ビオチン化を用いた初代星状細胞培養におけるタンパク質の細胞表面発現およびエンドサイトーシス速度の測定

このビデオでは、細胞表面のビオチン化とパルスチェイスビオチン化の2つの方法を紹介します。次のデモでは、アストロサイトを使用します。これらは脳内で最も豊富なグリア細胞タイプであり、たまたま私たちの関心のあるタンパク質であるアクアポリン-4を発現しています。

この論文で用いる方法は、浮遊細胞や接着細胞など、さまざまな細胞タイプに適用することができます。これらの技術は、ビオチンにアクセス可能な細胞外ドメインを有する限り、ほぼすべての膜貫通タンパク質の細胞表面発現と内在化の研究に使用できます。この細胞表面ビオチン化アッセイの全体的な目標は、アストロサイトの原形質膜における水透過性チャネルAquaporin-4の発現に対するラミニンの影響を明らかにすることです。

この手順を開始するには、インキュベーターからアストロサイト培養物を取り出し、吸引して培地を廃棄します。細胞を4ミリリットルの冷やしたCM-PBSで3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。CM-PBSを吸引して除去し、2ミリリットルのビオチンバッファーを各ウェルにピペットで注入します。

皿を数回ゆっくりと前後に傾けて、完全に覆われるようにしてから、培養物を氷の上に30分間置きます。その後、ビオチン緩衝液を取り出し、4ミリリットルのクエンチング緩衝液と交換し、培養物を氷上に10分間保持します。次に、吸引して同量のクエンチングバッファーと交換してから、培養物を氷上に10分間放置します。

次に、クエンチングバッファーを廃棄し、冷やしたCM-PBSの4ミリリットルで細胞を3回洗浄します。その後、細胞を1ミリリットルの冷やしたCM-PBSに掻き取り、懸濁液を微量遠心チューブに移します。次に、摂氏4度に設定された冷蔵微量遠心分離機で100gで3分間遠心分離することにより、細胞をペレット

その後、上清を捨て、細胞を500マイクロリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。次に、サンプルを氷上に30分間放置し、5分ごとにボルテックスします。その後、ライセートを14, 000gで4°Cで10分間遠心分離し、洗剤や可溶性材料をペレット化します。

次に、上清を新しい微量遠心チューブに移します。50マイクロリットルのライセートを保存し、25マイクロリットルの3つのXローディングバッファーを追加します。その後、ドライバスで摂氏95度に加熱して変性させます。

これは、ビオチン化細胞表面タンパク質と非ビオチン化細胞質タンパク質の両方を含むインプット画分です。カットしたピペットチップを使用して、75マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースビーズを溶解物に移し、シェーカーで摂氏4度で3時間インキュベートします。その後、ストレプトアビジンアガロースビーズを1,500gで4°Cで30秒間遠心分離することによりペレット化する。

上清を50マイクロリットル保存し、Xローディングバッファー3個を25マイクロリットル追加します。次に、水浴または加熱ブロックで摂氏95度で変性させます。これは細胞内画分を表し、主に非ビオチン化細胞質タンパク質で構成されています。

その後、ペレット状ビーズを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、摂氏4度で3分間揺とらいます。ビーズをペレット状にし、上清を捨てます。このプロセスをさらに4回繰り返して、非ビオチン化細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えます。

溶解バッファーを使用して、1つのXに希釈した50マイクロリットルのローディングバッファーを加えます。ビオチンとストレプトアビジンをビーズから95°Cで変性させることによりビーズから放出します。この画分には、ビオチン化細胞表面タンパク質のみが含まれている必要があります。

その後、SDS-PAGEによりインプット画分、細胞表面画分、細胞内画分を分離し、ウェスタンブロッティングにより解析します。パルスチェイスビオチン化実験の全体的な目標は、アストロサイトにおけるアクアポリン-4のおおよその内部化速度を決定することです。まず、インキュベーターからアストロサイト培養物を取り出し、培地を吸引します。

次に、冷やしたCM-PBSの4ミリリットルで細胞を3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。CM-PBSを吸引し、各皿に3ミリリットルのビオチン緩衝液をピペットで入れます。皿を前後に数回傾けて、バッファーが十分に分散されていることを確認し、30分間氷の上に置きます。

次に、ビオチン緩衝液を吸引し、5ミリリットルの温かい培地と交換します。1つの培養皿を摂氏37度で15分間インキュベートし、もう1つの培養皿を同じ温度で30分間インキュベートします。別の皿を摂氏4度にゼロ分サンプルとして残します。

インキュベーション期間の終わりに、培地を廃棄し、冷やしたCM-PBSの4ミリリットルで細胞を3回洗浄します。その後、CM-PBSを吸引し、細胞上に6ミリリットルの還元バッファーをピペットで移し、サンプルを氷上に15分間放置します。次に、培地を6ミリリットルの新鮮な還元緩衝液と交換し、サンプルをさらに15分間氷上に置きます。

還元バッファーに含まれるグルタチオンは、細胞表面に残っているビオチンマウスを切断するため、このステップは重要です。これにより、内在化されたタンパク質のみがビオチン標識されるようになります。その後、還元液を取り除き、6ミリリットルの焼入れ緩衝液と交換します。

サンプルをさらに15分間氷上に置き、クエンチングステップをもう一度繰り返します。次に、クエンチングバッファーを廃棄し、4ミリリットルの冷やしたPBSで細胞を3回洗浄します。CM-PBSを吸引し、セルリフターを使用して細胞を1ミリリットルの冷却PBSに掻き取り、懸濁液を微量遠心チューブに移します。

細胞を100 gで3分間遠心分離してペレット化します。3分後、上清を捨て、細胞を500マイクロリットルの溶解緩衝液に再懸濁します。サンプルを氷上に30分間放置し、5分ごとにボルテックスします。

ライセートを14, 000gで遠心分離し、摂氏4度で10分間、洗剤と可溶性材料をペレット化します。次に、上清を新しい微量遠心チューブに移します。このライセートを50マイクロリットル保存し、ローディングバッファーを添加します。

その後、乾燥浴中で細胞を摂氏95度で変性させます。これは、ビオチン化エンドサイトーシスタンパク質と非ビオチン化タンパク質の両方を含むインプット画分です。カットしたピペットチップを使用して、150マイクロリットルのストレプトアビジンアガロースラリーを溶解物に加え、シェーカーで摂氏4度で3時間インキュベー

3時間後、ストレプトアビジンアガロースビーズを遠心分離により、1,500gで30秒間、摂氏4度でペレット化します。ビーズを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、摂氏4度で3分間振とうします。ビーズをペレット状にし、上清を捨てます。

このプロセスをさらに4回繰り返して、非ビオチン化細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えます。次に、1,500gで30秒間遠心分離することにより、摂氏4度でビーズをペレット化します。上にある洗浄バッファーを廃棄し、1 x ローディングバッファーを 50 マイクロリットル追加します。

ビオチンとストレプトアビジンをビーズから放出し、摂氏95度で変性させます。この画分は、内在化された細胞表面タンパク質のみを含むべきである。その後、SDS-PAGEでインプット画分、細胞表面画分、非結合画分を分離し、ウェスタンブロッティングで解析します。

ここに示されているのは、未処理のアストロサイト、およびアクアポリン-4およびベータジストログリカンをプローブした24ナノモルラミニンで処理されたアストロサイトの細胞表面、細胞内、および全画分です。このヒストグラムは、未処理のアストロサイトとラミニン処理されたアストロサイトにおけるアクアポリン-4の細胞表面レベルの違いを、ベータジトログリカンに対して正規化したものです。この図では、ゼロ分、15分、および30分で収集された内在化タンパク質画分をアクアポリン-4についてプローブしました。

そして、このヒストグラムは、4つの独立した実験におけるアクアポリン-4の内在化を、ゼロ分時点の値に対して正規化してまとめたものです。アスタリスクは、15分から30分の間にエンドサイトーシスされたアクアポリン-4の量が統計的に有意に増加したことを示しています。グルタチオンを使用して切断可能なビオチンアナログのジスルフィド結合を切断すると、ビオチン化画分に対する細胞表面アクアポリン-4の寄与が急激に減少します。

その結果、0 分サンプルと 15 分サンプルの間に明確な違いが生じます。このステップを省略すると、セル表面プールから発信されるシグナルにより、2つの時点間の変化が検出されなくなります。この手順に続いて、免疫蛍光法やTIRF顕微鏡法などの他の方法を適用して、貨物の物理的な取引を含む追加の質問に答えることができます。