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この栄養状態に基づく銅回避アッセイの全体的な目的は、嫌気的な化学物質と食物源に対する線虫の反応を4時間の期間にわたって評価することです。これにより、栄養状態の同時評価が可能になります。この方法は、飢餓状態にもかかわらず運動パターンと嫌気的な化学物質への反応を調整できない変異体を特定することで、行動神経科学の分野に貢献できます。

この技術の主な利点は、長時間にわたって実施できることです。これにより、4時間にわたって線虫が徐々に飢餓状態になるにつれて、栄養状態の分析が可能になります。アッセイを開始する24時間前に、各実験用生物に対して10匹のL4段階の線虫を選び、若い成虫でテストすることを確実にします。テストする各変異体またはコントロール線虫について、10匹のL4を選びます。

実験用生物をアッセイに備えて、標準的なアガープレートにOP50 E.Coliを播種し、24時間標準的な方法でL4生物を維持します。アッセイの24時間前に、厚い永久マーカーと定規を使用して、事前に準備された線虫成長培地またはNGMプレートの裏側に線を引き、プレートの外側の端に沿って線を引きます。プレートの各端から等距離の中間障壁をマークします。

銅障壁の一方側にのみ50マイクロリットルのOP50 E.Coliを播種して、均一な芝生を作ります。プレートの裏側のマークされた線を使用して、細菌が銅溶液に接触しないようにします。銅溶液がプレートの端に沿って線を引き、中間障壁を形成し、銅溶液が食物源に接触しないように細菌を移すようにします。

OP50 E.Coliを使用せずに2番目のプレートセットをマークし、ネガティブコントロールとして使用します。細菌が乾くのを待ってから、プレートを37度セルシウスで一晩インキュベートします。線虫を37度セルシウスのインキュベーターに移動する際に、細菌パッチが乱されないようにします。

過度の乱れは、食物パッチの位置や形状を変える可能性があります。一晩のインキュベーション後、プレートをインキュベーターから取り出し、プレートの裏側のマークをガイドとして使用し、アガーの端に100マイクロリットルの新鮮に調製した0.5モルの硫酸銅(II)溶液をピペットで塗布し、外側の銅障壁を作ります。硫酸銅(II)溶液を25マイクロリットルピペットで塗布し、中間障壁を作ります。

硫酸銅(II)溶液が細菌パッチに接触しないようにし、銅溶液がプレートに乾くのを待ちます。溶液の転送後5分ごとに、実験室用ティッシュを使用してプレートの端近くの溶液を軽くタッチして乾燥を確認します。アッセイの直前に、実験用生物を細菌のないアガープレートに移し、線虫が1分間自由に移動して過剰な細菌を除去します。

次に、24時間前に転送された若い成虫がいるプレートに1ミリリットルのM9をピペットで塗布し、ワームをマイクロ遠心分離チューブに洗い流します。線虫を3,000 x Gで1分間遠心分離します。ワームはチューブの底にペレットを形成する必要があります。

ワームペレットを乱さずにM9溶液を吸引します。ワームペレットに1ミリリットルのM9溶液を加えます。チューブを逆さまにしてワームと溶液を混ぜます。

ワームと一緒に過剰な細菌が最初に転送された場合、合計5回繰り返します。最後の洗浄の後、上清を100マイクロリットルのM9溶液とワームペレットが残るまで吸引します。洗浄が完了したら、直ちに溶液からワームを移します。

チューブの底からワームペレットを20マイクロリットルピペットでアガーのないアッセイプレートに塗布し、10匹のワームがアッセイプレートに移送され、汚染食物が存在しないことを確認します。銅食品レースプレートには細菌を転送しないでください。1分以内に実験室用ティッシュで線虫から過剰なM9溶液を除去します。

M9溶液が硫酸銅(II)溶液に接触しないようにし、ワームとアガー表面が無傷のままであることを確認します。実験室用ティッシュで誤って除去されたワームは破棄します。M9溶液が除去され、すべてのワームが非液体運動パターンを開始した（つまり、揺れが止まった）後、アッセイストップウォッチを開始します。ワームが誤って含まれていた場合、ハロカーボンオイルで摘み取り、プレートに細菌が加えられないようにします。30分ごとにアッセイプレートをチェックします。細菌パッチがあるアッセイプレートでは、4時間の期間内に食物パッチに到達した生物を肯定的にスコアリングします。

ネガティブコントロールプレートでは、障壁を越えた生物を肯定的にスコアリングします。飢餓と銅回避への反応を評価するために、N2とnpr-9の機能喪失変異体と、npr-9の過剰発現株（npr-9の機能獲得と呼ばれる）を使用しました。アッセイの終わりまでに、野生型の生物の100％が食物源に再配置しましたが、npr-9過剰発現生物は食物に反応して運動パターンを調整せず、食物源に接触した後も嫌気的な障壁を越え続けました。

食物のないプレートでは、n2またはnpr9の機能喪失生物は稀に銅障壁を越えましたが、npr-9過剰発現線虫は繰り返し障壁を往復しました。この手順を試みる際、線虫とM9を移動させる際に銅障壁を乱さないようにし、各株に対して一貫した条件を維持して、交絡因子を避けることが重要です。