Name: ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶ ビオチン化法を用いて初代星状細胞におけるAquaporin-4の細胞表面発現とエンドサイトーシス速度を測定する方法。ラミニンの影響を評価し、神経科学研究に応用可能な技術を習得する。

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このプロジェクトは、カナダ健康研究所のPG＃20R47867によって支援されました。

ビオチン化によるアストロサイトにおける相対的細胞表面タンパク質発現の測定注：ここでは、水透過性チャネルアクアポリン-4（AQP4）の細胞表面局在に対する細胞外マトリックス分子ラミニンの効果の研究へのこのビオチン化技術の応用を示す。このアッセイに必要な特殊材料には、スルホ-NHS-LC-ビオチンとストレプトアビジン - アガロース樹脂が含まれます（ 表の表を参照）。 <ol><li> Noel et al。 図12に示すように、アッセイの約2週間前に皮質星状細胞の培養物を調製し、75cm 2通気培養フラスコ中でそれらを増殖させる。星状細胞が80〜90％コンフルエントである場合、0.05％トリプシンを用いてそれらを培養表面から分離し、次いでそれらを1：3で通過させる。 </li><li>アッセイの48時間前に、細胞が再び80〜90％コンフルエントになると、通過星状細胞1：3（c培養形式でハンギング）を、60mm細胞培養皿上に置き、実験が行われる日に70％を超えるコンフルエントになるようにする。細胞が皿の間に均等に分配されるようにします。 </li><li>アッセイの16時間前に、ラミニンを培地中にピペットで最終濃度24nMとし、37℃でインキュベートする。 </li><li> CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl 2・6H 2 Oおよび100mg / L CaCl 2 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5（pH7.4））中で、以下のように調製し、 CM-PBS中の50mM NH 4 Cl）、消化緩衝液（25mM Tris、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM）中のスルホ-NHS-LC-ビオチン） 1％トリトンX-100,1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）、3Xローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー）および洗浄緩衝液（10mMトリス（pH7.4）、1.5mMのEDTA、150mMのNaCl、1％のTriton X-100,1×プロテアーゼ阻害剤カクテル）。 </li><li>レムインキュベーターから星状細胞培養物を保持するオーブンの皿を取り出し、培地を捨てる。 </li><li> 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。 </li><li>ピペット2mLのビオチン緩衝液を各ウェルに入れ、皿を前後に数回ゆっくりと数回傾けて、完全な被覆を確実にする。氷上に30分間放置する。 </li><li>アスピレーターを用いてビオチンバッファーを除去し、4mLクエンチングバッファーと交換する。氷上に10分間放置する。 </li><li>クエンチングバッファーを吸引し、同等の容量のものと交換してください。再度、氷上に10分間放置する。 </li><li>クエンチングバッファーを捨て、4 mLの冷えたCM-PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>セルリフタを使用して1mLの冷却したCM-PBSに細胞をこすり、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li>ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、500μLの溶解緩衝液中で細胞を再懸濁する。 </li><li>サンプルを氷上で30分間放置するか、5分ごとにボルテックスするか、またはpl4℃でエンドオーバー・ローテーターを使用してください。 </li><li>ライセートを14,000 xgで10分間4℃で遠心分離して、界面活性剤不溶性物質を沈殿させます。上清を新しいマイクロ遠心チューブに移す。 <ol><li>このライセートを50μL保存し、ローディングバッファーを追加します。次いで、それを乾燥浴中で95℃で加熱することによって変性させる;これは、ビオチン化細胞表面タンパク質および非ビオチン化細胞質タンパク質の両方を含有する「入力」画分である。 </li></ol></li><li>一対の鋭いはさみを使用して、先端から約0.5 cmの材料を切断してピペットチップの開口部を広げます。このピペットチップを使用して、75μLのストレプトアビジン - アガロースビーズ（通常4℃で保存）をライセートに移し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートします。 <ol><li>ストレプトアビジン - アガロースは、50％のビーズを含有するスラリーとしてしばしば販売され、抗菌溶液中に懸濁されているので、スラリーを粉砕してビーズ150μLの懸濁液を各試料にピペットで移す。 </li></ol></li><li>ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを用いて、4℃、1500×gで30秒間遠心分離する。 <ol><li>上清50μLを保存する（ローディングバッファーを加え、水浴または加熱ブロックで95℃で変性させる）。これは「細胞内」画分を表し、主に非ビオチン化細胞質タンパク質からなる。 </li></ol></li><li>ペレット状のビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ1.16のように）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。 </li><li>遠心分離（4℃で30秒間1500×g）によってビーズをペレット化し、上にある洗浄バッファーを捨てる。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。これを95℃で変性させることによりビーズからビオチンおよびストレプトアビジンを遊離させる。この分数uldはビオチン化細胞表面タンパク質のみを含む（「細胞表面」画分）。 <ol><li>入力、細胞表面および細胞内画分をSDS-PAGE 13で分離し、ウェスタンブロッティングで分析します14 。 注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。 </li></ol></li></ol>ビオチン化によるアストロサイト内の細胞表面タンパク質の内在化率の測定注：以下では、この例では、星状細胞におけるAQP4のエンドサイトーシスを追跡するために使用される典型的なパルスチェイスビオチン化実験を記載する。このメソッドは、マドリッドらが使用した方法に基づいています。 15 。必要な特殊材料には、スルホ-NHS-SS-ビオチン、ストレプトアビジン - アガロース樹脂、還元型グルタチオン、ヨードアセトアミドが含まれます（ 表の表を参照）。 <ol><li>前のセクションで概説した方法を用いて、60mmディッシュ内のマウス大脳皮質の星状細胞の培養物を調製する。アッセイの日に細胞が約70％コンフルエントであること、および各ディッシュに同数の細胞が含まれていることを確認する。 </li><li> CM-PBS（1X PBS中100mg / L MgCl 2・6H 2 Oおよび100mg / L CaCl 2 、pH7.4）、ビオチン緩衝液（0.5 （50mM還元グルタチオン、75mM NaClおよび75mM NaOH）、クエンチング緩衝液（50mMヨードアセトアミド、1％BSA、CM-PBS中）、溶解緩衝液（25mMトリス、pH7.4,25mMグリシン、150mM NaClおよび5mM EDTA、1％トリトンX-100,1（10mM Tris、pH7.4,1.5mM EDTA、10mMトリス-HCl、pH7.5）を含む3×ローディングバッファー（150mMトリス、pH6.8,6％SDS、30％グリセロール、300mM DTTおよび0.01％ブロモフェノールブルー） 150mM NaCl、1％トリトンX-100、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル）中で培養した。 </li><li>新鮮な細胞培養培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM）を調製し、37℃の水浴中に置く。 </li><li>インキュベーターから星状細胞培養物を除去し、アスピレーターを用いて培地を吸引する。 </li><li> 4 mLの冷たいCM-PBSで細胞を3回洗浄し、皿を砕いた氷上に置きます。 </li><li>各ディッシュに3 mLのビオチン緩衝液をピペットで入れ、ディッシュを前後に数回傾けてバッファーがよく分散されていることを確認し、これを氷上に30分間放置する。 </li><li>ビオチン緩衝液を吸引し、5 mLの暖かい培地と交換する。培養皿を37℃で15分間インキュベートし、第2の皿を同じ温度で30分間インキュベートする。 4時に別の料理を残す6; C：0分のサンプル。 </li><li>インキュベーション期間の終わりに、培地を捨て、4mLの冷却CM-PBSで細胞を3回洗浄する。細胞上に6 mLの還元バッファーをピペットで入れ、氷上で15分間放置する。 </li><li>還元バッファーを取り除き、6 mLの新しい還元バッファーと交換してください。氷上にさらに15分間置く。 </li><li>還元液を取り除き、6 mLクエンチングバッファーと交換する。氷上で15分間放置する。 </li><li>もう一度急冷ステップを繰り返します。 </li><li>クエンチング緩衝液を捨て、4mLの冷PBSで細胞を3回洗浄する。 </li><li>セルリフタを使用して1mLの冷却PBSに細胞を擦り、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移す。 </li><li>ペレット細胞を100×gで3分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、細胞を500μLの溶解緩衝液に再懸濁する。 </li><li>これを氷上に30分間放置し、5分間ごとにボルテックスする。あるいは、サンプルを4℃の終端回転子にこの時間置いてください。 </li><li>リットルを遠心する界面活性剤不溶性物質をペレット化するために14,000 xgで4℃で10分間インキュベートし、上清を新しい微量遠心管に移す。このライセート50μLを保存し、ローディングバッファーを添加し、乾燥浴中で95℃で変性させる;これはビオチン化エンドサイトーシスタンパク質と非ビオチン化タンパク質の両方を含む「インプット」画分である。 </li><li>カットピペットチップを使用して、150μLのストレプトアビジン - アガローススラリーをライセートに添加し、4℃で3時間シェーカー/ロッカーでインキュベートする。このステップの詳細については、1.15を参照してください。 </li><li>ペレットストレプトアビジン - アガロースビーズを4℃で30秒間1,500×gで遠心分離することによって単離した。 </li><li> 1mLの洗浄バッファーにビーズを再懸濁し、4℃で3分間揺り動かします。ペレットビーズ（ステップ2.18）、上清を捨てる。非ビオチン化サイトゾルタンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるために、このプロセスを4回繰り返す。 </li><li>ペレットビーズを1,500 xgで30秒間、4℃で遠心分離し、ビーズを捨てる洗浄バッファー。 50μLの1Xローディングバッファー（溶解バッファーを使用して希釈）を添加する。ビオチンおよびストレプトアビジンをビーズから95℃で変性させることにより放出させる。この画分は内在化された細胞表面タンパク質のみを含む（「エンドサイトーシス」画分）。 </li><li> SDS-PAGE 13で入力、細胞表面および非結合画分を分離し、ウエスタンブロッティングで分析します14 。 注：実験では4〜20％のプレキャスト勾配ゲルを使用しましたが、この研究で興味のあるタンパク質については、4％のスタッキング層（それぞれ0.1％SDSを含む）を含む12〜14％の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用すべきである。ビオチン化タンパク質の見かけ上の分子量に観察可能なアップシフトが存在することがあることに留意されたい。 </li></ol>

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著者らは、利害の対立を宣言していない。

変更： これらの方法は接着細胞と共に使用するように設計されているので、100mg / LのMgCl 2・6H 2 Oを含有するPBSの使用を指定し、 細胞が培養表面に付着したままであり、細胞 - 細胞接合部が破壊されないようにするために、洗浄ステップのための100mg / LのCaCl 2 （CM-PBS）および特定の緩衝液のベースとして使用する。しかしながら、プロトコールは、手順の各段階の間に細胞がペレット化される場合、非接着性細胞型に適用されてもよい。これらの場合、CM-PBSはPBSで置き換えてもよい。 さらに、ここで述べた各条件はこのプロトコルに固有であることに注意することが重要であり、この方法を他のアプリケーションに適用する場合には、大まかなガイドラインと見なすべきである。特に、洗剤の抽出手順が適切であることを確認する必要がありますr細胞タイプであり、遠心分離機の設定は細胞タイプに適しており、ストレプトア...

細胞表面のタンパク質は、細胞機能を維持する中心的な役割を果たしています。多くの場合、それらの活性は、細胞内部位でそれらを一時的に隔離するか、またはそれらを分解経路1,2,3,4,5に向かわせるエンドサイトーシスプロセスに依存するか、または調節される。ここでは、2つのビオチン化に基づく手法を用いて、細胞膜で発現されたタンパク質と新たに内在化されたタンパク質を特異的にタグ付けして単離できるようにしました。これらの方法を介して、関心対象のタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を定量化することができ、したがってその調節のより明確な評価を達成することができる。 ビオチン化による相対的細胞表面タンパク質発現の測定 以前はビタミンH 6として知られていたビオチンまたはビタミンB7は、生体分子の反応性アミン、スルフヒドリルおよびカルボキシル基を化学的に修飾するために使用できる小さな水溶性分子である。細胞表面ビオチン化試薬の現在の作物は、主として、ビオチンまたはその誘導体の膜不透過性スルホン化N-ヒドロキシスクシンイミド（スルホ-NHS）エステルからなり、ここで発現されるタンパク質のリジン残基の側鎖に存在するアミンと反応するように設計されているこれらが塩基性条件下で脱プロトン化され、ビオチン部分とアミド結合を形成することになる。このように改変された細胞表面タンパク質は、ビオチンに対して大きな親和性を有し、約10 -15の解離定数を有する後者に結合する66〜69kDaの四量体タンパク質であるアビジンの使用によって単離され得る。最も強い非共有結合相互作用8 </sup&gt; 、 9 。 以前の研究では、細胞表面でタンパク質発現を定量化する多くの代替方法が用いられてきた。関心対象のタンパク質に特異的な蛍光標識された抗体を用いた不透過化細胞の標識は、例えば蛍光顕微鏡による視覚化が一般的に採用されているアプローチであるが、細胞外エピトープに結合する抗体の利用可能性に大きく依存する。より最近では、酸性培地に曝露することに反応するpH感受性フルオロフォアを有するキメラタンパク質の使用を含む方法も首尾よく用いられている10 。しかしながら、このようなアッセイは、通常、目的のタンパク質がネイティブに見出されない細胞株におけるこれらの構築物の外因性発現を含む。それにもかかわらず、これらのアプローチは、細胞の局在化および細胞外経路に関する貴重な情報を提供することができるしたがって、ツールが利用可能である場合には、ここに記載されているビオチン化に基づくアプローチと併せて使用すべきである。 典型的なビオチン化アッセイでは、細胞をまず4℃のPBS中で完全に洗浄する。これにより、培地によって導入された微量の血清タンパク質が除去され、次のステップで過剰量のビオチンを消費しないことが保証されます。さらに重要なことに、温度の低下はエンドサイトーシスを著しく減速させる。次いで、ビオチン化試薬を添加する。次に、細胞を再び洗浄し、グリシンまたはNH 4 Clのいずれかを含有するクエンチング緩衝液とインキュベートする。その目的は、未反応のビオチンのすべての痕跡を不活性化することである。次いで、細胞を溶解し、続いてアガロース固定化ストレプトアビジンを添加してビオチン化タンパク質を沈殿させる。分析は、ウェスタンブロッティングを介して一般的に行われ、様々なpr定量すべきoteins。 このアッセイの基礎のために、それは、細胞外環境に曝露された部分を有するタンパク質のみに用いるのに適している。シングルパスタンパク質はビオチン化されにくい傾向があるが、ループ領域内に多数の反応性リジンを有する可能性のあるマルチパス膜貫通タンパク質がこの方法に最も適している。これらの場合でさえも、構造変化または分子間相互作用が特定の反応部位を閉塞し、予想よりも低いビオチン化収率をもたらす可能性が残っている。 ビオチン化による細胞表面タンパク質の内在化速度の決定 このアッセイの原理は、細胞表面ビオチン化の原理に大いに類似しており、その中で最も重要なものは可逆的ビオチン化試薬の使用である。ビオチン基（これらの）は、還元剤の影響を受けやすい構造内の結合結合;これは、アッセイ期間中に細胞内部位に取り込まれた細胞表面タンパク質のみがビオチン化されたままであることを保証するために利用される。アッセイは、一般的に以下の方法で行われる。最初に細胞を洗浄し、冷たい試薬でビオチン化し、次いで37℃の細胞培地を再導入し、細胞をインキュベーターに戻す。これにより、標識された細胞表面タンパク質がエンドサイトーシスを受けるようになる。次いで、膜に浸透することができない還元剤であるグルタチオンを添加して、細胞表面上に残っているタンパク質に結合したビオチン部分のジスルフィド結合を破壊する。最後に、壊れたジスルフィド結合をヨードアセトアミドと反応させ、不安定なチオール基を消費し、結合が改質されないようにする。前と同様に、細胞を溶解し、標識タンパク質をストレプトアビジン - アガロースを用いて沈殿させる。 限界ディスク前のセクションでは、これらのメソッド間で共有されている類似性のためにここでも適用されます。さらに、このアッセイに伴う温度変化は、特に急速に内部移行したタンパク質または急速にリサイクルするタンパク質の場合に、各時間の増加につきどの程度の量のタンパク質がエンドサイトーシスされるかを正確に決定することを妨げるものである。従って、このアッセイは、エンドサイトーシス速度の半定量的な推定しか提供しない。全反射蛍光顕微鏡法を用いて、負荷された各小胞の取り込みを追跡し、エンドサイトーシスの動態のより正確な測定値を提供することができる。したがって、関心のあるタンパク質の蛍光標識されたキメラ構築物が利用可能であると仮定して、このアッセイに非常に有用な補完物を提供することができる。

<table><tbody><tr><td>塩化アンモニウム (NH4Cl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A661-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-50</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610404</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610729</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610611</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#21335</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td>#<td>21331</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetamide</td><td>Bio-Rad</td><td>#163-2109</td><td></td></tr><tr><td>Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td>のラミニン 氷<td>上で解凍します。</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗β;-アクチン抗体 (AC-15)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗β;-ジストログリカン抗体 (43DAG1/8D5)</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>B-DG-CE</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ アフィニピュア ドンキー 抗マウス IgG (H+L)</td><td>ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ</td><td>715-035-150</td><td></td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼ アフィニピュア ヤギ 抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>ジャクソン イムノ リサーチ ラボラトリーズ</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>還元型グルタチオン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6529</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>862010&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンアガロース樹脂</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>#20347</td><td></td></tr><tr><td>ウサギポリクローナル抗AQP4抗体</td><td>アロモン</td><td>AQP-004</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基(トリズマ塩基)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>トリスHCl</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

細胞表面タンパク質は、幅広い機能を仲介します。多くの場合、それらの活性は細胞膜でのレベルを調節するエンドサイトーシスプロセスによって調節される。ここでは、細胞表面タンパク質のビオチン化の原理に基づくこのようなプロセスの研究を容易にする2つの方法の詳細なプロトコールを示す。第1は、細胞表面における特定のタンパク質の相対的レベルの半定量的測定を可能にするように設計されている。その中で、細胞の原形質膜タンパク質のリシン残基は、最初にビオチン部分で標識される。細胞が溶解すると、ビオチンに対する天然の親和性を利用してアガロース固定化ストレプトアビジンの使用によってこれらのタンパク質を特異的に沈降させることができる。このようにして単離されたタンパク質は、その後、標準的なウェスタンブロット法を介して分析され得る。第2の方法は、粒子のエンドサイトーシス速度を決定する手段を提供する細胞表面標的を一定期間にわたって標的化する。細胞表面タンパク質は、開裂可能なジスルフィド結合を含むビオチン誘導体で最初に修飾される。次に、細胞を通常の培養条件に戻し、ビオチン化タンパク質の割合をエンドサイトーシスで取り込む。次に、非内部ビオチン基のジスルフィド結合は、膜不透過性還元剤グルタチオンを用いて還元される。このアプローチにより、エンドサイトーシスタンパク質を高度に特異的に単離し定量することができる。

星状細胞におけるAQP4の原形質膜発現を評価するための細胞表面ビオチン化の使用 ラミニン処理した星状細胞培養物および未処理の対照細胞を、記載された方法を用いて細胞表面のビオチン化に供した。ビオチン化タンパク質をアガロース結合ストレプトアビジンで沈殿させ、次いでSDS-PAGEにより分離した。細胞表面画分をAQP4およびβ-ジストログリカン（β-DG）について細胞表面負荷対照としてプローブし、一方、入力および細胞内画分をローディング対照としてAQP4およびβ-アクチンについてブロットした（ 図 1A ）。細胞表面画分のバンド強度をデンシトメトリーにより定量し、各細胞セットのAQP4レベルを最初にβ-DG値に対して正規化し、次いでこれらの比を対照細胞のそれに対して正規化した。ヒストグラム（ 図1 </strong&gt; B ）は、3回の独立し...

この報告では、原形質膜で発現されるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度を決定するために設計された2つのビオチン化に基づく方法を提示する。

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

このビデオでは、細胞表面ビオチン化とパルス・チェイス・ビオチン化という2つの方法を紹介します。以下のデモンストレーションでは、アストロサイトを使用します。アストロサイトは脳内で最も豊富に存在するグリア細胞の一種であり、我々が目的とするタンパク質であるAquaporin-4を発現しています。本論文で用いる手法は、浮遊細胞または接着細胞を含む多くの異なる細胞型に適用可能です。これらの技術は、ビオチンがアクセス可能な細胞外ドメインを持つほぼすべての膜貫通タンパク質について、その細胞表面への発現および内部移行を研究するために利用できます。この細胞表面ビオチン化アッセイの全般的な目的は、アストロサイトの形質膜における水透過性チャネル Aquaporin-4 の発現に対するラミニンの影響を明らかにすることです。本手順を開始するには、アストロサイト培養物をインキュベーターから取り出し、培地を吸引して除去します。冷却したCM-PBSを4 mLずつ用いて細胞を3回洗浄し、ディッシュを砕氷上に置きます。CM-PBSを吸引して除去した後、各ウェルにビオチンバッファーを2 mLずつピペットで分注します。培養皿をゆっくりと数回前後に傾けて、全体に行き渡らせた後、培養物を氷上で30分間静置します。その後、ビオチンバッファーを除去し、4 mLのクエンチングバッファーに置換して、培養物を氷上で10分間保持します。次に、液を吸引して同量のクエンチングバッファーに置換し、さらに培養物を氷上で10分間静置します。次に、クエンチング緩衝液を除去し、4 mLの冷えたCM-PBSで細胞を3回洗浄します。その後、細胞を1 mLの冷えたCM-PBSで回収し、懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。次に、4 °Cに設定した冷蔵マイクロ遠心機を用いて、100 gで3分間遠心分離し、細胞をペレット化します。その後、上清を捨て、細胞を500 µLの溶解バッファーに再懸濁します。次に、サンプルを氷上に30分間置き、5分ごとにボルテックスします。その後、溶解物を4°Cで14,000 gにて10分間遠心分離し、界面活性剤および可溶性物質を沈殿させます。次に、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。ライセートを 50 µL 分取り分け、そこに 3 X ローディングバッファーを 25 µL 加えます。その後、ドライバスを用いて 95 °C で加熱し、変性させます。これは、ビオチン化された細胞表面タンパク質と非ビオチン化された細胞質タンパク質の両方を含むインプット分画です。カットしたピペットチップを用いて、75 µLのストレプトアビジンアガロースビーズを溶解液に転移し、シェーカーを用いて4 °Cで3時間インキュベートします。その後、4 °Cで1,500 gで30秒間遠心分離し、ストレプトアビジンアガロースビーズをペレット化します。上清を50 µL分取し、3 X ローディングバッファーを25 µL加えます。次に、ウォーターバスまたはヒーティングブロックを用いて95 °Cで変性させます。これが細胞内画分であり、主に非ビオチン化シトソルタンパク質で構成されています。その後、回収したビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、4 °Cで3分間振盪させます。ビーズを遠心分離で回収し、上清を捨てます。非ビオチン化細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるため、この工程をさらに4回繰り返します。ライシスバッファーで1Xに希釈したローディングバッファーを50 µL加えます。95 °Cで変性させ、ビーズからビオチンとストレプトアビジンを遊離させます。この分画には、ビオチン化された細胞表面タンパク質のみが含まれているはずです。その後、インプット分画、細胞表面分画、および細胞内分画をSDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッティングにより解析します。パルス追跡ビオチン化実験の全般的な目的は、アストロサイトにおけるAquaporin-4の概略的な内部移行速度を決定することです。まず、アストロサイト培養細胞をインキュベーターから取り出し、培地を吸引して除きます。次に、細胞を4 mLの冷却したCM-PBSで3回洗浄し、ディッシュを砕氷上に置きます。CM-PBSを吸引した後、各ディッシュに3 mLのビオチンバッファーをピペットで加えます。ディッシュを数回前後に傾けてバッファーを十分に行き渡らせ、氷上で30分間静置します。次に、ビオチンバッファーを吸引し、5 mLの加温した培地と置換します。1つの培養皿を37 °Cで15分間、もう1つの培養皿を同温で30分間インキュベートします。さらに別の1皿を4 °Cに保持し、0分時のサンプルとします。インキュベーション期間の終了後、培地を除去し、冷却した4 mLのCM-PBSで細胞を3回洗浄します。その後、CM-PBSを吸引し、6 mLの還元緩衝液を細胞にピペッティングして、サンプルを氷上で15分間静置します。次に、培地を6 mLの新鮮な還元緩衝液に交換し、サンプルをさらに15分間氷上に置きます。還元バッファーに含まれるグルタチオンが細胞表面に残っているビオチンモエシスを切断するため、この工程は非常に重要です。これにより、内部に取り込まれたタンパク質のみがビオチン標識されることが保証されます。その後、還元溶液を除去し、6 mLのクエンチングバッファーに置換します。サンプルをさらに15分間氷上に置き、クエンチング工程をもう一度繰り返します。次に、クエンチングバッファーを除去し、4 mLの冷やしたPBSで細胞を3回洗浄します。CM-PBSを吸引し、セルリフターを用いて細胞を1 mLの冷やしたPBS中に掻き集め、その懸濁液をマイクロセントリフュージチューブに移します。100 gで3分間遠心分離し、細胞をペレット化します。3分後、上清を除去し、細胞を500 µLの溶解バッファーに再懸濁します。サンプルを氷上に30分間静置し、5分ごとにボルテックス処理を行います。溶解物を14,000 gで4°Cにて10分間遠心分離し、界面活性剤および可溶性物質を沈殿させます。その後、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。この溶解物を50 µL分取して保存し、ローディングバッファーを加えます。次に、ドライバスを用いて細胞を95 °Cで変性させます。これがインプット分画であり、ビオチン化されたエンドサイトーシス蛋白と非ビオチン化蛋白の両方が含まれています。カットしたピペットチップを使用して、150 µLのストレプトアビジンアガローススラリーを溶解液に加え、シェーカーを用いて4 °Cで3時間インキュベートします。3時間後、4°Cで1,500 g、30秒間遠心分離し、ストレプトアビジンアガロースビーズをペレット化します。ビーズを1 mLの洗浄緩衝液に再懸濁し、4°Cで3分間ロッキングミキサーで撹拌します。ビーズをペレット化し、上清を捨てます。非ビオチン化された細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えるため、この工程をさらに4回繰り返します。その後、4 °Cで30秒間、1,500 gで遠心分離してビーズをペレット化します。上清の洗浄バッファーを除去し、1x ローディングバッファーを50 µL加えます。95 °Cで変性させることにより、ビーズからビオチンおよびストレプトアビジンを遊離させます。この画分には、細胞内に取り込まれた細胞表面タンパク質のみが含まれているはずです。その後、インプット画分、細胞表面画分、および非結合画分をSDS-PAGEで分離し、ウェスタンブロッティングにより分析します。ここでは、未処理のアストロサイトおよび24 nanomolarのラミニンで処理したアストロサイトから得られた細胞表面画分、細胞内画分、および全画分について、Aquaporin-4およびbeta-dystroglycanをプローブした結果を示しています。このヒストグラムは、未処理およびラミニン処理したアストロサイトにおけるAquaporin-4の細胞表面レベルの差を、beta-dytroglycanで標準化したものです。この図では、0分、15分、および30分に回収した内部移行タンパク質画分について、Aquaporin-4をプローブしています。このヒストグラムは、4回の独立した実験におけるAquaporin-4の内部移行をまとめたものであり、0分時点の値を基準に正規化しています。アスタリスクは、15分から30分の間にエンドサイトーシスされたAquaporin-4の量が統計的に有意に増加したことを示しています。切断可能なビオチンアナログのジスルフィド結合を切断するためにグルタチオンを使用すると、ビオチン化分画に対する細胞表面Aquaporin-4の寄与は急激に減少します。これにより、0分と15分のサンプルの間に明確な差が生じます。このステップを省略すると、細胞表面プールに由来するシグナルのため、2つの時点間の変化を検出できなくなります。この手順に続き、免疫蛍光染色やTIRF顕微鏡などの他の手法を適用することで、貨物の物理的な輸送を含むさらなる疑問に答えることができます。

determining-cell-surface-expression-endocytic-rate-proteins-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

このビデオは、アストロサイト培養物からの細胞表面および細胞内タンパク質の単離を示しています。アストロサイト培養物を氷上に置いてエンドサイトーシスを阻害し、細胞表面タンパク質をビオチン化試薬で標識します。細胞を溶解して、ビオチン化細胞表面タンパク質と非ビオチン化細胞内タンパク質を放出します。最後に、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用して、ビオチン化された細胞表面タンパク質を細胞内タンパク質から分離します。...

アストロサイト培養物からの細胞表面および細胞内タンパク質の単離

このビデオでは、ビオチン化を使用してマウス皮質アストロサイトの標的タンパク質のインターナリゼーションを評価する方法を示し、その後、細胞溶解、ストレプトアビジンベースのタンパク質抽出、変性、およびウェスタンブロット分析を行い、インターナリゼーションの成功を確認する方法を示します。...

ビオチン誘導体を用いた標的表面タンパク質のインターナリゼーションの評価

出典: Creighton, BA, et al. アストロサイトにおける細胞小器官と他の貨物の細胞内輸送の視覚化と解析J. Vis. 経験。...

培養アストロサイトにおける貨物の細胞内輸送の可視化

膜輸送は、細胞膜から細胞内部へのタンパク質の輸送(すなわち、エンドサイトーシス)を含み、その後、分解のためにリソソームに輸送するか、またはリサイクルのために細胞膜に輸送します。この記事で説明する方法は、細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するように設計されています。...

セルベースの​​L-グルタチオン保護アッセイ細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスとリサイクルを研究するために、

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。...

フローサイトメトリーを用いた組換えイオンチャネルの相対的な細胞表面および合計式の決意

ここでは、インビトロ神経内皮共培養システムと、一次神経幹および前駆細胞を拡張し、その表面に標識するバイオオルトホグナル機能基を持つシアログリカンの代謝組み込みを組み合わせたプロトコルです。細胞表面マーカーのイメージングまたは質量分析分析のためのサイアログリコタンパク質。...

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

この記事では、解離された一次海馬培養におけるグルタミン酸受容体(GluR)の人身売買を研究する方法を紹介する。この方法は、内因性または過剰発現受容体を薬理学的アプローチと組み合わせて標識する抗体供給アプローチを用いて、変調によってGluR表面発現を調節する分子機構の同定を可能にする。内部化またはリサイクルプロセス。...

解離された原発性海馬培養におけるグルタミン酸受容体の密売を研究するための抗体摂食アプローチ

ここでは、マウスアストロサイトにおけるオルガネラの細胞内輸送と血漿膜タンパク質の取引を可視化するインビトロライブイメージング法について述べる。このプロトコルはまた、貨物輸送の旅程と運動学を決定するための画像分析方法論を提示する。...

アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

学ぶ ビオチン化法を用いて初代星状細胞におけるAquaporin-4の細胞表面発現とエンドサイトーシス速度を測定する方法。ラミニンの影響を評価し、神経科学研究に応用可能な技術を習得する。

ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

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