Name: 体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 学ぶシロイヌナズナの体外受精卵と胚のライブ細胞イメージング法。PDMSマイクロピラーアレイデバイスを用いて受精卵の極性形成と胚パターン形成の動態を可視化し、植物発生の基礎的な疑問に答える強力なツールです。

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この作品での顕微鏡で、研究所のトランスフォーマティブ生命分子 (WPI ITbM) 名古屋大学を行われ、日本高等植物科学ネットワークでサポートされています。この作品は、振興会の日本科学技術振興機構 (ERATO プロジェクト ノルウェールーテルし調印) 会からの助成金によって支えられた: 革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP24113514、JP26113710、JP15H05962、および調印、および Nos JP15H05955。JP16H06465、JP16H06464、T.H の JP16K21727)、科研費若手 (B、Nos。JP24770045 と調印の JP26840093)、科研費挑戦的萌芽研究号調印の JP16K14753)。

1 体外 胚珠培養培地の調製 <ol><li>を 体外 の胚珠培養用液体培地 (&#34; N5T 中 &#34;) 1 x Nitsch 基底塩混合物、5% (w/v) トレハロース二水和物、0.05 を含む。% (w/v) の 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)-島 (pH 5.8) 1 x Gamborg &#39; s ビタミン ソリューションです</li>。
	<li>島の 5.8 に pH を調整します</li>。
	<li>は、オートクレーブに入れることによって媒体を滅菌 (121 ° C、20 分) または、0.22 μ m フィルターをフィルタ リングします 。
	注: 滅菌媒体格納できる 4 ° C で 2 - 3ヶ月</li>。
</ol> 2。PDMS 駆動式マイクロピラー アレイ素子の作製 <ol><li>カット ナイフ、かみそりの刃または 35 mm ガラス底皿のガラスの部分 (14 mm φ) に収まるようにハサミで PDMS 駆動式マイクロピラー デバイス 。
	注: PDMS 装置建設の完全な手順は前論文 8 , 9 で説明、ここでこうして、詳細は省略します。デバイスがなくても短期的なイメージングのため 4 ウェルまたは 96 ウェルのプレートなどの小さいボリュームでガラス底培養皿を使用できます</li>。
	<li>定置滅菌 15 分の紫外線の下で PDMS 装置の上側</li>
	<li>正方形のチップ ピンセットを使用してによって PDMS 装置を切り、底を殺菌する 15 分の軽い UV の下でそれを維持します</li>。
	<li>35 mm ディッシュに滅菌の PDMS デバイスを転送し、デバイスは培地 (約 5-7 mL) で完全に浸漬されるまで N5T 培地を追加します</li>。
	<li>料理を真空チャンバーに入れて、ガスを抜き圧力を減らします。一夜にしてデバイスの空気が媒体によって置き換えられるまで 3 時間掃除機を維持します 。
	注: デバイスは、強力な真空の下で空気の泡で切り離すことが</li>。
	<li>皿から正方形のチップ ピンセットでそれを保持することによって、デバイスを取るし、サイドと下部に余分なメディアを取り出してペーパー タオルの上に置く 。
	注: これが胚珠の耕作のために使用されるため、駆動式マイクロピラー アレイ (上面) に媒体を削除しないでください</li>。
	<li>アッパー サイドとして駆動式マイクロピラーの部分を保つために確保、76 mm × 26 mm スライド ガラス上にデバイスを転送し、次の胚珠抽出中に完全に乾くことから媒体を防ぐために 35 mm の文化料理ふた付きのデバイスをカバーします</li>。
</ol> 3。Silique 郭清と胚珠抽出 <ol><li>70% エタノールで拭くことによって針 (0.40 mm G) と高級ピンセットを消毒します。針は、注射器や木の棒に接続し、簡単に処理します</li>。
	<li>は、植物の花序をチェックし、実験のための適切な siliques を選択します。約 5 mm siliques 含む受精卵と 8-10 mm siliques 若い球状胚があります</li>。
	<li>は、ピンセットを使用して、siliques を消費税し、76 × 26 mm スライド グラス上に両面テープの上に置きます。について 1 つの silique が含まれています 40 60 胚珠と 3-4 siliques (すなわち 120-240 胚珠) が 1 つのデバイスにとって十分です</li>。
	<li>は、滅菌注射針と顕微鏡下で、ピンセットを使用して胚珠を表示する silique (子房壁) を開きます。胚珠は破損していないように子房壁のみをカットします</li>。
	<li>(2.7 の手順で準備) PDMS のデバイスに N5T 中に開かれた silique を転送し、針やピンセットで媒体に胚珠をリリースします</li>。
	<li>駆動式マイクロピラー アレイ内のスペースに胚珠をプッシュする PDMS デバイス上に小さなカバー ガラス (18 mm × 18 mm) を配置します</li>。
	<li>余分なメディアを削除するピンセットや指を使用して横に引いてカバーガラスを脱ぐ</li>。
	<li>PDMS デバイスを裏返し、35 mm ガラス底皿に置き、少しガラスに固執する正方形のチップ ピンセットを使用してを押してデバイスを押し</li>。
	<li>ガラス底にそっと注ぐ N5T 媒体まで PDMS 装置は中、ずぶ濡れ中瓶をデカントで皿し、パラフィン フィルムが付いている皿をシールします 。
	注: PDMS デバイスは、リサイクルすることができますが、あまりにも古いデバイスは、ガラス底から容易に切り離します。手順 2.5 では完全に脱がないまたは媒体は余りにすぐに注がれる場合デバイスがさらに、浮かぶかもしれない</li>。
</ol> <img alt="Figure 2"class="xfigimg"src="/files/ftp_upload/55975/55975fig2.jpg"/> 図 2: 試料の概略プロシージャ 。
このフロー図は、手順 3.5 から 4.1 に対応します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig2large.jpg"target="_blank"> この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
 4 低速度撮影画像 倒立顕微鏡、3.9 ステップで準備されたガラス底皿を配置し集中する適切な胚珠をオン] <ol><li>. 。
	注: ステージ、位置、および方向で、胚珠が異なりますので適切な胚珠発見されるべき自分のマーカーの蛍光をチェックしています</li>。
	<li>は、メーカーによるとライブ イメージングを開始 &#39; 顕微鏡システムの指示 。
	注: 顕微鏡装置およびパラメーター多様であり従ってユーザーが実験目的に合った適切な設定を選択する必要があります。例として、この原稿で使用される設定は、表 1 に示す</li>。
</ol> <table border="1"fo:keep-together.within-page="1"fo:keep-with-next.within-page="always"> <tbody><tr><td>機器/設定</td> <td>図 3 (A) および補足のビデオ 1 4</td> <td>図 3 (B) および補足のビデオ 2</td> <td>補足動画 3</td></tr> <tr><td>顕微鏡</td> <td>倒立レーザー走査顕微鏡 (A1R MP)</td> <td>回転ディスク共焦点倒立顕微鏡 (CSU W1)</td> <td>ボックス型逆安定したインキュベーション室 (CV1000) と共焦点顕微鏡システム</td></tr> <tr><td>レーザー</td> <td>フェムト秒パルス レーザー</td> <td>488 nm および 561 nm の LD レーザ</td> <td>488 nm および 561 nm の LD レーザ</td></tr> <tr><td>O組込めますレンズ</td> <td>水浸対物レンズ × 40 (NA = 1.15) 浸漬媒体</td> <td>シリコーン油浸対物レンズ X 60 (NA = 1.30)、ピエゾ フォーカス ドライブにマウントされている</td> <td>40 X 対物レンズ (NA = 0.95)</td></tr> <tr><td>検出または</td> <td>外部非 descanned GaAsP PMT 検出器</td> <td>EMCCD カメラ</td> <td>EMCCD カメラ</td></tr> <tr><td>ダイクロイック ミラー</td> <td>DM495 と DM560</td> <td>DM488/561</td> <td>DM400-410/488/561</td></tr> <tr><td>フィルター</td> < td> バンドパス フィルター;534/30 nm と 578/105 nm</td> <td>バンドパス フィルター; 520/35 nm、および 593/46 nm</td> <td>バンドパス フィルター; 520/50 nm と 617/73 nm</td></tr> <tr><td>z 軸に沿ったスライス</td> <td>1 μ m 間隔で 31 z スタック</td> <td>17 z スタック 3 μ m の間ヴァルス</td> <td>5 μ m 間隔で 7 z スタック</td></tr> <tr><td>時間</td> <td>20 分</td> <td>5 分</td> <td>10 分</td></tr></tbody></table> テーブル 1:顕微鏡システム、この原稿で使用される設定します 。
顕微鏡とパラメーターは多様であり従って各ユーザーは、実験のための適切なシステムを選択してください。
<ol start="3"> <li>取得イメージ シーケンスを確認し、.avi またはプレゼンテーションに .mov などの一般的なムービー形式に変換します 。
	注: 顕微鏡のソフトウェアは、ムービー形式として、映像を出力できませんは、ImageJ、NIH イメージ、ファイルの種類を変更するに触発されたオープン ソース プログラムで開いて .tif として画像を保存することが可能。ImageJ を提供しています: https://imagej.nih.gov/ij/。ImageJ は、Z s を作るためにも使用できます。説明したように最大強度投影など、ムービーを挟む: https://imagej.net/Z-functions です</li>。
</ol>

<ol><li>Natesh, S., Rau, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatesh%2C+S+%22Embryology+of+Angiosperms%22">Embryology of Angiosperms</a>. Johri, B. M. , Springer. Berlin Heidelberg. 377-443 (1984).</li>
<li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Zygote%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li>
<li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+%28Oryza+sativa+L.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li>
<li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s004970000063">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li>
<li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00497-004-0233-9">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li>
<li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li>
<li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li>
<li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li>
<li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400513011015">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li>
<li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li>
<li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li>
<li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li>
</ol>

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本稿では、単純な体外胚珠栽培プロトコルは、受精卵や胚の開発の住セルイメージ投射で使用するため効率的を紹介します。
PDMS 装置の設計は、胚の段階に応じて最適化を必要があります。開発の最初のデバイスは microcage 配列方向を調整し、胚珠9の位置を修正してより効率的に胚珠をトラップし、駆動式マイクロピラー デバイスを構築しました8。さらに、マイクロピラーも細くて、microcage よりも柔らかい、従って長期観察中に胚珠拡張を妨げません。この駆動式マイクロピラー デバイスは、胚の心臓原基ステージ8までココヤシの段階からの数日間、胚珠を保持できます。最終的には、ただし、完全に展開された胚珠の高さを超える駆動式マイクロピラー高さ、従ってそれは先のデバイスをプッシュします。したがって、高さや、マイクロピラーの間隔は、後で胚がフォーカス場合に調整必要があります。
胚珠は...

単細胞受精卵から有機体の基本的なボディ計画を開発します。ほとんどの顕花植物のココヤシ部門は、樹状突起と撮影やルート、1それぞれに発展する基底のセルを生成します。したがって、胚発生に伴う植物体を形成する方法を理解することが重要だが、彼らは花に深く成長するのでリビング受精および胚のダイナミクスを直接観測する効果的なツールをされていません。トウモロコシ、米などのいくつかの単子葉種体外受精法は確立された2,3をされています。この方法では分離精子と卵細胞を電気的または化学的に、融合し、生成されたセル、肥沃な工場に開発。ただし、双子葉植物植物の雄性と雌性の配偶子の4、5の細胞周期の非同期状態のためおそらく適切な胚を作り出すことができる体外受精法ではありません。さらに、胚周囲組織 (胚乳) は、胚の開発6で重要な役割を果たしています。
モデルの双子葉植物の種、シロイヌナズナ、体外の栽培方法は、胚と胚乳の7を含む全体の胚珠に焦点を当てによって開発されました。このシステムは正常に様々 な化学試薬の胚発生に及ぼすを分析に使用されたが、低い生存率をもっているため時間経過イメージ投射のため適していません。そこで、新規培養胚珠の栽培システムは、受精卵の段階として早期に開始高比8で肥沃な植物を生成するために開発されました。様々 な試験後 Nitsch 培地が分かったし、トレハロースが胚珠8の生存率を大幅に向上します。さらに、胚珠の展開としては成長して、従って頻繁に顕微鏡の観察フィールドから移動、ために、9の中の胚珠を修正する PDMS 装置が開発されました。PDMS デバイスは、心期胚には受精卵から開発をトレースするのに十分である 3-4 日間の長期的なイメージングが有効になります。このメソッドを使用して、それは偏波受精卵・胚のパターンだけでなく通常の条件下でも低分子阻害剤の存在下でまたは様々 な突然変異体の背景8,10 のダイナミクスを可視化することが可能になります。 ,11。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
図 1: 視覚化受精し胚を胚珠を使用特定の蛍光マーカーの模式図。 シロイヌナズナの受精卵は、花の奥深くに生成される胚珠の胚に開発しています。体外培養システム、受精卵・胚胚珠、観察、従って他の胚珠組織で表されない特定の蛍光マーカーを使用することが重要です。 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>ニッチュ基礎塩混合物</td><td>デュチェファ</td><td>N0223</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース二水和物</td>和<td>光純薬</td><td>206-18455</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>同人堂</td><td>345-01625</td><td></td></tr>ガン<tr><td>ボルグビタミン剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1019</td><td></td></tr><tr><td>35mmガラス底皿</td><td>松波ガラス</td><td>D111300</td><td></td></tr><tr><td>35mm培養皿</td><td>コーニング</td><td>430588</td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning Co.</td><td>Sylgard184</td><td></td></tr><tr><td>76 &times; 26 mm スライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>S1225</td><td></td></tr><tr><td>18 &times; 18 mm スライドガラス</td><td>松波ガラス</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>針 (ゲージ 0.40 mm)</td> <td>テルモ</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>液浸中 Immersol W 2010</td><td>Zeiss</td><td>444969-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>A1R MP</td><td>Nikon</td><td>A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1</td><td>横河電機</td><td></td>製 <td>カスタマイズ機器ですので、カタログ番号はご利用いただけません。</td></tr><tr><td>CV1000</td><td>横河電機</td><td>CV1000-SP84</td><td></td></tr></tbody></table>

体外受精卵の live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

ほとんどの顕花植物の受精および胚は母組織の奥深くに隠されて、従ってそれは長年どのように彼らを動的に開発の謎たとえば、どのように受精は体軸や器官形成の時に胚が様々 な細胞運命を指定する方法を確立する分極します。本稿では、受精とシロイヌナズナの胚の開発の住セルイメージ投射を実行する胚珠体外培養法について説明します。最適化された培地では、受精卵や初期胚肥沃な植物に成長することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 駆動式マイクロピラー アレイ デバイスと組み合わせて、胚珠は同じ位置に液体培地で開催されます。この固定は、ココヤシの部門から数日間胚後期に顕微鏡下で同じ胚珠を観察することが重要です。結果住セルイメージ投射を使用して核移行と細胞骨格の再編とも細胞分裂のタイミングや胚パターン形成時の細胞運命仕様など、受精卵の偏波の実時間ダイナミクスを監視できます。さらに、胚発育に及ぼす諸因子の影響を分析する阻害剤治療と細胞間コミュニケーションの役割を調べるレーザー破壊などの光の操作は、この胚珠培養システムを結合できます。

このメソッドはこの胚珠培養システムを用いた偏波受精卵・胚パターン形成生活動態をトレースできます。これは、以前母親組織に深く隠されている受精卵及び胚のリアルタイム挙動を可視化する技術がなかったので成果です。図 3 aと補足のビデオ 1若い受精卵における微小管 (MTs) 穎地域10の横のリングとして蓄積する可能性を示しています。受精は根尖方向に伸長しながら、この MT リングが維持されます。受精卵の伸長および根尖部を核移行完了後 MT リングが消え、MTs を形成する DNA を分離するスピンドル。図 3Bと補足のビデオ 2胚性細胞が放射状に対称な球状形8を形成する協調分割を表示します。このメソッドは、薬理学的実験のために適用されます。たとえば、アクチン重合阻害剤 (latrunculin B ...

本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

本手順の全体的な目的は、シロイヌナズナの接合子および胚のライブセルイメージングを可能にし、胚発生のダイナミクスを可視化することです。この手法は、接合子の非対称性や胚の形態がどのように形成されるかという、植物発達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。本技術の主な利点は、接合子の極性化および胚のパターニングという生きたダイナミクスを追跡できることです。マイクロピラーデバイスを用いた準備および胚珠の取り扱いは、テキストのみでは説明が困難であるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要です。PDMSマイクロピラーアレイデバイスを準備するには、まずデバイスを35 mmのガラス底ディッシュに適合するサイズに切り出し、デバイスの上面と底面をそれぞれ15分間のUV照射で滅菌します。すべての面の滅菌が完了したら、PDMSデバイスを新しい35 mmの培養ディッシュに移し、デバイスが完全に浸るまで5～7 mLの新鮮なN5T培地をディッシュに加えます。次に、ディッシュを真空チャンバーに入れ、デバイス内のすべての空気が培地と入れ替わるまで減圧して真空状態に置きます。デバイスの脱気が完了したら、角型のチップピンセットを使用して、デバイスをペーパータオルの上に軽く当て、側面と底面から過剰な培地を取り除きます。その後、デバイスを76 x 26 mmのスライドグラス上に置き、デバイスの水分を保持するために35 mmの培養ディッシュ用蓋で覆います。解剖を開始する前に、0.40 millimeterゲージの針と微小ピンセットを70% ethanolで滅菌します。次に、実験に適したしし（silique）を選択するため、植物の花序を確認します。約5 millimeterのししには接合子が、8から10 millimeterのししには初期の球状胚が含まれています。ピンセットを使用して、目的の長角果を3〜4個、76×26 mmのスライドガラス上の両面テープに転写します。次に、スライドを実体顕微鏡下に移動させ、針とピンセットを用いて子房壁を開きます。開いた長角果をPDMSデバイスのマイクロピラーアレイ上に転写し、胚珠を培地中に放出させます。次に、18 by 18 mmのカバーガラスをデバイスの上に置き、胚珠をマイクロピラーアレイの隙間に押し込みます。胚珠が定位置に収まったら、ピンセットまたは指でカバーガラスを水平に引き抜いて余分な培地を除去し、デバイスを逆さまにして新しい35 mmのガラスボトムディッシュに入れます。スクエアピンセットの先端を用いてデバイスをディッシュの底に軽く押し付け、デバイスが完全に浸るまで新しいN5T培地をディッシュに注ぎます。その後、ディッシュをパラフィルムで密封します。胚珠のタイムラプスイメージングを行うには、ディッシュを倒立顕微鏡のステージ上に移動させ、マーカー蛍光を用いてイメージング対象となる胚珠を選択します。最適な胚珠が特定されたら、メーカーの推奨に従ってサンプルのライブイメージングを開始します。この胚珠培養システムにより、接合子の極性化と胚のパターニングの生体内ダイナミクスを追跡することが可能です。例えば、微小管が横方向のリング状に蓄積し、それに続いて紡錘体へと形成される様子を観察できます。その後、胚細胞が四分的に分裂し、放射対称の球状を形成します。しかしながら、培養胚珠をアクチン重合阻害剤で処理すると、極核の移動が抑制され、接合子の分裂がより対称的になることから、接合子の極性形成においてアクチンフィラメントが役割を担っていることが示唆されます。この手法を習得し、適切に実施すれば、2時間で完了させることができます。本手順に続き、レーザー破壊を行うことで、胚のパターニングにおける細胞間コミュニケーションの役割について、さらなる疑問を検討することが可能です。このビデオを視聴することで、胚発生におけるタイトイベントを視覚化する方法について深く理解することができます。

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JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、気孔の分化を文書化、開発の数日間にわたって表皮の共焦点イメージングのための植物の子葉を固定化するためにチャンバースライドやメディアを使用してプロトコルを記述します。フルオロフォアタグ付きタンパク質は、細胞分裂や細胞型分化の過程でそれらの可能な役割の理解を深め、表現と細胞内局在によって動的に追跡することができます。...

の長期、高分解能共焦点タイムラプスイメージング<em&gt;シロイヌナズナ子葉</em発芽過程&gt;表皮

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から初期段階の胚の効率的かつ迅速な単離<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;種子

私たちは、免疫染色、蛍光in situハイブリダイゼーション 、ホールマウントシロイヌナズナ胚珠の量的、高分解能イメージングに続いてDNA染色のためにここに効率的で信頼性の高いプロトコルを提供する。この方法は、正常なクロマチン修飾および核構造を分析するために使用した。...

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&gt;jove_content&lt;細胞小器官や他の細胞内構造の動的挙動をin...

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

学ぶシロイヌナズナの体外受精卵と胚のライブ細胞イメージング法。PDMSマイクロピラーアレイデバイスを用いて受精卵の極性形成と胚パターン形成の動態を可視化し、植物発生の基礎的な疑問に答える強力なツールです。

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

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