Name: 植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: 学ぶ水耕栽培共生システムによる植物と微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時分析。Agrobacterium tumefaciensを用いて自然環境を模した実験設定で、植物のストレス応答と微生物の動態を詳細に解明する方法です。

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Brian WeselowskiとAlexander W. Eastmanに感謝し、彼らの助けと役に立つ議論をしていただきたいと思います。私たちはDrsにも感謝したいと思います。 Eugene W. Nester、Lingrui Zhang、Haitao Shen、Yuhai Cui、Greg Thornの協力を得て、有用な議論と原稿の批評を読んだ。この研究は、農業および農業食品カナダ、Growing Forward-AgriFlex（RBPI番号2555）およびGrowing Forward IIプロジェクト番号1670（その職務の一環として著者が実施したもの）によって資金提供されました。この研究はまた、ZC Yuanに授与されたカナダの自然科学・工学研究評議会（NSERC）Discovery Grant RGPIN-2015-06052によって部分的に資金提供された。

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著者は何も開示することはない。

根分泌の漸進的な性質を考慮すると、 プラナで生産されたビルレンス誘発化学物質の濃度および動的植物 - 微生物相互作用に対するそれらの効果は、空間的および時間的勾配において生じる。この水耕栽培共生システムでは、微生物毒性または植物防御を誘​​導する合成植物ホルモンまたは化学物質は補充されない。対照的に、従来のアプローチを用いて、アセトシリンゴンのような合成化学物質の添加は、突然の人為的な濃度のスパイクを生成する。したがって、この水耕共培養系は、微生物および宿主植物が空間的および時間的様式で認識し応答する自然環境をより厳密に模倣する。 ここで、 アグロバクテリウム毒性遺伝子がシロイヌナズナとの共生培養で活性化されたことを実証することができた。これは、天然植物由来の化学物質がアグロバクテリウム病原性を誘導することを示唆している。将来のeこれらの化学物質を同定し、毒性誘発化合物アセトシリンゴンがその中に含まれているかどうかを確認するために、ffortが必要である。さらに、 アグロバクテリウム<...

植物関連微生物は、生物地球化学サイクル、バイオレメディエーション、気候変動の緩和、植物の成長と健康、生物的および非生物的ストレスに対する植物耐性において重要な役割を果たす。微生物は直接植物細胞壁の接触を介して間接的に化学分泌を介して1、2、3シグナリングの両方の植物と相互作用します。固着生物として、植物は病原体による感染に抵抗する直接的および間接的メカニズムを開発してきた。間接的な防御は、二次植物代謝物の生産と病原体4,5の侵入に対する拮抗生物の魅力を含むのに対し、直接防御は、構造的な防御および防御タンパク質の発現を含みます。植物由来の滲出液、分泌物、粘液、ムシゲル、および溶解物は、根圏の物理化学的特性を変化させて誘引または反発する宿主に向かって微生物6 。根分泌物の化学組成は種特異的であり、それによって、そのような化合物を認識することができる特定の微生物が根圏6で繁殖することを可能にする選択的フィルターとして役立つ。したがって、適合性の微生物種は、植物宿主1の有益性または有害性のいずれかに、それらの関連性を活性化および強化するように刺激され得る。 微生物および化学的暴露の大部分は、ルート構造と土壌エアインタフェース2、6、7、8で起こるからである。根圏における理解植物微生物相互作用は、植物生産性と生態系の機能を強化するための鍵でありますしかしながら、地下の植物 - 微生物相互作用および相反応答の試験は、その興味深いことに<html>複雑かつ動的な性質、および厳密に制御可能な増殖条件下での天然根構造および植物形態を有する適切な実験モデルの欠如を含む。最も頻繁に研究植物病原の一つとして、 アグロバクテリウムは桜、リンゴ、ナシ、ブドウなどの農園芸重要性を持つ植物の広い範囲に感染し、9ローズ 。 アグロバクテリウムは理解植物-病原体相互作用のための重要なモデル生物であり、植物の形質転換および植物工学10、11、12、13、14における強力なツールです。 分子は、 アグロバクテリウムの相互作用が十分に数十年にわたって研究されている、およびアグロバクテリウム病原性の現在の理解は9広範であるプラント-F &quot;&gt; 11、15、16。 アグロバクテリウムの病原性は、主に17を感知する、植物由来の信号を感知その毒性プログラムおよび細胞間通信の細かい調節をもたらす、いわゆる定足数のその進化能力に起因する。ザアグロバクテリウムの病原性プログラムは根圏で利用可能ないくつかの信号によって調節され、2成分系、は、chvg / Iシステムとビラ/ Gシステムの2つのセットを含むている。根圏における酸性条件は、 は、chvg / I、 ビラ/ Gの転写を活性化します、およびvirE0 、 virE1 、 virH1 、 virH2 、およびVI型分泌系（T6SS） 18の遺伝子を含むアグロバクテリウムの病原性に関与するいくつかの他の遺伝子が含まれる。アセトシリンゴン（4&#39;-ヒドロキシ-3 &#39;、5 &#39; - ジメトキシアセトフェノン）、Vリン酸化シグナル伝達機構によるirA / G二成分系19 。その後、VirA / Gはvirレギュロン全体を活性化し、その結果、腫瘍誘導性（Ti）プラスミドからトランスファーDNA（T-DNA）と呼ばれる約20kbのバクテリアDNA断片を植物核16に移入して組み込む。 T-DNAは、植物ホルモンインドール-3-酢酸（IAA）（ iaaMおよびiaaH ）およびサイトカイニン（ ipt ）の合成に関与する遺伝子を保有し、一旦植物細胞で発現すると、これらの植物ホルモンが大量に産生される。これは、植物9、11、20のために慢性および復活問題であるクラウンゴール病として知られる異常な組織増殖および植物腫瘍発達、もたらします。 IAAは、 アグロバクテリウムビルレンスを抑制するために、またはアグロバクテリウムを減少させるために、サリチル酸およびγ-アミノ酪酸と一緒に作用する<html> m個のクオラムセンシング（QS）17、21、22。この抑制に対抗するために、T-DNAはまた、 アグロバクテリウムの病原性を促進するために、 アグロバクテリウムクオラムセンシングを活性化し、病原体22,23のための栄養源となるオピンの生合成のための遺伝子を運びます。 アグロバクテリウム -プラント相互作用の全体的な深い理解と、植物宿主への得られたT-DNA転移にもかかわらず、相互作用の初期段階での複雑なシグナル伝達事象はあまり理解されていない。これは、部分的に、 アグロバクテリウム -植物シグナル伝達を調べるための従来のアプローチの限界に起因する。植物細胞懸濁液培養および人工部位特異的創傷は、分子植物 - 微生物相互作用を研究するために一般的に使用されている24 、。EF &quot;&gt; 26、27はしかし、細胞懸濁液は、一般的な植物の形態に欠け、特に、植物の懸濁細胞は、微生物の走化性および病原性28、29を活性化するために非常に重要なルート構造と根の滲出液を、持っていない植物の形態の維持。ルート構造が直接感染した植物組織30、31に誘導される植物防御関連遺伝子の検出結果として、サイト固有の感染を容易に人為的に負傷植物によって対処されてきた。しかし、人工的な創傷は、自然の中で病原体感染と大きく異なっています特に、創傷がジャスモン酸（JA）の蓄積をもたらし、天然植物のシグナル伝達と防御を全身的に妨害する26。また、合成化学物質は、人工的に植物宿主応答を誘導するために使用される26 。または病原体の病原性である。 植物体中の濃度を反映するような化学物質の補充が可能であるが、そのような補充は徐々に微生物28、32によって検知された走化性勾配を生成取り囲む根圏へ根滲出液の拡散を考慮していません。植物 - 微生物相互作用を研究する従来のアプローチの限界を考えると、得られたデータの精度と深さは妨げられ、制限され、従来のアプローチから生成された知識は植物に直接翻訳されない可能性がある。植物 - アグロバクテリウムシグナリングの多くの局面は、特に、疾患の症状がまだ発症していない初期の相互作用の段階では、完全には理解されていない。 従来のアプローチの限界を修正するために、この研究は、安価で、しっかりと制御可能で、柔軟な水耕性のc研究者が分子植物 - 微生物相互作用の初期段階で複雑なシグナル伝達経路と応答経路に深い洞察を得ることを可能にする。水耕栽培は広く植物栄養素、根の滲出液、成長条件、および植物33、34上の金属毒性の影響を研究するために使用されてきました。水耕栽培モデルには、小さな空間的要件、様々な植物組織の接近可能性、栄養素/環境条件の厳密な制御、害虫/病害の制御などのいくつかの利点があります。水耕栽培システムはまた、典型的には2〜3週間後に成長を制限する寒天/フィトアガルめっき技術と比較して、植物の生育を制限するものではない。重要なのは、全体のプラント構造物の維持管理は、微生物の走化性および病原性の誘導8、29のために必要な自然なルート分泌を促進します。システムの説明ここでのベッドは選択肢33、34よりも簡単かつ少ない労働集約的です。これは、より少ない部品を使用し、標準はさみ以外の工具を必要としません。それは、植物生長の強力な支持体としての金属メッシュ（ナイロン33とは対照的に）と、微生物増殖を助けるための振盪による無菌条件下での単純な通気方法を使用する。さらに、このシステムは、根の幅を制限することなく多様な植物種に適応する、植物成長をサポートするために様々なサイズの金属メッシュを使用することができる。 ここに提示されている水耕共培養系では、接種された細菌の増殖を支える有機化合物を植物の根が分泌する無菌水耕システムで植物を栽培する。この共培養システムでは、植物ホルモン、防御エリシター、または病原性誘導化学物質などの人工化学物質は補充されず、自然細胞を反映する植物 - 微生物相互作用中のホメオスタシスシグナル。この水耕共培養システムでは、同時に遺伝子、アグロバクテリウムによる感染時シロイヌナズナ COL-0根組織における発現、ならびにシロイヌナズナとの共培養時にアグロバクテリウム遺伝子の活性化を決定することが可能でした。このシステムは、 アグロバクテリウム （ Agrobacterium ）との同時培養（感染）の際に、植物根へのアグロバクテリウムの付着および植物根の分泌のプロファイルを研究するのに適していることがさらに実証された（ 図1 ）。 <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55955/55955fig1.jpg" /> 図1：サンプル分析を用いた水耕共培養系の概要。植物をメッシュの上に成長させる（メッシュの上に芽を入れる）が、水耕培地に浸漬され、その後、バクテリアfまたは共培養する。次いで、植物組織および細菌を分離して、同時に抽出および分析する。この数字は参考文献35から変更されています。

<table><tbody><tr><td>植物種子 (Arabidopsis thaliana Col-0)</td><td>シロイヌナズナ生物資源センター</td><td>CS7000</td><td>https://abrc.osu.edu/order-stocks</td></tr><tr><td>細菌 (Agrobacterium tumefaciens C58)</td><td>ワシントン大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ラベル付き細菌</td><td>社内</td><td></td><td>オプション オプション、下流の分析による</td></tr><tr><td>渦</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5%次亜塩素酸ナトリウム</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二度蒸留水</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット&nbsp;</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>村重・スクーグ(MS)基礎塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5524</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B5ビタミンミックス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>フィトアガー</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>深いペトリ皿</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼メッシュ</td><td>フェリアーワイヤーグッズカンパニー株式会社</td><td>N / A</td><td>グレード:304;メッシュ数:40回; 40;ワイヤー径:0.01</td></tr><tr><td>マイクロポアテープ、1 "</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>日周成長チャンバー</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>円筒形ガラスタンク、100 &times; 80 mm&nbsp;</td><td>Pyrex</td><td>3250</td><td>他のサイズを使用することができますが、その場合、液体含有量は調整フロー</td></tr><tr><td>フード</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td>物(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振とうインキュベーター</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>(各種)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流の分析に依存</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流に依存分析</td></tr><tr><td>顕微鏡スライドとカバースリップ</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流の分析に依存</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流の分析に依存</td></tr><tr><td>細菌RNA抽出キット</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流の分析に依存</td></tr><tr><td>植物RNA抽出キット(RNeasy Plant Mini Kit)</td><td>Qiagen</td><td>74903または74904</td><td>オプション、</td></tr><tr><td>qRT-PCRのダウン</td>ストリーム分析に依存<td>(各種)</td><td></td><td>オプション、</td></tr><tr><td>マイクロアレイ分析のダウン</td>ストリーム分析に依存(<td>各種</td><td></td><td>)オプション、ダウンストリーム分析に依存</td></tr><tr><td>液体窒素</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、ダウンストリーム分析に依存</td></tr><tr><td>乳鉢と乳棒</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、ダウンストリーム分析によって異なります</td></tr><tr><td>0.2 & micro;Mポアフィルター</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>50mLコニカルチューブ</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>シール可能な試験管</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr><tr><td>HPLC用材料・装置</td><td>(各種)</td><td></td><td>オプション、</td></tr><tr><td>ESI-TOF-MS用下流分析材料・装置</td><td>による(各種)</td><td></td><td>オプション、下流分析による</td></tr></tbody></table>

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

A Hydroponic Co-cultivation System for Simultaneous and Systematic Analysis of Plant/Microbe Molecular Interactions and Signaling

自然な植物 - 微生物相互作用を模倣する実験デザインは、複雑な植物 - 微生物シグナル伝達プロセスを描写するために非常に重要である。 シロイヌナズナ - アグロバクテリウム・ツメファシエンス 細菌の病原性および植物相互作用を研究するための優れたモデルシステムを提供します。植物 - アグロバクテリウム相互作用の以前の研究は、植物細胞浮遊培養、植物の人工的創傷、または合成化学物質による微生物毒性因子または植物防御の人為的誘発に大きく依存していた。しかし、これらの方法は、植物および微生物が空間的および時間的な仕方で認識し応答する、植物の天然シグナル伝達とは異なる。この研究は、インタクトな植物が金属メッシュスクリーンによって支持され、 アグロバクテリウムと共培養された水耕共培養系を提示する。この共存系において、micrを誘導する合成植物ホルモンまたは化学物質は存在しない陰茎毒性または植物防御が補われる。水耕性共培養系は、植物の微生物との自然な相互作用および植物のシグナル伝達ホメオスタシスに非常に類似している。植物根は、 アグロバクテリウムを含む培地から分離することができ、植物宿主および相互作用する微生物の両方のシグナル伝達および応答を同時にかつ系統的に調べることができる。任意の時点/間隔で、植物組織または細菌を様々な「オミックス」分析のために別々に収穫することができ、このシステムの効力および効力を実証する。水耕共培養系は、1）多様な植物微生物系の相反するシグナル伝達、2）植物宿主と複数の微生物種（ すなわち微生物のコンソーシアムまたは微生物）との間のシグナル伝達、3）栄養素および化学物質の関与方法植物微生物シグナル伝達における微生物、および4）微生物が植物宿主とどのように相互作用し、生物的Oに対する植物耐性に寄与するかr非生物的ストレス。

水耕栽培共生システムの成長 A. tumefaciens C58の増殖曲線は、同時培養の最初の16時間で有意なラグ期を示し、 A. thaliana Col-0と共生培養したときに非常に安定した増殖、約0.9の最大OD 600まで48時間後に接種する。対照的に、本質的に細菌増殖はA. thalianaのない対照培養で観察されなかった（ 図4 ）。これらの結果は、人工的に供給される追加の栄養素がなければ、植物根を分泌する化合物が、水耕栽培共生系においてアグロバクテリウムの成長を支えることができることを示唆している。同時培養の最初の16時間の間の有意な遅延相は、病原体と共存する際のかなり複雑な宿主の知覚および徐々の根分泌に起因する可能性がある。/ p&gt; <p class="jove_content" fo...

記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。

An experimental design mimicking natural plant-microbe interactions is very important to delineate the complex plant-microbe signaling processes. ...

このシステムの全体的な目的は、自然環境を密接に模倣した簡便な実験系において、植物と微生物パートナー間の相互シグナル伝達および応答、あるいは化学物質や非生物的要因に対する植物の応答を研究することです。このビデオでは、植物とAgrobacterium tumefaciens菌の共培養を示します。この手法は、植物と微生物の相互作用、微生物または植物のストレス応答、および分子シグナル伝達における重要な疑問への回答に役立ち、植物と微生物の相互作用の初期段階における複雑なシグナル伝達の解析も可能です。この手法の主な利点は、自然環境を模倣したシンプルな設定において、植物と微生物の相互作用におけるシグナル伝達と応答の性質を理解できることです。この方法は、単一の微生物種と植物との相互作用に関する知見を得るために利用できるだけでなく、複数の微生物種や非生物的要因と植物との相互作用の研究にも適用可能です。私たちは、自然な状況を密接に模倣した植物・微生物相互作用中の細胞シグナル伝達の恒常性を探求している際に、この手法を考案しました。実験を開始するために、種子を滅菌する必要があります。Arabidopsis thalianaの場合、約200粒の種子を500 µLの脱イオン水とともにマイクロ遠心チューブに入れ、チューブを高速でボルテックスします。その後、卓上マイクロ遠心機を用いて、9000 x gで30秒間遠心分離します。ピペットを使用して、上澄みの水を除去します。次に、種子に 300 µL の 2% 次亜塩素酸ナトリウムを加え、ボルテックスで撹拌します。混合液を室温で静置させます。1分後、種子を遠心分離します。ピペットを用いて次亜塩素酸ナトリウム溶液を除去します。次に、500 µLの滅菌脱イオン水を種子に加え、混合物をボルテックスで撹拌します。チューブを遠心分離した後、水を切ります。種子に70%エタノールを500 µL加え、混合物をボルテックスします。種子が1分間静止するまで待った後、チューブを遠心分離します。ピペットを使用して70% ethanolを除去します。滅菌脱イオン水500 microlitersで種子を5回洗浄します。その後、滅菌超純水500 microlitersに滅菌済み種子を再懸濁します。滅菌済みの深いペトリ皿に、0.4% phyto agarを含む半強度のMurashige and Skoog（MS培地）を25 millilitersずつ注ぎます。ペトリ皿1枚につき、90 millimeter × 90 millimeterの正方形にカットしたステンレスメッシュを用意します。各正方形メッシュの角を、ペトリ皿の内側に収まる程度に軽く曲げます。メッシュの大部分に対して、角を90度の角度に曲げることで、角によってメッシュが支えられ、下部に根の発達に必要な十分な空間ができるようにします。カットしたメッシュの正方形をビーカーに入れ、アルミホイルで覆います。30分間の乾燥サイクルでオートクレーブにかけ、メッシュの正方形を滅菌します。ペトリ皿の中で培地が固化し、メッシュが滅菌されたら、各メッシュ正方形の曲がった角を下にして、固化した培地の上に置きます。メッシュを押し込み、角が培地に浸透し、メッシュの大部分が培地の表面に接するようにします。次に、滅菌した200 µLピペットを使用して、表面滅菌済みの個別の A thaliana 種子を吸い出し、各種子を慎重にメッシュの上に転移させます。植物種および実験の要件に応じた間隔で種子を配置します。ペトリ皿に蓋をして密閉し、プレートの縁に多孔性サージカルテープを貼ります。種子をアルミホイルで包みます。ペトリ皿全体を配置して種子の層状化を行います。2日後、ペトリ皿に入れた種子を22〜24°C、16時間の光周期で10〜14日間培養します。滅菌済みのクリーンベンチ内で、オートクレーブ滅菌した液状MS培地18 mLを、滅菌済みの蓋付き円筒形ガラスタンクに分注します。次に、滅菌済みピンセットを使用して、半凝固培地のペトリ皿から、生後10〜14日の苗を含む各メッシュスクエアを水耕栽培用円筒タンクに慎重に移動させます。ここに示している苗はアルファルファです。多孔性サージカルテープを用いて、タンクの蓋を密閉します。次に、苗を22～24°C、16時間の光周期、50 rpmの振盪条件下で培養します。接種前に、苗が入ったタンクに汚染の兆候がないか注意深く確認してください。汚染のないタンク内の培地は、澄んでいて透明であるはずです。コンタミネーションによりタンクが濁っている場合は、それらを廃棄し、残りのタンクに番号を付けます。番号付きの各タンクから水耕栽培培地を20 µL分取し、Luria brothまたはLB agarを入れたシャーレにスポットします。シャーレを28 °Cで28時間インキュベートします。各番号の水耕栽培タンクに、Agrobacterium tumefaciens懸濁液を50 µLずつ直ちに接種します。苗とA. tumefaciens菌を、温度22～24 °C、光周期16時間、振盪速度50 rpmの条件下で共培養します。12時間および28時間の培養後、スポットしたLBプレートを確認し、水耕栽培培地の無菌状態を検証します。コンタミネーションが認められる場合は、細菌を接種した該当番号のタンクを以降の下流アッセイに使用しないでください。次に、メッシュプレートを持ち上げて、細菌懸濁液から根を分離します。その後の解析に根を使用する場合は、根を切断し、二回蒸留水で迅速に洗浄した後、滅菌フィルターペーパー上で乾燥させてください。葉またはその他の組織を使用する場合は、その組織を切り出します。植物の転写物解析を行う場合は、根またはシュートを直ちに液体窒素に入れます。細菌の転写物解析を行う場合は、共培養タンクから1.5 millilitersの培養液を移し、遠心分離により細胞をペレット化します。適切な共培養後、滅菌したはさみを用いて、主根の側枝である個々の側根を切り離します。次に、緩く付着している物質を取り除くため、根を二回蒸留水で洗浄します。各根を顕微鏡スライド上の30 µLの水に浸し、ガラスカバーガラスで覆います。根の脱水を防ぐため、カバーガラスの端をマニキュアで封印します。次に、蛍光顕微鏡を用いて、A. thalianaの根へのA. tumefaciansの付着を観察します。適切な共培養後、植物を水耕栽培培地から分離します。18 mLの水耕栽培培地を0.2 µmのポアフィルターに通して50 mLコニカルチューブにろ過し、滅菌します。サンプルを-80 °Cで一晩凍結させます。翌日、50 mLコニカルチューブのキャップを緩め、凍結乾燥機に36時間入れます。最後に、HPLC分析および化合物検出のためにサンプルの保存または処理を行います。人工的な栄養剤の供給がない状態で、共培養システム内でA. tumefacians c58が成長しました。対照的に、A. thalianaを含まない対照群の培養では、細菌の増殖は実質的に観察されませんでした。水耕共栽培システムを用いて、この顕微鏡可視化で示されているように、細菌の根構造への付着を研究することができます。ここでは、PCherry赤色蛍光標識された細菌が、典型的な岩状または糸状の形態で植物の根構造に局在していることが分かります。植物宿主と相互作用する微生物の両方の遺伝子発現プロファイルは、QRTPCRを用いて確認できます。8時間の共栽培後、8つのtumefacians細胞において病原性遺伝子の発現上昇が認められました。同時に、A thalianaの根において、共培養に応じた特異的な遺伝子発現が認められました。共培養から72時間後、接種した植物のセクレトームでは、対照群と比較して35種類の化合物が増加し、76種類の化合物が減少していました。この手法は、自然環境を密接に模倣した簡便な系を用いて、植物と微生物の相互作用を研究し、植物と微生物または微生物バイオームパートナー間の相互応答、あるいは非生物的要因に対する植物の応答を探索する道を切り拓くものです。本ビデオをご視聴いただくことで、水耕栽培による植物・微生物共培養系を構築し、より自然かつ管理可能な環境で、植物の分子生物学的特性、微生物相互作用、およびシグナル応答を研究できるようになることを願っております。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典: Nathoo、N.、 et al.植物/微生物の分子相互作用とシグナル伝達の同時かつ体系的な解析のための水耕共栽培システム J. Vis. 経験。 (2017)。このビデオは、無菌条件下での植物と細菌の相互作用を研究するための水耕栽培共栽培システムを示しています。植物の苗木は、...

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細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。...

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ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。...

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微生物相互作用の調査のための高スループット共培養アッセイ

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シングルセルマイクロリットル液滴培養オミクスシステムを使用した自動およびハイスループット微生物モノクローナル培養およびピッキング

学ぶ水耕栽培共生システムによる植物と微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時分析。Agrobacterium tumefaciensを用いて自然環境を模した実験設定で、植物のストレス応答と微生物の動態を詳細に解明する方法です。

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

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