植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

このシステムの全体的な目標は、植物とマイクロパートナーとの間の相互シグナル伝達の相互作用と応答、または化学物質や非生物的要因に対する植物の応答を、自然環境を密接に模倣した単純な実験設定で研究することです。このビデオは、Agrobacterium tumefaciens細菌と植物の共栽培を示しています。この方法は、植物の微生物相互作用、微生物または植物のストレス応答、および植物の微生物相互作用の初期段階であっても複雑なシグナル伝達を含む分子シグナル伝達における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、自然環境の模倣を含む簡単なセットアップで、植物の微生物相互作用の性質のシグナル伝達と応答を理解するのに役立つことです。この方法は、植物と単一の微生物種との相互作用に関する洞察を提供するために使用できますが、植物と複数の微生物種または非生物的要因との相互作用を研究するためにも使用できます。この手法は、自然界の状況に密接に模倣した植物微生物の相互作用における細胞シグナル伝達の恒常性を探る中で思いつきました。

実験を開始するには、種子を滅菌する必要があります。シロイヌナズナの場合は、約200個の種子と500マイクロリットルの脱イオン水をマイクロ遠心チューブで組み合わせ、チューブを高速でボルテックスします。卓上型マイクロ遠心分離機でチューブを9000 x gで30秒間遠心分離します。

ピペットを使用して、水の上清を取り除きます。次に、300マイクロリットルの2%次亜塩素酸ナトリウムを種子に加え、それらを渦巻きにします。混合物を室温で沈殿させます。

1分後、種子を遠心分離します。ピペットで次亜塩素酸ナトリウム溶液を取り除きます。次に、500マイクロリットルの滅菌脱イオン水を種子に加え、混合物をボルテックスします。

チューブを遠心分離した後、水を取り除きます。500マイクロリットルの70%エタノールを種子に加え、混合物をボルテックスします。種子が1分間沈殿するのを待った後、チューブを遠心分離します。

ピペットを使用して70%エタノールを取り除きます。種子を500マイクロリットルの滅菌脱イオン水で5回洗います。次に、滅菌した種子を500マイクロリットルの滅菌超純水に再懸濁します。

25ミリリットルの半量強度のムラシゲとスクーグ、または04%フィト寒天を含むMS培地を各滅菌の深いペトリ皿に注ぎます。各シャーレごとに、90ミリメートル×90ミリメートル四方のステンレス鋼メッシュを切り取ります。各正方形のメッシュの角を、メッシュがペトリプレートの内側に収まるように十分に曲げます。

メッシュの大部分に対してコーナーを 90 度の角度で曲げて、メッシュをコーナーで支えられるようにし、ルートの発達のために下に十分なスペースを残します。カットしたメッシュの正方形をビーカーに入れ、アルミホイルで覆います。メッシュスクエアを30分のドライサイクルを使用してオートクレーブ滅菌します。

培地がペトリ皿で固まり、メッシュが無菌になったら、曲がった角を下に向けて、各メッシュを正方形に固体培地の上に置きます。角が媒体を貫通し、メッシュの大部分が媒体の上面に接触するようにメッシュを押します。次に、滅菌済みの200マイクロリットルピペットを使用して、個々の表面滅菌されたAタリアナ種子を引き出し、メッシュの上に各種子を静かに移します。

種子は、植物種と実験のニーズに合わせて間隔が空くように配置します。シャーレを蓋で密封し、プレートの端に多孔質のサージカルテープを貼ります。種子をアルミホイルで包みます。

ペトリ皿全体を置いて種子を層状にします。2日後、摂氏22〜24度のペトリ皿で種子を栽培し、16時間の撮影期間を10〜14日間行います。滅菌したフローフードで、18ミリリットルのオートクレーブ処理した液体MS培地を、滅菌蓋付きの滅菌円筒形ガラスタンクに注ぎます。

次に、滅菌鉗子を使用して、半固体培地のペトリ皿から10〜14日齢の苗木の各メッシュ正方形を水耕栽培の円筒形タンクに穏やかに移します。ここに示されている苗はアルファルファです。多孔質の外科用テープを使用して、蓋をタンクに密封します。

その後、22〜24°Cで苗を栽培し、16時間の撮影期間と50rpmで振とうします。接種する前に、苗木が入ったタンクに汚染の可能性がないか注意深く調べてください。汚染されていないタンク内の媒体は、透明で透明でなければなりません。

タンクが汚染で濁っている場合は、それらを廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。番号が付けられた各タンクから20マイクロリットルの水耕培地をサンプリングし、ルリアブロスまたはLB寒天を入れたペトリ皿で見つけます。皿を摂氏28度で28時間インキュベートします。

番号が付けられた各水耕栽培タンクに、50マイクロリットルのアグロバクテリウム・ツメファシアン懸濁液を番号が付けられた各水耕栽培タンクに直ちに接種します。苗木とA tumefacians細菌を摂氏22〜24度で共栽培し、16時間の撮影期間と50rpmで振とうします。インキュベーションの12時間後と28時間後に斑点のあるLBプレートを検査して、水耕栽培培地の無菌性を確認します。

汚染がある場合は、バクテリアを接種した対応する番号の付いたタンクを、さらなる下流のアッセイに使用しないでください。次に、メッシュプレートを持ち上げて、細菌懸濁液から根を分離します。その後の分析に根を使用する場合は、根を切断し、二重蒸留水ですばやくすすぎ、滅菌した濾紙で乾燥させます。

葉や他のティッシュを使用する場合は、ティッシュを切り取ります。植物の転写産物分析では、根や新芽をすぐに液体窒素に沈着させる必要があります。細菌転写産物の分析には、共培養タンクから1.5ミリリットルの培養物を移し、遠心分離により細胞をペレット

適切な共培養に続いて、滅菌ハサミを使用して、主根の側枝である個々の二次根を分離します。次に、根を二重蒸留水ですすいで、緩く結合した材料を取り除きます。顕微鏡スライドで各根を30マイクロリットルの水に浸し、ガラスカバースリップで覆います。

カバーガラスの端をマニキュアで密封して、根を脱水から保護します。次に、蛍光顕微鏡法により、A tumefaciansのA thaliana根への付着を視覚化します。適切な共栽培の後、植物を水耕培地から分離します。

18ミリリットルの水耕培地を0.2ミクロンのポアフィルターに通して50ミリリットルの円錐管に通して滅菌します。サンプルを摂氏80度で一晩凍結します。翌日、50ミリリットルの円錐形チューブのキャップを緩め、凍結乾燥機に36時間置きます。

最後に、HPLC分析と化合物検出のためにサンプルの保存または処理に進みます。人工的に供給された栄養素がなければ、A tumefacians c58は共同栽培システムで成長しました。対照的に、A thalianaを含まない対照培養では、基本的に細菌の増殖は観察されませんでした。

水耕栽培の共栽培システムは、この顕微鏡の視覚化に見られるように、根の構造への細菌の付着を研究するために使用でき、PCherryの赤い蛍光標識された細菌が典型的な岩状またはフィラメントの形で植物の根の構造に局在していました。植物のポストと相互作用する微生物の両方の遺伝子発現プロファイルは、QRTPCRを介して確認することができます。8時間の共培養後、8つのtumefacian細胞が病原性遺伝子の発現制御を明らかにしました。

同時に、A thalianaの根は、共培養に応答して異なる遺伝子発現を明らかにしました。72時間の共培養後、接種された植物のセクレトームでは、対照群と比較して35の化合物が増強され、76の化合物が減少しました。この技術は、研究者が植物と微生物の相互作用を研究し、植物と微生物または微生物バイオームパートナーとの間の相互応答、または自然環境を密接に模倣した単純なセットアップで非生物的要因に対する植物の応答を調査する道を開きます。

これを一緒に見た後、水耕栽培で植物微生物の共培養システムを構築して、より自然で管理しやすい環境で分子植物、微生物の相互作用、およびシグナル伝達応答を研究できることを願っています。