Name: 新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶトランスポゾンを介したランダム挿入法と競合実験、全ゲノムシーケンスを用いて大腸菌のDNA要素の最適な染色体位置を決定する手法。この方法は細菌の染色体構造理解に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、細菌のストレス応答と永続性 (BASP) ノボ ノルディスク財団とルンドベック財団、中心を通ってデンマークの国立研究財団 (DNRF120) からの助成金で賄われました。

1 トランスポゾン ライブラリのコレクション 注: ミニ Tn 10 に複製された染色体 DARS2 の軌跡-トランスポゾン (pNKBOR) に NKBOR 21 の結果を基。NKBOR:: DARS2 (pJFM1)。pNKBOR オンライン 22 が得られます。pNKBOR は、イニシエーター蛋白質 π をレプリケーション 23 R6K ベース自殺ベクトルです。プラスミド pJFM1 つまり、pir 遺伝子の染色体コピーを含む 大腸菌 の菌株 (例えば Dh5α λ pir) に複製することができます。しかし、pJFM1 は、Pir 欠損または MG1655 に変換されると、pJFM1 をレプリケートできません、NKBOR のランダムな挿入によって生成されたカナマイシン耐性クローンの選択につながる:: 細菌の染色体に DARS2。わかりやすくするためは、これらを DARS2 挿入と呼びます。方法論の図式の 図 1 を参照してください。
<ol><li>準備 electrocompetent MG1655 Δ DARS2 積極的に成長してから細胞のホストゲノム スープ (LB) 37 ° C 24 で成長しています</li>。
	Electrocompetent MG1655 Δ に <li>Electroporate pJFM1 DARS2、ゴンザレス ら によると 24 electrocompetent 大腸菌 MG1655 Δ <ol><li>40 (水の 1 μ L) で pJFM1 の追加 1 μ μ DARS2 中古冷蔵、滅菌の 0.2 cm ギャップ キュベットにこの混合物を転送。キュベットをエレクトロポレーション室に挿入します。18 Electroporate kV、500 Ω、25 μ F。時定数は ~5.0 ms をする必要があります、アーク放電は発生しません</li>。
		<li>流体培養基 LB に予め温めておいた 1 mL、15 mL の試験管に転送で再によって細菌懸濁液をすばやく回復します</li>。
		<li>抗生物質選択なしの 30 分の 37 ° C で気泡の成長条件の下での孵化によって回復細胞ができます。50µg/mL カナマイシンを添加した LB 寒天培地プレート上に細菌をプレートし、37 ° C で一晩インキュベートします</li>。
	</ol></li> <li>、エレクトロポレーションからコロニーをカウント: 1 つのコロニーは 1 つの染色体のトランスポゾン挿入に等しいと見なされます 。
	注: 目、コロニー カウンターは、コロニーが数えることができます。コロニーの数、各クローンの染色体にあるトランスポゾンを分離する平均距離に反比例します</li>。
	流体培養基 LB のそれぞれに追加の 1 mL <li>プレートし、すべてのコロニーを洗い流して; 流体培養基 LB の 1 mL は 〜 100,000 コロニーを洗浄するための十分な必要があります。流体培養基 LB の細菌濃度を増加する同じ 1 mL を再利用します。同じ 50 mL のチューブですべてのコロニーをプールします</li>。
	<li>渦管凍結開始材料と (t = 0)。それを凍結、氷の上の 50% のグリセロールの 1 mL の細胞懸濁液の 1 mL を混ぜます。10 分のドライアイスにチューブを転送します。文化が固定されている一度は-80 ° C のフリーザーにそれらを転送します 。
	注: 50,000 CFU/mL 以上の細胞濃度はこの段階で予想します</li>。
</ol> 2。LB の競争実験 <ol><li>融解氷-80 ° C からトランスポゾン ライブラリ。ピペッティングでミックスします</li>。
	<li>10 ml LB の 15 mL の試験管にトランスポゾン ライブラリの転送 100 μ L.</li>
	<li>固定相への 37 ° C で 8 時間の連続振動 (250 rpm)、曝気、細胞の成長 (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =)。必要に応じて、生育条件にこれらのパラメーターを調整します</li>。
	<li>は、すべて 〜 10 世代、新鮮な prewarmed 中に連続転送によって細菌の人口を反映します。以前の固定相文化の 10 μ L を新鮮なポンドの 10 mL に転送する、静止した段階別の 8 h の成長によってこれを行う (すなわち、 外径 600 〜 4.0 を =). 
	注: 開始と終了の光学密度は同じ、1,000 倍希釈対応 〜 10 世代の成長する (2 10 = 1,024)。細菌の人口が新鮮な prewarmed 媒体に直接反映したり、0 - 4 保存 ° C (氷上) し、次の日を反映します。ポンドがここでは、できるだけ (22 分近く倍加時間) 時間の短い多くの細胞の doublings を確保するために使用されたします</li>。
	<li>競争の各 100 世代後、付けて-80 ° c の 5 つの 1 mL サンプル (ステップ 3.3 で説明します).</li>
	<li>個々 のトランスポゾンの挿入を含むセルとフィットネスの差が小さい場合は、期間を保つ、競争の長い; ここでは、700 世代 (t = 700) 使用された</li>。
</ol> 3。競争期間実験を監視する南しみ分析 <ol>特異的プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) の拡大を実行してしみ (1 kb、NKBOR 部)、サザンのプローブ <li>準備: NKBOR_Probe_FW: gatgttggacgagtcggaat と NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt。
	初期変性 <ol><li>加温 30 98 ° C で s。次に、10 の 98 ° C で 35 サイクルを実行 s、60 ° C、30 s、および 45 のための 72 ° C s。最後の拡張使用 72 ° C で 10 分間 
		注: PCR の反作用のテンプレートだった精製 pNKBOR プラスミド 21</li>。
		<li>スミス 25 によると任意プライマーを用いた α [32 P] dATP の結果 PCR のフラグメントのラベルします</li>。
	</ol></li> <li>Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると総細胞 DNA を備える t t まで 0 と選択した時点を = = 競争の世代を推定 700</li>。
	<li>ダイジェスト Pvu プローブによって覆われていない領域でのみ一度関心の領域を含む NKBOR をカット、私の全細胞の DNA; Pvu の 1 単位使えます基板 DNA の完全にダイジェスト 1 μ g にします 。
	メモ: プローブの挿入部位によって、様々 な長さの染色体 DNA と共に、トランスポゾンの一部を含むフラグメントが認識されます</li>。
	<li>南しみ Løbner 欧米とフォン Freiesleben 26 によると 0.7% の agarose のゲルを使用してを実行します</li>。
</ol> 4。適者生存のクローンの同定 ウォーキング、前述のハリソン ら によって <ol><li>使用簡単な遺伝子 27, 700 推定世代競争の後 (LB の版に分離) 単一のクローンから DARS2 挿入サイトを識別するために他のバンドすべてトランスポゾン挿入をカバーするためにより多くの分離、サザンブロット上。
	PCR テンプレート用 <ol><li>分離株のゲノム DNA。50 μ G/ml カナマイシンを含む LB 寒天培地プレートに細菌を広げるし、37 ° C で一晩インキュベートします。流体培養基 LB の 37 ° c で一晩シングル コロニーを成長しその後オートクレーブに蒸留水を 200 μ L に 20 μ L を転送 (または、ステップ 3.2 のように、DNA の浄化を使用)。
		<ol><li>ミックスする渦。100 ° C でミックスを熱の 10 min と max 速度で 5 分間遠心するを保存する将来の使用のための-20 ° C でライセートのセル</li>。
		</ol></li> <li>好みのトランスポゾンでアニールする 3 つの入れ子になったプライマーを設計 (PCR 戦略のグラフィック表現の 図 2 を参照). 
		注: はプライマー 3 の入れ子にある知られている 5 に最も近いように入れ子にプライマーの設計 &#39; トランスポゾン DNA、続いてネスト プライマー 2 と 1 の終わり。入れ子になっているプライマー 3 と 5 の間隔 &#39; 知られている t の終わりransposon DNA は、(特定の染色体トランスポゾン挿入部位を見つける) に未知の dna 既知の DNA からシーケンス リード スルーのため十分なはずです。NKBOR 次の入り込まれたプライマーは使用された: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg、および pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg。知られている制限酵素の認識部位を含むランダム プライマーも使用されます。結果を確保するため、1 つは少なくとも 2 つの異なるランダムなプライマーを使用する必要があります。制限酵素 (e.g.,Sau 3AI、Hin dIII) の制限のサイトは 3 時位置にする必要があります &#39; を終了し、10 のランダムな塩基によって先行 5 &#39; - NNNNNNNNNNGATC - 3 &#39; と 5 &#39; - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 &#39;、プライマーそれぞれ、ソウ 3AI サイト (GATC) と Hin dIII サイト (AAGCTT) を含む、N = A、T、G、または C</li>
		<li>、20 の DNA の使用 200 ng μ L の PCR 反応。30 98 ° C の孵化初期変性の s。30 の 98 ° C で 25 サイクルを実行 s、50 ° C、15 s と 4 分の 72 ° C。最後の拡張使用 72 ° C 10 分使用プライマー プライマー 1 の入れ子になっているとランダムなプライマーのいずれかから成る</li>。
		<li>テンプレートとして 1 μ L の反応は以前を使用して入れ子になったプライマー 2 と 2 番目の増幅から同じ任意プライマーから成るプライマー対を使用します</li>。
		<li>プライマー プライマー 3 のネストと同じ任意プライマーから成ると繰り返しステップ 4.1.4</li>。
		<li>は、1.5% の agarose のゲルとエチジウム ブロマイドで染色に最終的な PCR の反作用から製品を実行します。100-800 bp の範囲でバンドをカットし、抽出キットの製造元によって任意の商業 DNA ゲルを用いた DNA を隔離 &#39; s 方向。水の 15 μ L の DNA を再懸濁します 。
		注: 注意。臭化エチジウムは毒性があり注意して処理する必要があります</li>。
		<li>サンガーを使用して配列のプライマーとしてネスト プライマー 3 前の手順 (手順 4.1.6) で分離帯をシーケンス商業プロバイダーの配列</li>。
	</ol></li> <li>実行 WGS。
	<ol><li>から抽出した DNA の合計実行 WG Frimodt Møller ら 4 で説明されているように競争実験中に収集されたサンプルを選択した</li>。
	</ol></li> <li>シーケンス解析を実行します。
	<ol><li>整列ペアエンド読み取り 150 Ns NKBOR、AF310136.1 1,904 に隣接した &#8230; Bowtie2 28 を用いた種子部分文字列 (S、1、1.15) とあいまいな文字 (L、0, 0.9) の最大数間隔 2,204</li>。
		<li>配向の読み取りを選択し、両方 MG1655 ref に再整列 |NC_000913.3 と NKBOR gb |AF310136 blastN 29 を使用して</li> <li>接合 MG1655 NKBOR で、挿入位置の転位を割り当てる</li>。
	</ol></li></ol> 5。フローサイトメトリー <ol><li>フローサイトメトリー用サンプルを収集します。
	少なくとも 10 世代のため指数関数的成長の段階でそれを維持する <ol><li>バランス各文化です。外径 600 を確認し、それが 0.3 を超えることはありません</li>。
		<li>は、フロー サンプルの 2 種類を収集します。
		<ol><li>リフ-振れのリフ CEF (300 μ g/mL リファンピシン、36 μ g/mL セファレキシン 12.5 mM NaOH に溶解) の 30 μ L を含む 15 mL チューブ文化の 1 mL に転送します。揺れの 4 h の最小値の 37 ° C でそれを残しています 。
			注: リファンピシン直接ブロックないのレプリケーションの継続的なラウンドを終了し続けるようにしながら染色体複製開始します。セファレキシンは、レプリケーション振れ (リフ振れ) および完全に複製された染色体を持つ細胞の蓄積で起因する細胞分裂を防ぐことができます。リファンピシン、セファレキシン 20 治療の時に完全に複製された染色体の数は起源の数と等しい</li>。
			<li>EXP サンプル、転送指数関数的に成長する氷を 1.5 mL チューブに文化の 1 mL</li>
		</ol></li></ol></li> <li>次のようにセルを修正します。4 で 5 分間 15,000 × g で遠心分離によって細胞を収穫 ° C の冷たい 10 mM Tris pH 7.5 100 μ L でペレットを再懸濁し、冷たい 77% エタノール 1 mL を加えます。使用するまで 4 ° c のサンプルを格納します</li>。
	<li>は、次のとおりセルを汚します。上澄み 15 分削除 15,000 × g で遠心分離によって固定セルの 100-300 μ L を収穫し、130 μ でペレットを再懸濁します &#34; DNA 染色液 &#34; (90 μ g/mL ミスラマイシン、20 μ G/ml エチジウム ブロマイド、10 mM MgCl 2、と 10 mM Tris pH 7.5)。暗闇の中、氷の上にサンプルを置くサンプルは 10 分後フローサイトメトリー解析のため準備ができている 
	注: 他の DNA のエチジウム ブロマイドよりも汚れし、ミスラマイシンはまた使用される 30 , 31 をすることができます</li>。
	<li>フローサイトメトリー分析によるセル、相対セル質量と相対的核 DNA 量あたりの起点を特定します。
	<ol><li>実行フローサイトメトリー、 32 を前述のよう。リフ振れと流れの cytometer メーカーを使用して EXP サンプルを実行 &#39; の指示 .ミスラマイシン、エチジウム ブロマイド染色細胞励起波長 395 と 440 nm を使用し、収集 565 上記蛍光 nm。
		<ol><li>携帯番号ヒストグラム対単一パラメーター前方光散乱と 30,000 イベントの最小値のセル番号ヒストグラムと蛍光強度を取得する EXP サンプルを実行相対セル質量と相対の DNA の内容を決定するにはセル信号に対応する</li>。
			<li>使用を前方散乱平均相対を測定するための光単一パラメーターの分布細胞マサチューセッツ州 
			注: 前方散乱光は平均セル質量 20 の尺度</li>。
			<li>平均の DNA を測定する使用蛍光強度単一パラメーター分布コンテンツ 20</li>。
			<li>平均セル質量 20 平均核 DNA 量の比として DNA の濃度を取得します</li>。
		</ol></li> <li>起源細胞 1 個あたりの数を決定します。
		<ol><li>対単一パラメーター蛍光強度を取得する実行リフ振れサンプル セル セル信号に対応する 30,000 のイベントの最小数のヒストグラム</li>。
			<li>それぞれの染色体の数を決定する使用蛍光強度単一パラメーター分布細胞 20</li>。
		</ol></li></ol></li> <li>非同期性指数 (Ai) を計算します。
	<ol><li>計算 Løbner 欧米 ら による記述で、Ai 32、リフ振れサンプルと数式の Ai の蛍光強度の単一のパラメーター分布を使用して (f3 キー + f5 キー + f6 f7) =/(f2 f4 + f8), fx が完全に複製された染色体の x の数と分画細胞。イニシエーションを非同期考慮するとき A &#62; 0.1</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genet%22%5BJournal%5D)">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li>
<li>Sherratt, D. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15065657">Recombination and chromosome segregation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).</li>
<li>Bigot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+motifs+that+control+E.+coli+chromosome+segregation+by+orienting+the+FtsK+translocase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase.</a> EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).</li>
<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Replication+Control+Is+Linked+to+Genomic+Positioning+of+Control+Regions+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli.</a> PLoS Genet. 12 (9), 1006286(2016).</li>
<li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+Replication%2C+Second+Edition%22">DNA Replication, Second Edition</a>. , University Science Books. (1992).</li>
<li>Kaguni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+initiation+at+the+Escherichia+coli+chromosomal+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin.</a> Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).</li>
<li>Leonard, A. C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity%3A+taking+directions+from+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li>
<li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li>
<li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li>
<li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li>
<li>Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeqA%3A+a+negative+modulator+of+replication+initiation+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli.</a> Cell. 77 (3), 413-426 (1994).</li>
<li>Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiator+function+of+DnaA+protein+is+negatively+regulated+by+the+sliding+clamp+of+the+E.+coli+chromosomal+replicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.</a> Cell. 94 (1), 61-71 (1998).</li>
<li>Kato, J., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hda%2C+a+novel+DnaA-related+protein%2C+regulates+the+replication+cycle+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.</a> EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).</li>
<li>Kasho, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DnaA+binding+locus+datA+promotes+DnaA-ATP+hydrolysis+to+enable+cell+cycle-coordinated+replication+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).</li>
<li>Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+control+of+replication+initiation+by+a+novel+chromosomal+locus+exhibiting+exceptional+affinity+for+Escherichia+coli+DnaA+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein.</a> Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).</li>
<li>Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+genomic+sequences+of+E.+coli+promote+replicational+initiation+by+directly+reactivating+ADP-DnaA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA.</a> Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).</li>
<li>Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timely+binding+of+IHF+and+Fis+to+DARS2+regulates+ATP-DnaA+production+and+replication+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).</li>
<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+regions+for+chromosome+replication+are+conserved+with+respect+to+sequence+and+location+among+Escherichia+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains.</a> Front Microbiol. 6, 1011(2015).</li>
<li>Bergthorsson, U., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+chromosome+length+variation+in+natural+isolates+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli.</a> Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).</li>
<li>Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+bacteria%3A+a+promising+tool+in+experimental+and+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology.</a> J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).</li>
<li>Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKBOR%2C+a+mini-Tn10-based+transposon+for+random+insertion+in+the+chromosome+of+Gram-negative+bacteria+and+the+rapid+recovery+of+sequences+flanking+the+insertion+sites+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli.</a> Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).</li>
<li>SHIGEN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://shigen.nig.ac.jp">http://shigen.nig.ac.jp</a> (2017).</li>
<li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li>
<li>Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+protocol+for+preparation+of+electrocompetent+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li>
<li>Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+primed+labeling+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Random primed labeling of DNA.</a> Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).</li>
<li>Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+replication+incompatibility+in+Dam+methyltransferase+deficient+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells.</a> EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).</li>
<li>Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+gene+walking%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Easy gene walking.</a> Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+right+half+of+the+Escherichia+coli+replication+origin+is+not+essential+for+viability%2C+but+facilitates+multi-forked+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).</li>
<li>Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+minichromosomes+in+individual+Escherichia+coli+cells%3A+implications+for+replication+control%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control.</a> EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).</li>
<li>Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li>
<li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAPlotter%3A+circular+and+linear+interactive+genome+visualization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li>
<li>Eckert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157%3AH7+screened+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li>
<li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tn-seq%3A+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li>
<li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+insertion+sequencing%3A+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li>
<li>Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Adaptive+Laboratory+Evolution+of+Microorganisms+Using+a+Chemostat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li>
<li>Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+position+effects+on+gene+expression+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12.</a> Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).</li>
<li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li>
</ol>

著者は競合する財務持分を有していません。

ここで使用した方法論は、技術遺伝的要素の最適な genomic 位置に関する難しい質問に答えるための活用します。(トランスポゾンを介した) 遺伝的要素のランダムな挿入、お互いの調査遺伝的要素の最適な位置を選択するに対抗するために作ることができるクローンの何千もの迅速かつ簡単のコレクションを有効に (すなわち、適者生存のクローン)。
ここでは、 DARS2は、ミニ Tn10挿入された-NKBOR トランスポゾンを用いた。トランスポゾンの挿入サイトの下流の分析に重要です。いくつかの異なるトランスポゾンはミニ Tn5Km234より普及した選択、キャラクターなどの監督のトランスポゾンの挿入部位配列 (TraDIS) 実験で使用されている私はマリナートランスポゾン35, 36 (これの最近の検討、ヴァン Opijnen とカミリ<sup c...

遺伝的要素の機能は、ゲノムでの位置によって影響を受けます。細菌、これは主に、隣接遺伝子、ローカル DNA のトポロジー、および/または複製関連遺伝子量のトランスクリプションによって干渉から結果します。特に、DNA 複製と偏析の過程の制御は、少なくとも一部では、非コーディング染色体領域で1とこれらの地域の適切な機能のゲノム位置/コンテキストに依存します。エシェリヒア属大腸菌、例としては、妹に必要なdifサイト染色体の解像度2KOPS シーケンス、染色体分離3に必要なデータ、 DARS1とDARS2の地域、(以下; 適切な染色体複製制御に必要な4). ここでDARS2非コード領域の研究に代表されるランダムな再配置、選択、および与えられた遺伝的要素の最適な遺伝的コンテキストの定量を可能にする手法を提案します。
大腸菌DnaA は、イニシエーター蛋白質 DNA 鎖、単一のレプリケーションの起源、oriC、開くとヘリカーゼ DnaB5,6、7の採用担当。AAA+ (すなわち、多様な活動に伴う Atpase) に属する DnaA タンパク質同様高い ATP、ADP をバインドできます、親和性5。DnaAATPのレベルのピーク開始時8、DnaAATPが上、多量体を形成oriC DNA 両面開口部9を起動します。開始後oriC hemimethylated に複製蛋白質の結合を含むメカニズムによって隔離のため再開始のため一時的に使用できなくされるoriC10,11。隔離中に DnaAATPのレベルは、少なくとも 2 つのメカニズムによって減少: DnaA (ライダー)12,13とデータの規制不活化-依存 DnaAATP加水分解 (DDAH)14 ,15。ライダーと DDAH の両方は、DnaAATPの DnaAADPへの変換を促進します。開始の新ラウンドは、前に DnaAADPは特定 DnaA 再アクティブ化シーケンス (邸宅) に DnaAATPに再活性化される: DARS1およびDARS216,17。染色体データ DARS1、および DARS2地域非コーディング、DnaAATPを調節するシャペロンのような方法で行動/DnaAADP相互変換。複製の起源の外に位置するこれらの地域はいずれかの複雑な DnaA のアセンブリを有効に不活化 (データ;14) または活性化 (DARS1およびDARS2;17) DnaA の。セルのDARS2を削除する質量の 2 倍の時間が、非同期レプリケーション開始15,16,18の結果を変更しません。ただし、 DARS2-フィットネスがある欠損細胞豊富な媒体で両方の継続的な成長の競争の間にまたはマウス腸18の植民地化の確立の間にそうしないと同質遺伝子野生型に比べてコスト。これは非同期/起源濃度の些細な変更が細菌フィットネスにマイナスの影響であることを示します。大腸菌染色体の対称性 (すなわち、 2 長さがほぼ等しいレプリケーション腕)19を維持する選択的な圧力があります。データ、 DARS1、およびDARS2領域に同じ相対的な間隔があるoriCすべて大腸菌株シーケンス18染色体サイズの大きな変化にもかかわらず。
ここでは、その機能に最適な染色体の位置の同定の例としてエシェリヒア属大腸菌のDARS2領域を用いてください。DARS2が NKBOR トランスポゾンと結果 NKBOR に挿入された:: その後ランダムに MG1655 のゲノムに挿入DARS2トランスポゾン ΔDARS2。我々 はこのように細胞のコレクションを生成された、それぞれの所有しているDARS2は染色体上の別の場所に配置します。体外競争実験、コレクション内のすべてのセルがプール、ポンドで推定 700 世代のための持続的な成長の間に互いに競ったかを行った。競争実験の結果監視/決定された南しみ、簡単な遺伝子を歩いて、全ゲノム シーケンス (WGS; を使用して図 1)。簡単な遺伝子を踏んで解決エンドポイント クローンは細胞周期のパラメーターを評価するフローサイトメトリーにより特徴づけられた.フローサイトメトリー解析、セル サイズ、DNA コンテンツ、および開始同期が多数のセルを測定できます。フローサイトメトリー、単一セルの流通過提供が、同時に放出される蛍光、DNA 含量の測定を収集フォトマルによって登録されますし、ステンド グラスの DNA を刺激する適切な波長の光線、細胞は DNA のステンド グラスします。前方散乱光は、細胞質量20の指標です。
ここでは提示の in vitro競争の実験、染色体の位置および遺伝的要素のゲノムのコンテキストの重要性に関連する質問に対処するため使用されます。メソッドは、公平な使いやすいです。

<table><tbody><tr><td>オートクレーブ滅菌済み Mili-Q 水</td><td></td><td>なし</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット、0.1 cm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P41050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad MicroPulser エレクトロポレーションシステム</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12780029&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LB寒天、粉末(レノックスL寒天)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>22700025</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17904</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;プラスチックシャーレ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S33580A</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン50mL円錐形遠心分離管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン15mL円錐形遠心分離管フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>ヌンク&nbsp;クライオチューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V7634&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA ポリメラーゼ (2 U/&micro;L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F530S</td><td></td></tr><tr><td>dATP、[&α;-32P]-3000Ci/mmol 10mCi/ml、250 &micro;Ci</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU012H250UC</td><td></td></tr><tr><td>DECAprime II DNAラベリングキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1455</td><td></td></tr>分光<tr><td>光度計&nbsp;SF/MBV/03.32</td><td>Pharmacia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hermle 遠心分離機&nbsp;&nbsp;&nbsp;SF/MBV/03.46</td><td>Hermle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ole Dich 遠心分離機&nbsp;SF/MBV/03.29</td><td>Ole Dich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 1.5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorftubes 2.0 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>96% エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16368</td><td></td></tr><tr><td>Trizma HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3253</td><td></td></tr><tr><td>フェノール超高純度</td><td>BRL</td><td>5509UA</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>メルク</td><td>2445</td><td></td></tr><tr><td>リボヌクレアーゼ A タイプ II A</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>R5000</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムドデシルサルフェート (SDS)</td><td>メルク</td><td>13760</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>L 6876</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>405-7</td><td></td></tr><tr><td>0.5M Na-EDTA pH8.0</td><td>BRL</td><td>5575 UA</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10106801001</td><td></td></tr><tr><td>PvuI (10 U/&micro;L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ER0621</td><td></td></tr><tr><td>ウルトラピュアアガロース</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>DNA ゲルローディング色素 (6X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>トリス-ホウ酸-EDTAバッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4415</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433160</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71687</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp;3MM論文</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA3030931</td><td></td></tr><tr><td>SSCバッファー20倍;コンセントレート</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S6639</td><td></td></tr><tr><td>アマシャム ハイボンド-N+</td><td>GE ヘルスケア</td><td>RPN119B</td><td></td></tr><tr><td>フィコール&nbsp;400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン - フラクション V</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85040C</td><td></td></tr><tr><td>サケ精巣からのデオキシリボ核酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626</td><td></td></tr><tr><td>Carestream Kodak &nbsp;バイオマックス &nbsp;光フィルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z373494</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp;ゲル抽出キット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1111&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GenElute &nbsp;PCRクリーンアップキット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA1020</td><td></td></tr><tr><td>T100&nbsp;サーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SmartSpec Plus 分光光度計</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td></td><td>Serva 34514.01</td><td></td></tr><tr><td>セファレキシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>ミトラマイシン</td><td>Serva</td><td>29803.02</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>Apogee A10 instrument</td><td>Apogee (アポジ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>)

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌dna 要素の最適な染色体の場所の決定

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

与えられた DNA 要素の最適な染色体位置/フィットネス選択続いてトランスポゾンを介したランダムな挿入によって定められました。細菌、遺伝的要素の機能に関する遺伝的コンテキストの影響は評価することは困難することができます。近隣の遺伝子や複製関連遺伝子投与量から転写干渉位相効果を含むいくつかのメカニズムは、与えられた遺伝的要素の機能に影響があります。ここでは、大腸菌と単純な成長競争を使用して最も有利な場所実験選択の染色体への DNA 要素のランダムな統合を可能にする手法について述べる。メソッドは、ランダムな挿入、結合で適者生存のクローンの選択成長の利点は、実験のニーズに簡単に調整されているプロシージャのよく説明トランスポゾン ベース システムの利点を受け取ります。適者生存のクローンの性質は、複雑な多クローン集団の全ゲノム シーケンスまたは選択されたクローンの迅速同定のため歩きやすい遺伝子によって決定できます。ここでは、 DARS2、エシェリヒア属大腸菌の染色体複製開始を制御する DNA の非コード領域は例として使用されました。複製関連遺伝子の用量の影響を受けるDARS2の機能は知られています。近いDARS2をさらにアクティブになる、DNA の複製の起源に取得します。DARS2がDARS2の染色体に挿入されたランダムに-ひずみを削除します。個々 の挿入を含む結果のクローンはプールされ、何百世代のため互いに競った。最後に、適者生存のクローンは、特徴し、 DARS2元のDARS2の場所の近くに挿入が含まれて発見されました。

南しみはDARS2がトランスポゾン ライブラリでは染色体の中でランダムに配布されたことを確認する行われていた (t = 0) と適者生存のクローンを時間をかけて永続化でしょう。南しみは初期トランスポゾン プールから抽出した DNA を行った (t = 0) と (図 3) の競争の 700 世代からすべての推定 100。ここでは、それぞれの時点から全細胞 DNA はトランスポゾン NKBOR を削減する知られている制限酵素にPvuと消化::DARS2一度プローブによってカバーされない領域でのみ。南しみは、NKBOR の一部に相補的な放射能によって分類された DNA 断片をプローブだった。図 3、初期のDARS2プールから見た (t = 0) 欠けていたは明瞭なバンド、 DARS2が染色体全体にランダムに挿入されたことを示しています。時間をかけて、パターン登場...

ここでは、非コーディング DNA 要素のトランスポゾンを介したランダム挿入の力は、その最適な染色体の位置の解決に使用されました。

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

本実験の全体的な目的は、トランスポゾンを介したランダム挿入、競合実験、および全ゲノム解析を用いて、任意のDNAエレメントの最適な染色体上の位置を決定することです。この手法は、遺伝的エレメントの染色体上の位置の重要性など、DNA複製分野における主要な課題の解明に役立ちます。本技術の利点は、トランスポゾンベースのランダム挿入と、増殖上の優位性による最適クローンの選抜を組み合わせている点にあります。ここでは、E.coli DARS2領域を用いて簡略化しています。この手法はEscherichia coliの染色体構成に関する知見を得るためのものですが、他の細菌にも適用可能です。テキストのプロトコルに従ってMG1655 delta DARS2などのエレクトロコンピテントセルを調製した後、40 µLの細胞に1 µgのpNKBOR DARS2を加え、混合液をあらかじめ冷却した滅菌済みの0.2 cmギャップキュベットに移します。キュベットをエレクトロポレーションチャンバーに挿入します。次に、18 kilovolts、500 ohm、25 microfaradの条件で細胞にエレクトロポレーションを行います。時定数は約5 millisecondsであり、アーク放電が発生しないようにしてください。あらかじめ加温したLBブロス1 mLに再懸濁して細菌懸濁液を速やかに回収し、15 mL試験管に移します。抗生物質による選択を行わず、通気条件下にて37 °Cで30分間、細胞をインキュベートします。その後、50 µg/mLのカナマイシンを添加したLB寒天プレートに細菌を塗布し、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、エレクトロポレーションによるコロニー数をカウントします。1つのコロニーを1つの染色体トランスポゾン挿入と同等とみなします。各プレートに1 mLのLBブロスを加え、すべてのコロニーを洗い出します。同じ1 mLのLBブロスを再利用して、細菌濃度を高めます。その後、すべてのコロニーを同じ50 mLチューブにまとめます。チューブをボルテックスして開始材料を均質化し、1 mLの細胞懸濁液を氷上で1 mLの50% glycerolと混合します。チューブをドライアイスに移し、10分間静置します。培養液が凍結したら、-80°Cのフリーザーに移します。-80°Cで保存してあったトランスポゾンライブラリーを氷上で融解します。ピペッティングにより混合した後、トランスポゾンライブラリ 100 µL を 15 mL 試験管に入れた 10 mL の LB に移します。37 °C で連続的に振盪し、通気条件下で 8 時間、静止期まで細胞を培養します。必要に応じて、パラメータを異なる増殖条件に調整してください。細菌集団を約10世代ごとに増殖させるには、以前の定常期の培養液10 µLを、あらかじめ温めておいた新鮮な培地10 mLに移し、さらに8時間培養して定常期まで成長させます。競争実験を100世代行うごとに、1 mLのサンプルを5つ採取し、-80 °Cで保存します。NKBORの1 kbの領域に対するサザンブロット用プローブを、ここに記載した特異的プライマーを用いたPCR増幅により調製します。以下のプログラムを用いてサンプルを走行させます。ランダムプライマー法を用い、Smithに従ってP32標識dATPで得られたPCRフラグメントを標識し、テキストのプロトコルに従って全細胞DNAを調製します。プローブでカバーされる領域の外側にある、目的領域を含むNKBORを切断するPvuIで全細胞DNAを消化します。Loebner-Olsenおよびvon Freieslebenの方法に従い、0.7%アガロースゲルを用いてサザンブロットを行う。単一クローンからDARS2挿入部位を特定するために簡易的なジーンウォーキングを用いる場合、推定700世代の競合後、まず細菌をLB寒天培地に塗布し、37°Cで一晩培養して、PCRテンプレート用のゲノムDNAを単離する。単一コロニーをLB液体培地に接種し、37°Cで一晩培養する。次に、20 µLを200 µLのオートクレーブ滅菌済み蒸留水に移します。コロニーをボルテックスで溶解させ、混合物を100 °Cで10分間加熱します。サンプルを最大速度で5分間遠心分離し、得られた細胞溶解物を-20 °Cで保存して後で使用します。次に、ここに示すように、選択したトランスポゾン内にアニールする3組のネステッドプライマーを設計します。200 nanogramsのゲノムDNA、ネステッドプライマー1、およびランダムプライマーを用いて、20-microliterのPCR反応液を調製します。その後、以下のプログラムに従ってサンプルを処理します。2回目の増幅では、1回目の反応液1 µLをテンプレートとして使用し、ネステッドプライマー2および同一のランダムプライマーを用いて行います。同様の手順で、ネステッドプライマー3、同一のランダムプライマー、および2回目の反応液1 µLをテンプレートとして使用し、3回目の反応を行います。最終的なPCR反応産物を1.5%アガロースゲルで電気泳動し、臭化エチジウムで染色します。100〜800塩基対の範囲のバンドを切り出し、市販のDNAゲル抽出キットを用いて、製造元の指示に従ってDNAを単離します。フローサイトメトリーを行うには、各細菌培養物を少なくとも10世代にわたって対数増殖期に維持し、バランスを整えます。OD600を測定し、0.3を超えないようにしてください。テキストプロトコルに従ってリファンピシン・ランアウトを行うには、1 mLの培養物を30 µLのRIF-CEFを含む15 mLチューブに移します。チューブを37 °Cで、最低4時間振とうしながらインキュベートします。EXPサンプルの場合は、指数増殖期の培養液1 mLを氷上の1.5 mLチューブに移します。次に、15,000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離し、細胞を回収します。ペレットを100 µLの氷冷10 mM Tris pH 7.5に再懸濁し、1 mLの氷冷77% ethanolを加えます。サンプルは使用時まで4 °Cで保存してください。15,000 ×gで15分間遠心分離し、固定した細胞を100〜300 µL回収して染色します。上清を除去し、130 µLのDNA染色液を用いてペレットを再懸濁します。その後、サンプルを氷上で暗所に10分間インキュベートします。最後に、フローサイトメトリーを用いて、細胞あたりの起源、相対的な細胞質量、および相対的なDNA含量を決定します。初期のトランスポゾンプールおよび、競合過程における700世代のうち推定100世代ごとにDNAを抽出した後、プローブでカバーされていない領域でトランスポゾンNKBOR DARS2を1回切断することが知られているPvuIでDNAを切断し、サザンブロットを行いました。ここで示すように、初期のDARS2プールには明確なバンドが見られず、これはDARS2が染色類全体にランダムに挿入されていたことを示しています。時間の経過とともに、初期の膨大なDARS2クローンのプールから、少数の、あるいは単一の持続的なDARS2クローンのみが生き残るというパターンが現れました。スタートプールのDARS2挿入部位を特定するために、全ゲノムシーケンシングを用いました。そして、挿入部位をシーケンシングした代表的なサブセットにおいて、400、500、および700世代の競合させた結果、すべてのDARS2挿入の98%が、野生型DARS2の染色体上の位置に近いことが分かりました。また、2%は染色体上の他の部位に存在することが判明しました。DARS2欠損細胞は、以前に複製を同期的に開始し、野生型細胞と比較して複製起点濃度が低下することが示されています。ここでは、末端にDARS2エレメントが存在しても、同期性や細胞内の複製起点含量は野生型のレベルまで回復しませんが、選択されたDARS2クローンのIRおよびRPPHは、複製を同期的に開始します。このビデオを視聴することで、特定のDNAエレメントの最適な染色体上の位置を決定する方法について十分に理解できるはずです。これは、トランスポゾンを用いたランダム挿入を行い、続いて競合実験を実施し、最終的に全ゲノムシーケンシングを行うことで達成されます。

determination-optimal-chromosomal-location-s-for-dna-element

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

のために導入遺伝子を産生する能力...

の生産 C.エレガンス</emとRecombineering経由>トランスジーン galK選択可能なマーカー

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

出典: Kazi、MI、 他、 ハイスループットシーケンシングのためのグラム陰性菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成。 J.ビス。...

ゲノムトランスポゾン挿入によるグラム陰性菌の単離

エンテロバクター属 。 YSUは、グルコース最小塩培地中で成長する。栄養要求株は、ランダムに宿主ゲノムに自身を挿入するトランスポでそれを変換することによって生成される。突然変異体は最小培地への複合培地からレプリカプレーティングによって発見されています。中断された遺伝子は、遺伝子のレスキューおよび配列決定により同定される。...

の世代エンテロバクターエスピー。 YSU要求株にはトランスポゾン突然変異誘発を用いて

ここでは、プラスミド結合に関与する目的の遺伝子をノックアウトするプロトコルを提示し、その後、交配アッセイを使用してその不在の影響を分析します。遺伝子の機能は、欠失または点突然変異を使用して、その配列の特定の領域にさらに調査されます。...

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

ここに提示は、大腸菌や赤痢菌細菌の活用を使用して高密度トランスポゾン挿入ライブラリを作成するための簡単な方法です。このプロトコルは、トランスポゾンのランダムなゲノム挿入による細菌のユニークな突然変異体の何千もの何百ものコレクションの作成をできます。...

密なトランスポゾン挿入ライブラリを使用して細菌活用腸内細菌系統など、大腸菌や赤痢菌の作成

シーケンシング(RH-seq)を介した相互異形性は、種間の形質の違いの遺伝的基礎をマッピングする強力な新しい方法である。ヘミジゴットのプールはトランスポゾン変異によって生成され、その適合性は、高いシーケンシングを使用して競争力のある成長を通じて追跡されます。得られたデータの分析は、形質の基礎となる遺伝子を特定します。...

ゲノムワイド往復半角化分析によるサッカロマイセス酵母の種間の熱耐性の遺伝学的マッピング

Gram陰性細菌における飽和トランスポゾン変異ライブラリーの生成方法と、その後のDNAアンプリコンライブラリーのハイスループットシーケンシングの調製方法について述べる。一例として、ESKAPE病原体...

高スループットシーケンシングのためのグラム陰性細菌におけるトランスポゾン挿入ライブラリの生成

これは、 バークホルデリア 有益な共生者における候補昆虫コロニー形成因子を同定するための適応的方法である。このカブトムシ宿主はトランスポゾン変異生成を介して生成されたランダム変異体ライブラリーに感染し、コロニー形成後のライブラリーの複雑さは 、インビトロで増殖した対照と比較される。...

ラグリア・ビロサ・カブトムシのバークホルデリア・グラディオリ・シンビエントにおける細菌コロニー形成因子を解明するためのツールとしてのトランスポゾン挿入シーケンシング

学ぶトランスポゾンを介したランダム挿入法と競合実験、全ゲノムシーケンスを用いて大腸菌のDNA要素の最適な染色体位置を決定する手法。この方法は細菌の染色体構造理解に貢献する。

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

さらに動画を探す