シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

この方法の全体的な目標は、モデル生物を使用して、植物胚形成中の胚のパターン形成を特徴付けることです。この方法は、シロイヌナズナの胚形成など、植物分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、モデル植物シロイヌナズナの胚パターン形成が推奨される操作によって特徴付けられることです。

その手順を実演しているのは、私の研究室の大学院生であるJinlin Fengです。この手順を開始するには、1.5ミリリットルのチューブに100個の種子を追加します。次亜塩素酸ナトリウムを1ミリリットル加えて、種子を滅菌します。

チューブを数回反転させて、シードと溶液が十分に混合されていることを確認します。5分後、チューブを1200Gで30秒間遠心分離します。上清を取り除き、種子を滅菌水で4回洗って、残っている次亜塩素酸ナトリウムを取り除きます。

次に、4.4グラムのMS基礎塩混合物と10グラムのスクロースを1リットルの超純水に加えます。かき混ぜて塩とショ糖を溶かします。1 molの水酸化カリウムを使用して、溶液のpHを5.8に調整します。

次に、3グラムのゲル化剤を加え、溶液を摂氏121度で15分間滅菌します。得られたMS培地30ミリリットルを12cmの培養皿に注ぎます。滅菌した種子をMSプレートに置きます。

プレートを冷蔵庫に移し、摂氏4度で3日間暗闇に置き、種子を層状にします。次に、プレートを成長チャンバーに長時間の条件下で8日間保管します。次に、植物をトレイの土に移します。

水の損失を防ぐために、トレイを透明な白い蓋で覆います。植物のガラス化を避けるために小さな隙間を残します。5日後、蓋を外し、ウォークインチャンバーで長時間の条件下で植物を栽培します。

成長の約20日後、糸を使用して、午後8:00に種子の茎と花序の位置に10〜15個の花芽をマークします。胚珠の受粉の開始を、マークされたつぼみが開いて花を咲かせるときを翌朝8:00と定義します。ホイヤー溶液の調製を開始するには、24ミリリットルのチューブに50グラムの塩素水和物を追加します。.チューブをアルミホイルで完全に包み、ホイルがすべての光を遮断することを確認します。

9ミリリットルの超純水と3ミリリットルのグリセロールを加えます。チューブを振って塩素水和物を溶かします。次に、調製したホイヤー溶液を室温で一晩放置して、気泡を取り除きます。

まず、顕微鏡のスライドガラスに両面粘着テープを貼り付けます。受粉後所望の日数だけ成長させたシリックを、偽中隔が表面に対して垂直な側に置きます。注射針を使用して、偽中隔の両側で手根骨を分割します。

次に、解剖した2つの手根骨をスライドに取り付けて、胚珠とシリックがステレオスコープで見えるようにします。70マイクロリットルのホイヤー溶液をスライドガラスに分注します。.次に、先端の細いピンセットを溶液に浸して、先端を湿らせます。

ステレオスコープとピンセットを使用して、胚珠をホイヤー溶液に移し、胚を洗浄します。この後、気泡が発生しないように、スライドにカバースリップをそっと貼り付けます。完成したスライドを暗い部屋の箱に室温で2〜12時間置きました。

必要な時間が経過したら、顕微鏡のDIC機能を使用して、クリアされた胚珠を調べます。低出力の磁場の下で胚を見つけ、次に高出力の磁場に変更して、発達した胚の細胞パターンを観察します。次に、さまざまな発生段階にある胚を調べます。

まず、DR5 GFPプラスミドを調製し、テキストプロトコルで概説されているように、アグロバクテリウムからメタシアン媒介形質転換により野生型植物に導入します。加水分解物を含むMS培地プレートを使用してT1プラントを選択します。次に、テキストプロトコルに概説されているように植物を移して栽培し、T3植物を取得します。

糸を使用して、ホモ接合体T3植物の花芽を花序の種子茎の位置に印を付けます 午後8:00。この後、3ミリリットルのグリセロールと47ミリリットルの超純水を混合して、6%グリセロール溶液を生成します。次に、顕微鏡のスライドガラスに両面粘着テープを貼り付けます。T3植物のシリックを、偽中隔が表面に対して垂直になるようにスライドに置きます。

注射針を使用して、偽中隔の両側で手根骨を分割します。解剖した2つの手根骨をスライドに取り付けて、胚珠とシリックがステレオスコープで見えるようにします。次に、30マイクロリットルの6%グリセロールをスライドに分注します。

先端の細いピンセットを溶液に浸して、先端を湿らせます。ステレオスコープとピンセットを使用して、胚珠をグリセロール溶液に移します。カバースリップをスライドにそっと置きます。

次に、スライドをすばやく静かにタップして、胚珠から胚を押し出します。この後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を使用して、スライドの緑色蛍光タンパク質の蛍光を調べます。低電力フィールドの下で単離された胚を見つけ、その位置を記録します。

高倍率の磁場に変更し、励起光源を488ナノメートルに設定して、胚でのGR5 GFP発現を観察します。次に、GFP発現を検出し、テキストプロトコルで概説されているように胚パターン形成を特徴付けます。この研究では、シロイヌナズナの胚形成は、観察されるように胚珠のクリアランスを介して観察されます。

胚珠クリアランス後、異なる発生段階の胚は、微分干渉コントラスト顕微鏡を使用して区別できます。次に、胚形成中のGR5 GFPの発現パターンを共焦点レーザー走査型顕微鏡で記録します。DR5は、野生型の球状およびハート型の胚の根極に発現していることがわかります。

DR5は、胚の子葉の先端、および成熟した野生型胚の血管系に発現しているのが見られます。この後、胚形成期のシロイヌナズナにおけるnaa10の役割が検討されています。仮説は異常に分割されていることが観察され、野生型植物の横方向の非対称分割と比較して、naa10では斜めと垂直の分割が

ここで見られるお尻は、ウシは球状段階でほとんどのnaa10胚にほぼ均一に分布しており、野生型の胚と比較して仮説でより広範なシグナルを保持しています。これらの結果は、naa10が胚形成に必要であり、シロイヌナズナのウシナシグナル伝達経路を介してnaa10が呼び出される可能性があることを示しています。この手順を試みる際には、シロイヌナズナを植物材料として育てる方法を覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、細胞特異的遺伝子の発現などの追加の質問に答えるために、in-situハイブリダイゼーションなどの他の測定を行うことができます。この技術の開発後、この技術は、胚形成の分野の研究者がシロイヌナズナの特定の遺伝子が胚形成を媒介する分子メカニズムを探求する道を開くものです。このビデオを見た後、シロイヌナズナの胚形成を特徴付ける方法についてよく理解できるはずです。