新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

この実験の全体的な目標は、トランスポゾンを介したランダム挿入、競合実験、および全ゲノムシーケンシングを使用して、任意のDNA要素の最適な染色体位置を決定することです。この方法は、遺伝要素の染色体位置の重要性など、DNA複製分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の利点は、トランスポゾンベースのランダム挿入と、成長の利点による最適なクローンの選択を組み合わせていることです。

ここでは、大腸菌DARS2領域によって簡略化されています。この方法は、大腸菌の染色体組織に関する洞察を得ることができますが、他の細菌にも適用できます。テキストプロトコルに従ってMG1655 delta DARS2などのエレクトロコンピタントセルを調製した後、1マイクログラムのpNKBOR DARS2を40マイクロリットルの細胞に加え、混合物を事前に冷却した滅菌0.2センチメートルギャップキュベットに移します。

キュベットをエレクトロポレーションチャンバーに挿入します。次に、18キロボルト、500オーム、25マイクロファラッドでセルをエレクトロポレートします。時定数は約 5 ミリ秒で、アーク放電は発生しません。

細菌懸濁液を1ミリリットルの予熱したLBブロスに再懸濁し、15ミリリットルの試験管に移すことにより、細菌懸濁液を迅速に回収します。37°Cの曝気増殖条件下で、抗生物質を選択せずに30分間細胞をインキュベートします。次に、50マイクログラム/ミリリットルのカナマイシンを補充したLB寒天プレートに細菌をプレートし、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、エレクトロポレーションからコロニーを数えます。1つのコロニーは、1つの染色体トランスポゾン挿入に等しいと考えられます。各プレートに1ミリリットルのLBブロスを追加し、すべてのコロニーを洗い流します。

同じ1ミリリットルのLBブロスを再利用して、細菌濃度を上げます。次に、すべてのコロニーを同じ50ミリリットルのチューブにプールします。チューブをボルテックスして出発物質を凍結し、1ミリリットルの細胞懸濁液と1ミリリットルの50%グリセロールを氷上で混合します。

チューブをドライアイスに10分間移します。培養物が凍結したら、マイナス80°Cの冷凍庫に移します。トランスポゾンライブラリをマイナス80°Cの氷上で解凍します。

ピペッティングで混合し、100マイクロリットルのトランスポゾンライブラリを15ミリリットルの試験管で10ミリリットルのLBに移します。37°Cで8時間連続振とうして通気した細胞を固定相に成長させます。必要に応じて、パラメータをさまざまな成長条件に調整します。

細菌集団を約10世代ごとに増殖させるには、10マイクロリットルの以前の固定相を10ミリリットルの新鮮な予熱培地に移し、さらに8時間培養して固定相まで増殖させます。100世代にわたる競技会の後、1ミリリットルのサンプルを5つ保存し、マイナス80°Cで保存します。ここに記載されている特定のプライマーを使用したPCR増幅により、NKBORの1キロバイト切片に対するサザンブロット用のプローブを調製します。

次のプログラムを使用してサンプルを実行します。得られたPCRフラグメントを、Smith氏によるランダムプライマーシステムを用いてP32標識dATPで標識し、テキストプロトコルに従って全細胞DNAを調製します。Pvulで全細胞DNAを消化し、プローブで覆われた領域の外側にある関心領域を含むNKBORを切断します。

0.7%アガロースゲルを用いて、Loebner-Olsenおよびvon Freieslebenに従ってサザンブロットを行います。1つのクローンからDARS2挿入部位を同定するためには、推定700世代の競合の後、まずLB寒天プレート上に細菌を拡散させ、37°Cで一晩インキュベートすることにより、PCRテンプレートのゲノムDNAを単離します。LBブロスに単一コロニーを接種し、摂氏37度で一晩成長させます。

次に、20マイクロリットルを200マイクロリットルのオートクレーブ蒸留水に移します。コロニーを溶液にボルテックスし、混合物を摂氏100度で10分間加熱します。サンプルを最高速度で5分間遠心分離し、その後、細胞ライセートをマイナス20°Cで保存して、将来の使用に備えます。

次に、ここに示すように、選択したトランスポゾン内でアニールする3つのネストされたプライマーを設計します。200ナノグラムのゲノムDNA、ネストされたプライマー1、およびランダムプライマーを使用して、20マイクロリットルのPCR反応を調製します。次に、次のプログラムを使用してサンプルを実行します。

2回目の増幅には、最初の反応の1マイクロリットルをテンプレートとして使用し、ネストされたプライマー2と同じランダムプライマーを使用します。ネストされたプライマー3、同じランダムプライマー、およびテンプレートとして第2の反応から1マイクロリットルを使用して、同様の方法で第3の反応を実行します。最終PCR反応の産物を1.5%アガロースゲルおよびスタチンとエチジウムブロマイドで分析します。

100〜800塩基対の範囲のバンドを切り取り、製造元の指示に従って市販のDNAゲル抽出キットを使用してDNAを単離します。フローサイトメトリーを実施するには、各細菌培養物を指数関数的増殖期に少なくとも10世代維持することにより、バランスを取ります。OD600を測定し、0.3を超えないようにします。

テキストプロトコルに従ってリファンピシンのランアウトを行うには、1ミリリットルの培養物を30マイクロリットルのRIF-CEFを含む15ミリリットルのチューブに移します。チューブを摂氏37度で最低4時間振とうしながらインキュベートします。EXPサンプルの場合は、指数関数的に増殖する1ミリリットルの培養物を氷上の1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、Gの15,000倍および摂氏4度で5分間遠心分離することにより細胞を回収します。ペレットを100マイクロリットルの氷冷10ミリモルトリスpH 7.5に再懸濁し、1ミリリットルの氷冷77%エタノールを追加します。.サンプルは使用するまで摂氏4度で保管してください。

15,000倍Gで15分間遠心分離することにより、100〜300マイクロリットルの固定細胞を回収することにより、細胞を染色します。上清を取り除き、130マイクロリットルのDNA染色液を使用してペレットを再懸濁します。次に、サンプルを氷上および暗闇で10分間インキュベートします。

最後に、フローサイトメトリーを使用して、細胞あたりの起源、相対的な細胞質量、および相対的なDNA含有量を決定します。最初のトランスポゾンプールからDNAを抽出し、700世代にわたる競技会のうち推定100世代ごとにDNAを抽出した後、トランスポゾンNKBOR DARS2をプローブでカバーされていない領域で1回切断することが知られているPvulでDNAを切断し、サザンブロットを行いました。ここに示すように、初期のDARS2プールには明確なバンドが欠けており、これはDARS2が染色体全体にランダムに挿入されたことを示しています。

時間が経つにつれて、DARS2クローンの最初の大きなプールが、1つまたは少数の永続的なDARS2クローンに発展するというパターンが現れました。全ゲノムシーケンシングを使用して、開始プールからDARS2挿入部位を同定しました。そして、400世代、500世代、700世代にわたる挿入配列の代表的サブセットでの競争の後、すべてのDARS2挿入の98%が野生型のDARS2染色体位置の近くに見出されました。

そして2%は染色体の他の場所で発見されました。DARS2欠損細胞は、野生型細胞と比較して同期して複製を開始し、起源濃度が減少することが以前に示されていました。ここでは、末端にDARS2エレメントが存在すると、同期性や細胞起源のコンテンツが野生型レベルに回復することはありませんが、選択されたDARS2クローンIRおよびRPPHは同期して複製を開始します。

このビデオを見れば、特定のDNA要素の最適な染色体位置を決定する方法についてよく理解できるはずです。これは、トランスポゾンベースのランダム挿入とそれに続く競争実験、そして最後に全ゲノムシーケンシングによって行われます。