアを作成します。正中線バリアを作成するために、硫酸銅(II)溶液の25マイクロリットルをピペットで吸います。
硫酸銅(II)溶液がバクテリアパッチに接触しないようにし、銅溶液がプレート上で乾燥するのを待ちます。移し替え後5分ごとに、実験用ティッシュペーパーでプレートの端付近に溶液を軽くたたいて識別し、乾燥を確認します。アッセイの直前に、実験体をバクテリアフリーの寒天プレートに移し、線虫を1分間自由に動かして余分なバクテリアを取り除きます。
次に、24時間前に移植した若年成人のM91ミリリットルをプレートにピペットで移し、線虫を微量遠心チューブに洗浄します。線虫を3, 000 x Gで1分間遠心分離します。ワームはチューブの底にペレットを形成する必要があります。
ウォームペレットを乱さずにM9溶液を吸引します。1ミリリットルのM9溶液をワームペレットに加えます。チューブを反転させて、ワームを溶液と混合します。
過剰な細菌が最初に線虫と一緒に移された場合は、合計5回繰り返します。最終洗浄後、100マイクロリットルのM9溶液とワームペレットが残るまで上清を吸引します。洗浄が完了したら、すぐに溶液からワームを移します。
チューブの底から20マイクロリットルのワームペレットをアッセイプレートのバクテリアフリーハーフにピペットで移動させ、10匹のワームがアッセイプレートに移され、汚染食品が存在しないことを確認します。バクテリアを銅製のフードレースプレートに移してはいけません。1分以内に実験用組織を用いて線虫から余分なM9溶液を除去する。
M9溶液が硫酸銅(II)溶液に接触していないこと、およびワームと寒天の表面が無傷のままであることを確認してください。誤って実験室の組織で除去したワームを廃棄します。M9溶液が除去され、すべての線虫が非液体の自発運動パターンを開始したとき、つまりスラッシングが停止したとき
。アッセイストップウォッチを開始し、誤って余分なワームが含まれていた場合は、ハロカーボンオイルでピッキングしてそれらを取り除き、プレートにバクテリアが追加されないようにします。アッセイプレートを30分ごとにチェックします。バクテリアパッチのあるアッセイプレートでは、生物が4時間以上にわたって食品パッチに到達した場合、生物に正のスコアを付けます。
ネガティブコントロールプレートの場合、生物がバリアを通過した場合は、陽性のスコアを付けます。N2およびnpr-9の機能喪失変異体とnpr-9過剰発現株(npr-9 gain a function)を利用して、飢餓と銅嫌悪に対する応答を評価しました。アッセイの終わりまでに、野生型生物の100%が食物源に移動しましたが、npr-9過剰発現生物は食物に応答して運動パターンを調節せず、食物源に接触した後でも嫌悪障壁を通過し続けました。
食物を含まないプレートでは、n2またはnpr9の機能喪失生物が銅の障壁を越えることはめったになく、npr-9過剰発現の線虫は繰り返し障壁を前後に通過します。この手順を試行する際には、線虫とM9を移す際に銅バリアを乱さないようにすること、および交絡因子を避けるために各株の一貫した条件を維持することを覚えておくことが重要です。
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概要
この研究は、カエンオラビジリス・エレガンスが十分に餌を食べている状態から餌を食べていない状態に移行する際に、銅に対する嫌悪行動と餌源の位置を評価するための、カエンオラビジリス・エレガンス特有のアッセイを提示します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 行動神経科学
- 線虫生物学
背景
- このアッセイは、嫌悪性の化学物質と餌源に対する線虫の反応を評価します。
- 4時間の期間にわたる行動変化を評価します。
- この方法は、飢餓下で運動パターンを調整しない変異体を特定します。
- 線虫が徐々に飢餓状態になるにつれて、栄養状態の分析を可能にします。
研究の目的
- C. elegansにおける銅嫌悪行動の変化を評価すること。
- 異なる栄養状態下での餌源の位置特定能力を評価すること。
- 飢餓条件下での行動反応の理解に貢献すること。
使用された方法
- 4時間の期間にわたってアッセイを実施。
- L4段階の線虫をテストに使用。
- 栄養状態と行動の同時評価。
- 実験のために1ストリームあたり10匹のL4段階の線虫を選別。
主な結果
- 銅に対する嫌悪行動に応じた行動変化を特定。
- 飢餓にもかかわらず、線虫が餌源を特定する能力を示しました。
- 行動神経科学研究におけるアッセイの有効性を強調。
- アッセイが包括的な分析のために時間とともに拡張できることを示しました。
結論
- このアッセイは、C. elegansの行動反応を研究するための貴重なツールです。
- 嫌悪反応の変化を持つ変異体の特定に役立ちます。
- この方法は、栄養状態が行動に与える影響の理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This assay enables behavioral neuroscience researchers to evaluate how nutritional status modulates aversive responses in a genetically tractable model. By tracking copper aversion and food-seeking behavior over time, it supports mechanistic de-risking of targets involved in sensory integration and feeding regulation. The method provides predictive confidence for target validation in pathways linking metabolic state to behavioral output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses about how nutritional status gates aversive chemical responses.
- Operational Value: Enables functional target validation by measuring locomotory pattern modulation in response to combined sensory cues.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying mutants that fail to integrate starvation signals with aversion behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting sensory integration.
- Operational Value: Standardizes quantitative behavioral readouts over extended time courses to improve assay reproducibility.
- Scalability: Permits increased sample size for simultaneous evaluation of large populations, enhancing screening throughput.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage behavioral phenotypes to preclinical models of feeding regulation and sensory processing.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by revealing whether targets affect adaptive behavior under changing metabolic conditions.
- Mechanistic De-risking: Focuses on targets that modulate behavioral flexibility rather than static aversion or attraction.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for pathways linking nutritional state to behavioral output.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of how metabolic cues modulate aversive responses in neural circuits.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized, reproducible quantification of barrier-crossing behavior over four hours.
- Analytics: Generates time-dependent behavioral measurements that enable comparison of genetic or pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling how nutritional status affects decision-making in simple nervous systems.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating multiple targets in sensory integration and feeding behavior pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by revealing dynamic behavioral responses to combined aversive and appetitive cues.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through timed scoring and controlled environmental conditions.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose modulation fails to adapt behavior under metabolic stress.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by distinguishing between static sensory defects and dynamic integration deficits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nematode handling, behavioral observation, and timed assay execution.
- Depends on standardized agar plates, copper sulfate solution preparation, and bacterial lawn control.
- Necessitates cross-team standardization of scoring criteria for food-patch arrival and barrier-crossing events.
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to different genetic backgrounds or environmental stressors.
- Includes practical limitations such as avoiding physical disruption of copper barriers during worm transfers and maintaining consistent incubation conditions.
