Name: 急性インビボ麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 学ぶ 急性インビボ電気生理学的記録法を用いて、ウレタン麻酔ラットのHyperdirect経路から局所場ポテンシャルとマルチユニット活性を同時記録する方法。神経精神疾患の病態生理解明と治療バイオマーカー開発に応用可能です。

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私たちの研究に資金を提供してくれたドイツのForschungsgemeinschaft（DFG）、KFO 247に感謝します。

実験手順は、ドイツの動物福祉法（2014年に最後に改訂された）および欧州の規制（2010/63 / EU）に従って実施された。実験は、地方の動物福祉当局（LaGeSo、Berlin）によって承認され、地方の部門および国際ガイドラインに準拠した。 注：提示された方法では、一次運動皮質（M1）と視床核（STN）および網膜黒質（SNr）を連結するハイパーダイレクト皮質 - 基底核線経路から2つの電極モデルを記録する。硬膜外の電気コルチコグラム（ECoG）には、M1特注の低インピーダンスAg / AgCl電極からの記録が使用される。 STNおよびSNrからの記録は、市販の高インピーダンスタングステン電極を用いて行われる。 1.硬膜外Ag / AgCl硬膜外電極の構築<ol><li>約を取る。直径99.99％の真ちゅう製の銀線を5cm長さのストリップrを200μmとし、必要に応じてコーティングを除去する。 </li><li>チップが融解し始めるまで、チップを軽くまたはろうそくの炎の中に下ろします。先端がボール状で直径が約1 mmになるまで待ちます。ボール状の先端の始めからワイヤの端まで15mmの全長に予備成形された電極を切断する。 </li><li>使用された電気生理学的記録システムに適合するワイヤ端部に精密コネクタを半田付けする。はんだ付けポイントを電線の端からコネクターまで導電性銀ワニスで覆う。これは導電性を助け、より良い信号品質をもたらします。 </li><li>導電性ワニスが乾燥した後、3 mm〜1 mmの熱収縮チューブでハンダ付けポイントを覆います。ウォッチメーカーのハンマーを使用して、ボールの先端を厚さの半分に平らにします。 </li><li>試験手袋を着用し、糸くずの出ない清潔な布を100％エタノールで拭いて汚れや油分を取り除きます。 </li><li>電極を15 mLの遠心チューブまたは細胞培養チューブに入れ、球形の先端が完全に覆われるまで家庭用塩素漂白剤（注意：溶媒100 gあたり2.8 gの次亜塩素酸ナトリウムを含む）で満たしてください。 注意：塩素系漂白剤は腐食性があります。必ずメーカーの安全指示に従ってください。 </li><li> 23分後に電極を取り出し、蒸留水で十分に洗い流す。塩化銀層をうまく適用すると、均質な紫色の変化が現れる。 </li><li>空気中で乾燥させる。完全に乾燥させた後、細かいピンセットで電極を取る。細かい絵筆で液状の電気絶縁を施してください。電極先端のすぐ後ろのワイヤーからスタートし、熱収縮チューブまでのすべてをカバーします。断熱材を少なくとも2時間乾燥させる。 </li><li>品質管理のために、マルチメーターで導電率のチェックを行います。可能であれば、適切なインピーダンスメーターを使用して1 kHzでインピーダンステストを行い、電極とテストプローブを互いに接触することなくH 2 O溶液を含む0.9％NaCl中に一緒に入れる。 1kHzでのインピーダンス値は約8kΩです。 </li></ol> 2.電極を定位固定ホルダーに固定する注：MUAとLFPを同時に記録するには、インピーダンスが1.5MΩのタングステン製マイクロワイヤ電極を使用してください。録音の焦点が単一ユニットの高音質記録にある場合は、より高いインピーダンス（&gt; 5MΩ）のマイクロワイヤ電極を選択します。研究の目的がLFPのみに向けられている場合は、低インピーダンスの電極を使用することができます。 dorsoventral stereotaxic調整がしばしば必要な小さな構造の場合、適切な背側先端の分離（この場合は250μm）の電極対を使用する。さらに、これは、必要に応じて、より局所的な参照電極の利点を提供する。定位座標は常に最下位電極から測定され、ブレグマに関連して計算される。 <ol><li>アクリル製ブロックとクランプを備えた標準的な定位電極ホルダーを使用し、外科用顕微鏡の視界の平坦な表面にしっかりと寝かせます。 </li><li>細いピンセットを使用して粘着テープ（3mm×8mm）でホルダーのアクリルブロックに第1の電極対を緩く固定する。電極はアクリルブロックを突き出す必要があります。 12mm。 </li><li>第2のバイポーラ電極を第1の電極の隣に慎重に固定する。超指向性経路の構造を標的とするために、距離は2mmでなければならない（ 図1 ）。ほとんどの標準的な定位電極ホルダでは、これは隣接する凹部である。確認するには、キャリパーゲージを使用します。異なるネットワークにも同じ方法でアプローチできます。このために、アクリルブロックをある程度回転させてもよい。 </li><li>第2の電極対を、腹側の先端が約200である位置に注意深くスライドさせて調整する（ 図1 ）と比較して窪んでいる。顕微鏡視野でこれを行う。このためには、30Gのカニューレ（外径300μm）を使用して距離をより正確に推定します。 </li><li>接着テープを押し、ホルダの金属クランプで固定します。 </li></ol> 3.手術<ol><li>電気生理学的記録には、麻酔のためにウレタン（CAUTION）を使用する。 注意：ウレタンは有毒で発癌性があります。したがって、物質の製造者が指定した安全規則およびデータシートに常に従ってください。 </li><li> 0.9％NaCl生理食塩水中に200mg / mLウレタンの溶液を調製する。 </li><li> 1.3 g / kg体重のウレタンを腹腔内（IP）投与する。ラット系統によっては、麻酔の安全性を高めるために、注射の間に15分の間隔をおいて用量を2回に分けて投与することが妥当であろう。 </li><li> pを使って麻酔の深さを確認するエダム撤退反射および他の適切な反射が含まれる。麻酔が手術を行うのに十分な深さでない場合は、0.15g / kg体重のウレタンIPを注入し、さらに15分間待つ。 </li><li>角膜脱水を防ぐために眼軟膏を塗布する。 </li><li>麻酔中の呼吸数とペダルの逃避反射を常に監視します。手術中に生理的な体温が維持されるように温度コントロール付きの小さな動物の加熱パッドを使用してください。電気生理学的記録を開始する前に、非電気的代替物（ 例えば 、酢酸ナトリウムヘッドパッド）に変更する。 </li><li>清潔な手術野を達成するために、頭の背側に沿って毛皮を剃ってください。適切な外科用消毒剤で切開部位周辺を消毒する。定位枠で動物を固定する。 </li><li>メスで頭皮の矢状方向に2cmの長さの切開を行う。メスを使用して、頭蓋骨髄膜炎をわずかに掻き取り、頭蓋骨を消毒する。共同使用トントンの芽は、残りの組織を除去するために3％H 2 O 2に浸した。 </li><li>必要に応じて、電気か赤外線サーモスタットを使用して出血を制御してください。出血が1-2分後に自発的に止まり、頭蓋骨を見つけられない場合は、頭蓋骨および皮下脂肪からの出血を止める。 </li><li>頭が平らな頭蓋骨の位置になるまで切歯棒を調整します。これは、定位基準点としてのブレグマとラムダが同じ平面にあることを意味します。これは、高い外科手術精度を達成するために最も重要である。標準的な定位固定ラットアライメントツールを使用し、指定された先端を微視的視力下でブレグマに較正し、ツール上のブレグマおよびラムダの指定点が同時に頭蓋骨に接触するまで切頭を調節する。 注：一方の側からの光が他の側からの光で照らされると、この状態を判断するのに役立ちます。あるいは、精密カニューレを用いて定位ホルダーを取り、ブレグマの背側座標を測定する。顕微鏡下でのラムダ。ブレグマとラムダの背側座標が同じになるまで、前歯バーを調整する。 </li><li>カニューレ付きの定位固定ホルダーを使用し、ブレグマに較正し、頭蓋骨のすべてのドリル穴の位置を計算します。定位固定ホルダーを使用して、頭蓋骨を注意深く引っ掻くか、外科用カラーマーカーを使用して、穴あけする穴の位置をマークします。これに対する座標はターゲットに依存し、ブレグマを参照する座標は、小脳参照電極の示唆された座標を含む、 表1のハイパーダイレクト経路について与えられる。 </li><li>マイクロドリルを使用して、すべての穴を慎重にドリルします。 STNとSNrについては、一般的な穴（約2 mm×3 mmのサイズ）を穿孔します。他のすべてのドリル穴は、約1 mmの直径を持つ必要があります。 </li><li> 2つの微細なカニューレ（少なくとも27G）を持ち、硬い表面またはピンセットを使用して、その先端を曲げて鉤状の形状を形成します。これらを使用してdebriを削除しますsをドリル穴から取り出し、共通のSTN / SNr穴の硬膜を注意深く切断して取り除きます。 </li><li>生理食塩水でドリル穴を洗い流す。脳と硬膜が乾燥しないように、ドリルホールに生理食塩水を15分ごとに滴下します。 </li><li>マイクロドリルと適合するステンレススチール製のマイクロスクリュー（ 例えば 、M 1.2 mm x 2 mmスクリュー）を取り、小脳の上の参照硬膜外電極のドリル穴の間のマイクロスクリューに穴とねじを穿孔し、 M1硬膜外電極。 </li><li>参照電極とM1電極のためのドリル穴に自己構築Ag / AgCl硬膜外電極をスライドさせる。細いピンセットで電極先端をガイドし、ドリル穴に頭蓋骨の真下にそれをスライドさせます。 </li><li>両方の硬膜外電極を2成分の歯科用アクリルで固定する。ブレグマ点を覆わず、共通のSTN / SNrの穴にも影響しないように注意してください。 </li><li>タングステンマイクロワイヤ電極を備えた準備されたホルダーを挿入するesを定位フレームに挿入する。 </li><li> STNを標的とするための最も腹側の電極をブレグマに較正する。一般的なSTN / SNrホールの上に計算された位置に調整し、顕微鏡視力下で脳に電極を下ろします。タングステンマイクロワイヤ電極が脳内をスムーズに通過することを確認してください。 </li></ol> 4.電気生理学的マッピングと記録注：このステップでは、ファラデーケージおよびオンラインフィルタリングおよびオンラインスパイクソートが可能な記録ソフトウェアを備えたマルチチャネル電気生理学的記録システムが必要です。好ましくは、動物の頭の近くに配置されたプリアンプと連動して、電気ノイズおよびアーチファクトを最小限に抑えるシステムを使用する。タングステンマイクロワイヤ電極の他に、少なくとも1つの硬膜外電極および1つの参照電極が、超指向性経路の記録を行うために必要である。硬膜外および参照系を挿入することが推奨される電極が互いに接触することなく対をなすようにすることにより、誤動作の場合に役立ち、データ解析において異なるタイプの参照を可能にする。 <ol><li>定位フレームの上にモバイルファラデーケージを置く。固定式ファラデーケージのみが使用できる場合は、注意深く定位フレームをファラデーケージに移動し、脳の深部の電極が定位フレームが最終位置に来るまで脳内に落とさないように注意してください。 </li><li>電極を電気生理学的セットアップのヘッドステージに接続します。参照電極が適切な参照チャネルに接続されていることを確認します。 </li><li>レコーディングソフトウェアを設定します：バンドパスフィルタ（0.05〜8,000 Hz）と生データ信号を増幅（1,500〜2,000倍のゲイン）します。適切な設定（LFPにはバンドパスフィルタ0.05〜250 Hz、MUAにはバンドパスフィルタ300-8,000 Hz）を使用して、オンラインLFPおよびスパイクフィルタを使用します。すべてのフィルターについては、バターワース型フィルターを使用してください。 </li><li>該当する場合は、onlinにスパイクしきい値を設定します電子スパイクソート。ほとんどのレコーディングソフトウェアは、信号がソフトウェアによってスパイクとしてマークされる振幅値であるスパイクしきい値の設定を可能にします。この閾値は、フィルタリングされたスパイク信号の平均振幅のファクタまたは標準偏差として数学的に決定することができ、または好ましくは、データセグメントを500ms未満の目視検査によって決定し、グラフィカルユーザーインターフェース。 注記：スパイク閾値を設定する意図は、現在記録されているニューロンの数とそのスパイクがどのように形成されているかに関する情報を提供するために、スパイクとソート単位をカウントすることです。 </li><li>タングステンマイクロワイヤ電極をターゲットの背部1mmまでゆっくりと下降させます。これはハイパーダイレクト経路のSTNです。必要に応じて信号が安定するのを待ちます。 </li><li>電気生理学的マッピングのために、100μmのステップで電極を腹側に前進させる。各ステップで、発射パターンを評価し、発射rスパイクの食べ物と形。 図2の典型的な例と比較してください。一般に、密度の高い核は、いくつかの背側ステップにわたって高速かつ連続的にスパイクするが、繊維に富む構造は、その後の腹側ステップでは、発火率が低く、均一なスパイク活動が少ない。 </li><li>ハイパーダイレクト経路では、最も腹側の電極がSTNの内側にあることを確認してください。 注：Zona incertaの腹側でMUAのかなりの増加が検出されると、STNに達します。 STNの腹側では、電極が内部カプセルに到達したためにスパイクがほぼ完全に止まります。最も腹側の電極がSTNにあるとき、タングステン微小電極の構成は、後方の第2の電極がSNr内にあることを保証する。 STNとSNrの典型的なMUAを同時に記録するには、少しずつ微調整する必要があります。 MUAの頻度は、実際に記録されたニューロンの数および脳のレベルに依存することに留意されたい活性化。 </li><li>電極が所望の構造になったら、オンラインフィルタリングとスパイクソートを設定し（ 図4参照）、データの記録を開始します。 LFP記録で識別できる異なる皮質同期状態の典型的な例を図3に示す。 </li></ol> 5.実験の終了<ol><li>記録が終わったら、電極をゆっくりと脳から持ち上げ、生理食塩水で瞬時に洗い流します。電極は、徹底した洗浄および目視検査の後で再使用することができる。放電電極を曲げる。 </li><li>過量のウレタン（2.5g / kg体重）のIP注射によって動物を安楽死させる。 注記：ウレタンは最終的な手順にのみ使用してください。 </li><li>電極の位置または他の組織学的染色手順の組織学的検証が必要な場合は、頭蓋骨から脳を取り出し、適切に組織。 注：目的の染色方法によっては、経心筋灌流が必要な場合があります。電極位置の死後検証のために、標準的なNissl染色では、ほとんどの場合、 例えば冠状脳切片における電極軌道を視覚化するのに十分である。組織学的標的検証を容易にするさらなるアプローチには、記録電極を介して電流を印加することによって、または電極挿入の前に生体適合性染料を適用することによって、電気的に誘導された病変を脳組織に使用することが含まれる16,17 。 </li></ol>

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</ol>

著者は何も開示することはない。

本研究では、この方法は、齧歯類のSTNおよびSNrとM1とを連結するハイパーダイレクト大脳基底核節経路の例を用いて、所定のネットワークの複数の部位から同時に細胞外電気生理学的シグナルを記録する方法を示す。 STNのような小さな皮質構造の記録における重要なステップは、記録電極をターゲットに正確に誘導して挿入することである。提示された方法では、2つの重要なステップを考慮して、高い精度のターゲティングを保証する。脳に電極が導入される前に定位装置で動物を準備するときは、頭蓋骨が「平らな頭蓋骨」位置22に来ることを確認することが絶対に必須である。平らな頭蓋骨の位置を達成するために、定位フレームの前歯バーの位置は、ブレグマ及びラムダ参照点の高さo頭蓋骨は同じ背平面21にある 。この位置を保証することによってのみ、定位アトラスに見られる座標は、平坦な頭蓋骨の位置21に基づいているので、個々の実験動物に高精度で適用することができる。また、実験的な証拠は、...

パーキンソン病（PD）および統合失調症などの異なる神経精神障害に関する最近の累積的証拠は、それらの病態生理が、しばしば皮質および皮質下構造1,2,3を含む拡張された神経回路の重大な機能不全に基づくことを強く示唆する。この理論によれば、疾患の臨床症状は、単一細胞または特定の神経細胞要素1,2,3の代わりに、細胞のネットワークの情報処理能力の障害の結果として生じる。神経精神医学的疾患のこの複雑な群の理解を高め、新しい治療法を見つけるためには、ヒト患者および動物モデルにおけるこれらの無秩序なネットワークの神経動態を詳細に特徴づけることが必須である。優れた生存者の大規模ネットワークを研究するための方法は、細胞外電位のマルチサイト電気生理学的記録である4 。この方法を使用すると、シナプス電位5によって生成される、興奮性および抑制性のシナプス後電流およびマルチユニット活性（MUA）の時間的総和を主に表す局所電場電位（LFP）を同時に評価することが可能である5 。細胞外ポテンシャルの記録は、機能的磁気共鳴イメージングやカルシウムイメージングなどのネットワークを研究する代替方法に比べて時間的および空間的分解能が高く、遺伝子操作された生物に依存しないためいくつかの利点があります5 。しかし、細胞外インビボ記録の使用は、普遍的に適用することができない侵襲的技術であるため、限られている。 インビボ電気生理学的記録麻酔した動物だけでなく、目を覚ましても発作を行うことができる6 。どちらの方法も特定の賛否両論を伴います。目覚めた動物の研究は、定義された行動課題の実行中に脳信号を記録することを可能にするが、運動関連および他の人工物に罹りやすい7,8 。一方、麻酔動物での記録は、高度に定義された皮質の同期状態で最小限のアーチファクトを伴うLFPおよびMUAを評価する機会を提供するが、結果はまた、覚醒した被験者9,10,11 において見いだされるものとある程度異なる。 近年、LFPのサンプリングは、ネットワーク活動の病理学的変化を描写するために特に有用であることが実証されている。その顕著な例は、ヒト患者におけるPDの病態生理学に関する研究である皮質基底核節におけるβ振動の増強がパーキンソン病運動症状に関連していることが示された12,13）。この研究の結果、ベータ振動が閉ループ深部脳刺激のためのオンラインフィードバックバイオマーカーとして使用できるかどうかが現在研究されている14,15 。 本研究では、ウレタンで麻酔したラットのLFPおよびMUAの急性多部位インビボ電気生理学的記録の詳細な説明を提供する。ハイパーダイレクトの皮質 - 基底核節経路などの完全なネットワークが、標準およびカスタマイズされた電極を使用して電気生理学的に特徴付けられる方法、およびそれらの電極を構築する方法を実証する。基底核核の正確な標的化がどのようにして共役によって達成され得るかが特に強調されるMUAのオンライン登録と一緒に定位手術を行う。

<table><tbody><tr><td>Ag/AgClカスタム硬膜外電極</td><td>Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com</td><td>99.99%銀線</td><td>Ag/AgCl電極の製品ID AG005127は、より良い信号品質を可能にしますが、急性実験でのみ使用できます。交換可能なもの ステンレス製電極</td></tr><tr><td>アクリルブロック付き固定装置ホルダー</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td><td>製品ID モデル1770 標準電極ホルダー</td><td>アクリルブロックには、目的のターゲットの電極設定に適したくぼみがあることを確認してください。アクリルブロックは、ファイルで簡単に変更して、目的の構成にすることができます。可能な交換: 自己構築電極ホルダー</td></tr><tr><td>タングステンマイクロワイヤー電極 1.5 M&Omega; インピーダンス</td><td>Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way&nbsp;Gaithersburg, Maryland, 20879 USA</td><td>Product-ID WE3ST31.5A5-250um</td><td>1.5 M&Omega;は、MUAとLFPを同時に記録するために必要です。交換可能:異なる材料の微小電極を使用することができます。電極は、まっすぐで、堅牢で、できるだけ薄くなければなりません。</td></tr><tr><td>ラットアライメントツール</td><td>David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA</td><td>製品ID モデル944 ラットアライメントツール</td><td>脳の正確な向きを定位固定アトラスに合わせることができます。交換可能なもの: カニューレ付き脳定位固定ホルダー</td></tr><tr><td>2成分歯科用アクリル</td><td>Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom</td><td>Simplex Rapid Powder Clear 225g, 製品コード: ACR803;シンプレックス ラピッドリキッド 150ml、商品コード:ACR920</td><td>使用する電極によっては、電極が小さくて軽量であれば、瞬間接着剤が簡単な代替品となる場合があります。可能な交換: 瞬間接着剤(シアナクリレートベース)</td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>自己構造</td><td></td><td>適切なファラデーケージは、電磁アーティファクトからの最高の保護になりますが、箱の形に形成したり、フレームに適用したり、導電性材料で作られているすべてのものが役立つ場合があります。可能な交換:</td></tr><tr><td>記録ソフトウェアとオンラインスパイクソーティング機能を備えた</td>アルミホイルまたは銅メッシュ電気生理学的セットアップ<td>OmniPlex&reg; Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA</td><td></td><td>オフラインソーティングソフトウェアは、オープンソースコミュニティで複数のスクリプトとソフトウェアを無料で見つけることができる潜在的な代替手段です。</td></tr></tbody></table>

急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるhyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

Acute In Vivo Electrophysiological Recordings of Local Field Potentials and Multi-unit Activity from the Hyperdirect Pathway in Anesthetized Rats

収斂する証拠は、多くの神経精神病が大規模なニューロンネットワークの障害として理解されるべきであることを示している。これらの疾患の病態生理学的基礎をよりよく理解するためには、回路の異なる神経部分の間で情報の処理がどのように妨害されるかを正確に特徴付けることが必要である。細胞外in vivo電気生理学的記録を用いて、ニューロンネットワーク内のニューロン活動を正確に描写することが可能である。この方法の応用は、機能的磁気共鳴イメージングおよびカルシウムイメージングなどの代替技術に比べて、固有の時間的および空間的分解能を可能にし、遺伝子操作された生物に依存しないため、いくつかの利点を有する。しかし、細胞外インビボ記録の使用は、普遍的に適用することができない侵襲的技術であるため、限られている。この記事では、シンプルで使いやすいメソッドが紹介されています。ネットワークの複数の部位で、局所的な場電位およびマルチユニット活動のような細胞外電位を同時に記録することが可能である。定位手術とマルチユニット記録のオンライン分析を組み合わせて、どのようにして皮質核の正確な標的設定を達成することができるかについて詳述しています。従って、ハイパーダイレクトコルチコ - 基底核節のような完全なネットワークがインビボで麻酔された動物においてどのように研究され得るかが実証される 。

本明細書で使用される記録電極では、STNおよびSNrから一次運動皮質、視床下部核および黒質線維網およびMUAからLFPを採取することが可能である。最初に、LFPと複数ユニットのアクティビティは、広帯域信号で一緒に記録されます。その後、LFPとMUAは帯域通過フィルタ（LFPの場合は0.05〜250 Hz、MUAの場合は300〜4000 Hz）で分離されます。 皮質核、特にSTNのような小さな構造の正確な標的設定のためには、計画された定位座標をオンラインで記録されたMUA信号と整列させることが有利である。 STN特性をターゲットにした電極軌道に対して、MUAパターンを記録することができます（ 図2 ）9,20。 分析の後のステップについては、主成分分析（ <strong cl...

この研究では、方法論は、ウレタン麻酔下での超指向経路からのマルチサイトインビボ電気生理学的記録をどのように行うかについて提示されている。

急性<em&gt;インビボ</em&gt;麻酔ラットにおけるHyperdirect経路からの局所場ポテンシャルとマルチユニット活性の電気生理学的記録

Converging evidence shows that many neuropsychiatric diseases should be understood as disorders of large-scale neuronal networks. To better understand the ...

この実験の全体的な目的は、麻酔下にあるラットの大脳皮質・基底核ループから、局所フィールド電位およびマルチユニット活動の急性的in vivo電気生理学的記録を行う方法を実証することです。この手法は、精神神経疾患における複雑な病態生理に病的な振動がどのように寄与しているかなど、神経科学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、脳のさまざまな皮質および皮質下ターゲットから細胞外電位を同時に記録できることです。局所フィールド電位をクローズドループ刺激などの治療のバイオマーカーとして利用できる可能性があるため、この手法の意義はさまざまな神経精神疾患の治療にまで及びます。この方法は基底核の病態生理に関する洞察を提供しますが、他の脳領域にも適用可能です。この手順を開始するには、直径200 µm、長さ5 cmの銀線を準備し、必要に応じてコーティングを除去してください。次に、電極の先端が溶けて直径1 mmの球状になるまで、ワイヤーの先端を炎にかざします。その後、球状の先端からワイヤーの末端まで、全長が15 mmになるように電極を切断します。ワイヤーの末端に、電気生理学的記録システムに適合する精密コネクタをはんだ付けします。次に、導電性を向上させるため、電線の端からコネクタまでの接合部を導電性銀ニスでコーティングします。導電性ニスが乾燥した後、接合部を1〜3 mmの熱収縮チューブで覆います。時計職人用ハンマーを用い、球状のチップを慎重に叩いて厚みの半分まで平坦にします。続いて、検査用手袋を着用し、100% ethanolを浸した糸くずの出ないクリーニングクロスを用いて、汚れや油脂を除去します。次に、電極を15 milliliterの遠心チューブまたは細胞培養チューブに入れ、球状のチップが完全に浸かるまで家庭用塩素系漂白剤を満たします。23分後、電極を取り出し、蒸留水で十分に洗浄します。塩化銀の塗布が成功すると、電極表面は均一に濃い紫色になります。その後、電極を空気中で乾燥させます。完全に乾燥した後、精密ピンセットで電極を取り出してください。次に、細い絵筆を使用して、電極に液体絶縁塗料を塗布します。電極チップの直後にあるワイヤーから塗り始め、熱収縮チューブまで全体を覆います。その後、絶縁塗料を少なくとも2時間乾燥させてください。このステップでは、粘着テープを使用して、最初の一対の電極をホルダーのアクリルブロックに軽く固定します。電極がアクリルブロックから約12 millimeters突出するようにしてください。次に、2番目のバイポーラ電極を1番目の電極の隣に慎重に固定します。ハイパーダイレクト経路の構造を標的とするため、電極対の間隔は2 mmにする必要があります。顕微鏡下で、2番目のバイポーラ電極を慎重にスライドさせ、最も腹側の先端が1番目の電極よりも約200 µm低くなる位置に調整します。粘着テープを押し付け、ホルダーのメタルクランプで電極を固定します。動物を麻酔した後、術野を清潔にするために頭部を剃毛します。動物を脳定位固定装置に固定し、切開部位とその周辺を適切な外科用消毒剤で消毒します。その後、メスを用いて頭皮を正中線方向に沿って2 cmの長さで切開します。メスを使用して頭蓋膜を軽く削り取り、3%過酸化水素で頭蓋骨を消毒します。次に、3%過酸化水素に浸した綿棒を使用して、残っている組織を取り除きます。続いて、頭蓋骨の頂点が水平になるまで切歯バーを調整します。これにより、ステレオタキシスの基準点であるブレグマとラムダが同一平面上に配置されます。顕微鏡下で、標準的なラット用脳定位固定装置のアライメントツールを使用し、指定のチップをブレグマに合わせて校正し、ツールのブレグマおよびラムダの指定点が同時に頭蓋骨に接触するように切歯バーを調整します。カニューレを備えた定位固定ホルダーを用いてブレグマに合わせて校正し、頭蓋骨上のすべての穿孔位置を算出します。その後、頭蓋骨を慎重にひっかくか、外科用カラーマーカーを使用して、穿孔する位置に印を付けます。次にマイクロドリルを使用し、直径約1mmの穴を慎重にすべて開けます。STNおよびSNrについては、約2mm×3mmの共通穴を開けます。1本の細いカニューレを取り、先端を曲げて2つのフックを形成します。次に、フックを用いてドリル穴から破片を取り除き、STN/SNr共通のドリル穴にある硬膜を慎重に切開して除去します。その後、ドリル穴を生理食塩水で洗浄します。脳と硬膜の乾燥を防ぐため、15分ごとにドリル穴に生理食塩水を1滴滴下してください。次に、マイクロドリルと適合するステンレス製マイクロネジを用いて、小脳上の基準硬膜外電極のドリル孔の間に穴を開け、マイクロネジをねじ込みます。続いて、微細ピンセットで電極先端を誘導し、頭蓋骨の直下のドリル孔へと挿入します。すべての硬膜外電極を2液性アクリル製ステンシルで固定します。ブレグマ点を覆わないようにし、またSTN/SNrの共通穿孔部位に影響を与えないように注意してください。次に、タングステン微細電極を装着した準備済みのホルダーを立体定位固定装置に挿入します。STNを標的とする、最も腹側に位置する電極をブレグマに合わせて校正してください。共通のSTN/SNr孔の上の計算位置に調整し、電極を脳まで降ろします。タングステンのマイクロワイヤー電極がスムーズに脳内に挿入されるようにしてください。この手順において、バンドパスフィルターなどの記録ソフトウェアを設定し、生データの信号を増幅させます。次に、適切な設定を用いてオンラインLFPおよびスパイクフィルターを使用します。すべてのフィルターにはButterworth型フィルターを使用してください。オンラインスパイクソーティング用にスパイク閾値を設定します。ほとんどの記録用ソフトウェアでは、スパイク閾値を設定することができます。これは、信号がソフトウェアによってスパイクとしてマークされるための閾値となる振幅値です。次に、タングステン極細線電極をSTNの1 mm上までゆっくりと降ろし、必要に応じて信号が安定するまで待ちます。電気生理学的マッピングを行う際は、電極を100 µmずつ腹側に進めてください。各ステップにおいて、発火パターン、発火率、およびスパイクの波形を、付属論文の図2に示されている代表的な例と比較して評価してください。電極が目的の構造に配置されたら、オンラインフィルタリングとスパイクソーティングを設定し、データの記録を開始します。以下は、一次運動野における代表的な600秒間のLFP記録です。活性化状態に対応する高周波・低振幅活動の時間帯と、徐波活動状態に対応する低周波・高振幅の時間帯を区別することができます。そして、これは600秒の間隔における対応する時間周波数プロットであり、LFPの0から20 Hertzの相対パワーを示しています。習得すれば、適切に実施することでこの手法は2時間で完了できます。このビデオを視聴することで、麻酔下にあるラットの大脳皮質-基底核ループから細胞外in vivo電気生理学的記録を行う方法について、十分に理解することができます。

acute-vivo-electrophysiological-recordings-local-field-potentials

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、麻酔をかけたラットを複数の部位からの脳活動の電気生理学的記録のために準備するための詳細な手順を示しています。頭皮を解剖して頭蓋骨にアクセスし、電極を取り付けて固定するために正確な位置に穴を開けます。次に、タングステンマイクロワイヤ電極を目標位置に挿入してデータを記録します。...

ラットの複数の部位からの脳活動のin vivo電気生理学的記録

このビデオは、麻酔をかけたラットで共局在脳波(EEG)と局所電位(LFP)を同時に記録する手順を示しています。このプロセスには、ラットを準備し、そのウィスカーパッドに刺激電極を取り付けることが含まれます。脳波クモ電極をラットの頭蓋骨に配置して、表面の脳波を測定します。同時に、マルチチャンネルの微小電極を頭蓋骨のバリ穴から特定の脳領域に挿入し、局所的な脳領域からの神経活動を記録します。...

麻酔ラットにおける脳波および局所電位記録の同時実施

この手順では、等電脳の状態で、その結果、生理学的に関連する脳の状態の間、継続的な電気的活動の完全な廃止後に単一ニューロンからの長期的なin vivoでの細胞内記録を行います。動物の生理学的定数は慎重に人工的な昏睡状態への移行中に監視されています。...

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、麻酔をかけたラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の同時測定を説明しています。...

麻酔ラットにおける電図および視覚誘発電位の同時記録

私たちは、記録が麻酔の交絡せずに行われている人間の状態により類似している眼（網膜電位）と覚醒ラットにおける脳（視覚誘発電位）、からの視覚的な電気生理学的信号を測定するための外科的移植や録音手順を示しています。...

覚醒ラットに移植し、無線電図の記録と視覚誘発電位

このプロトコルでは、共局在脳波 (EEG) や麻酔下のラットにおける潜在的なマルチ-層流のローカル...

共局在脳波および齧歯動物のローカル フィールド電位の同時記録

本研究では、脳、心電図、筋電図、局所電界電位の同時計測と自由行動ラットの信号を呼吸するためのメソッドを紹介します。この技術は、実験のコストを削減し、データの分析を簡素化は、脳と末梢器官との間の相互作用の理解に貢献します。...

皮質局所電界電位、心電図、筋電図、呼吸リズム自由行動ラットからの同時録音

微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー...

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

我々 は自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で下角と局所電界電位を同時に記録する技術を開発しました。この手法は、侵害受容情報の脳内処理の検討を容易にするメゾスコ ピックおよびマクロスコ ピック レベルで electrocortical...

大脳皮質の局所電界電位と自由行動ラットから侵害受容のレーザー刺激への応答で Electrocorticograms の同時録音

このプロトコルは、頭部固定マウスの脳幹から in vivoで高密度の単一ニューロン記録を取得する方法を説明する。このアプローチは、全身麻酔前および全身麻酔中に、腹外側水道周囲灰色 (急速眼球運動 (REM) 睡眠中に不活性な脳幹領域)...

頭部固定マウスの脳幹からの急性単一ユニット多電極記録

ここでは、急性麻酔下のin vivo...

麻酔ラットにおける末梢疼痛ブロックを評価する電気生理学的手法

学ぶ 急性インビボ電気生理学的記録法を用いて、ウレタン麻酔ラットのHyperdirect経路から局所場ポテンシャルとマルチユニット活性を同時記録する方法。神経精神疾患の病態生理解明と治療バイオマーカー開発に応用可能です。

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