ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロジェクトはサポート部分でジョンズ ・ ホプキンス大学で憲兵のオフィスによって、ゲートウェイ科学イニシアティブ。

注: メタゲノム DNA 市販土壌ゲノム分離を用いた土壌 (ボルティモア郡、メリーランド州) 精製キット (材料の表を参照してください)。紫外線分光光度計を使用して (材料の表を参照)、精製した DNA は 260/280 (nm) の比率を持つ必要があります &#62; 1.8 と 2.0 から 2.2 サンプル確実に比 260/230 汚染物質の無料です。200 NS の範囲に必要な DNA 量 2 μ g に ng。
1. 急な図書館調製法 (短いプロトコル)
注: これは短いプロトコルです。急速なシーケンス キットの材料表を参照してください。
<ol>
	<li>薄肉円管 (材料表参照) 200 を追加 0.2 mL の蒸留水の 7.5 μ L のボリュームの決勝での高分子量 DNA の ng。</li>
	<li>急な図書館準備キットとミックスから優しくインバージョンによる断片化ミックス (FM) の 2.5 μ L を追加します。スピンダウンするパルス遠心分離機 (1,000 x g 5 s)。</li>
	<li>たちにサンプルを配置 (材料の表を参照してください) 30 ° c 1 分後 75 ° C で 1 分間に 1 回の試料のスピンダウンにチューブとパルスの遠心分離機を削除します。</li>
	<li>急速なアダプターの 1 μ L と鈍/TA リガーゼ マスター ミックスの 0.2 μ L を追加し、氷の上適応と連結ライブラリを格納します。 注: 場合は、手順 8 に進みます短いプロトコルを使用して</li>
</ol>
2. 結紮シーケンス プロトコル (長い): メタゲノム DNA 断片化
注: は、結紮シーケンス キットの材料表を参照してください。
<ol>
	<li>46 μ L の脱イオン水での最終巻に浄化された DNA の 1 μ g を希釈します。</li>
	<li>転送 DNA 断片化するサンプル (材料の表を参照) を管、室温遠心機を使用して 8,000 × g で 1 分間遠心 (材料の表を参照) ~ 8 kb のゲノム断片を生成します。すべての液体のコレクションの管に渡されていることを確認します。</li>
	<li>断片化管、遠心分離機、下院に断片化したゲノム DNA を収集するために 1 分間遠心して戻り値を反転します。</li>
	<li>無菌低 DNA 結合 1.5 mL チューブに断片化したゲノム DNA を転送および分析して断片化を確認する割合が低い agarose のゲル (0.6%) の部分 &#62; 30 kb です。</li>
</ol>
3. 断片化 DNA 終わり準備
<ol>
	<li>800 を使用して 45 μ L の脱イオン水で断片化したゲノム DNA の ng 追加 7 μ L 終わり準備反応バッファー (材料の表を参照)、3 μ L の酵素ミックス (材料の表を参照)、およびヌクレアーゼ フリー水 5 μ。</li>
	<li>反転とパルスの遠心分離機によるミックス (1,000 x g 5 s)。</li>
	<li>0.2 mL 薄肉の管にサンプルを転送し、5 分の 65 ° c で 20 の ° C で 5 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>パルス遠心管の底に内容をもたらす。</li>
	<li>1.5 mL 低 DNA 結合遠心チューブにサンプルを転送します。</li>
	<li>磁気ビーズ (材料の表を参照) を準備します。ピペッティングで終わり準備反応にステップ 3.5 ミックスからの再懸濁のビーズの 60 μ L を追加します。</li>
	<li>室温で 5 分間 100 rpm (材料の表を参照) で回転ミキサーに孵化させなさい。</li>
	<li>パルスは、磁石の横にサンプルを配置し、ビーズ、ペレットにサンプルを遠心分離機します。</li>
	<li>ビーズは磁石に付着した、かつての上澄みと破棄をピペットします。</li>
	<li>作りたての 70% エタノール 200 μ L で磁石と洗浄のビーズからチューブを削除するには、サンプルの上下を軽くピペッティングします。</li>
	<li>パルス遠心するビーズをペレットし、磁石に戻ります。</li>
	<li>上澄みを除去し、破棄します。200 μ L の 70% のエタノールを使用して洗浄手順を繰り返します。</li>
	<li>パルスは磁石にリターン チューブを遠心し、すべての 70% エタノール洗浄を削除します。</li>
	<li>遠心チューブのふたが開いたら、室温で 5 分間乾燥空気にビーズを許可します。</li>
	<li>磁石からチューブを外し、滅菌、ヌクレアーゼ フリー水の 31 μ L でペレットを中断します。常温で 2 分間インキュベートします。</li>
	<li>すべてのビーズ、ペレット、溶出液がクリアまでチューブを磁石に戻ります。</li>
	<li>溶出液を 1.5 mL 遠心チューブに転送します。260 紫外線分光光度計を使用して端準備中の DNA の定量化 1 μ L のサンプルを使用して nm (材料の表を参照してください)。 注: パーセント回復 〜 70% をする必要があります (700 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。</li>
</ol>
4. アダプターとテザーに加えて、終了準備のゲノム DNA のフラグメント
<ol>
	<li>反転してすべての鈍/TA リガーゼ マスター ミックス チューブをミックスし、下部に内容をもたらすに遠心分離機をパルスします。</li>
	<li>DNA の端準備中の 30 μ L を使用すると、アダプターのミックスの 20 μ L と鈍/TA 結紮マスター ミックスの 50 μ L を追加します。</li>
	<li>パルスの遠心分離機、反転してミックスし、室温で 10 分間インキュベートします。</li>
</ol>
5. 磁気Bead の準備
<ol>
	<li>渦ビーズと 1.5 mL および microfuge に中断されたビーズの転送 50 μ 管します。</li>
	<li>溶出液をクリアするまでビーズをペレットに磁石にチューブを置きます。</li>
	<li>上澄みを除去し、破棄します。</li>
	<li>ビーズ結合バッファーを 100 μ l 添加ビーズ、ビーズ、再懸濁しますに渦に磁石のビーズをペレット、上澄みを除去し、破棄 (ビーズ キットの材料表を参照してください)。100 μ L の結合バッファーで洗浄を繰り返します。</li>
	<li>洗浄のビーズにビーズ結合バッファーの 100 μ L を追加します。渦にビードを再停止しなさい。</li>
</ol>
6. ライブラリの浄化
<ol>
	<li>P200 ピペットを使用して、適応テザーのゲノム DNA を前の手順からビーズの 40 μ L を追加します。ピペッティングで慎重にこのサンプルをミックスします。</li>
	<li>室温で 5 分間で 100 rpm 回転ミキサーでサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>磁石にサンプルを置き、解決するビーズを許可します。上澄みをピペットおよび破棄します。</li>
	<li>ピペッティングでビーズ結合バッファーの 140 μ L でビーズを再懸濁します。磁石に対してサンプルを置き、上澄みを廃棄ビーズ結合バッファーの 140 μ L 別でもう一度洗います。</li>
	<li>パルスは、チューブを遠心分離機、2 分ペレットから残りのビーズ結合バッファーを削除するため、磁石にチューブを配置します。</li>
</ol>
7. マグネット ビーズからライブラリの溶出
<ol>
	<li>磁気ビーズは、ピペッティングにより 15 μ L の溶出バッファーで再懸濁します。室温で 10 分間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>ビーズをペレットに磁石に対してチューブを配置します。</li></ol>ソリューションをクリアしたとき 15 μ L の溶出液と 1.5 の mL および microfuge の管への転送を削除し、氷の上、サンプルを置きます。
	<li>紫外線分光光度計を使用してライブラリを定量化します。 注: パーセント回復必要があります 〜 25% (250 ng) 1 μ g の DNA の開始の集中から。</li>

8. 実行/品質管理を開始
<ol>
	<li>包装からフローセルを取り外し、ポータブル、リアルタイムのシーケンサーにフローセルを取り付けます (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>USB ケーブル経由でコンピューターにシーケンサーを接続し、起動シーケンス ソフトウェア (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>シーケンス ソフトウェアを介してデバイスを「接続」をクリックして、"NC_Platform_QC.py"を選択し、「スタート」をクリックします。</li>
	<li>品質管理 (QC) は完了する約 6-7 分緑の海の見える (出力の領域が大きい) QC 読み出し十分なアクティブな毛穴があることを確認するために (&#62; 800) DNA シークエンシングのため。</li>
</ol>
9. シーケンス実行の開始
<ol>
	<li>シーケンス プログラムを開くダイアログ ボックスが表示されます。[サンプル ID] ボックスで、名前のサンプルを実行します。</li>
	<li>"フロー セル ID"ボックスをクリックし、フロー ・ セルの上にステッカーに記載のコードを入力します。</li>
	<li>フロー電池蓋を開くし、サンプル ポート カバーを右にスライドさせて (時計回りに) してサンプル ポートが表示されます。一度のポートが開いて、小さなバブルをチェックしてください。バブルを含むバッファーの数マイクロリットルを削除します。</li>
	<li>センサー アレイ全体のバッファーがあることを確認します。バッファーを搭載した燃料ミックスの 480 μ L を混合することによってプライミング バッファーを作る (RBF-1、材料の表を参照してください) (ミックス必ず徹底的に最初) 520 μ L ヌクレアーゼ フリー水で。</li>
	<li>プライミング ポートにプライミング バッファーの 800 μ L を追加します。慎重にアクセスできるように「生き残る」カバーを持ち上げます。</li>
	<li>5 分後プライミング ポートにプライミング バッファーの追加 200 μ L を追加します。</li>
</ol>
10. ライブラリの読み込み
<ol>
	<li>ライブラリの場所に氷の上次の試薬を準備する前に: RBF-1 シーケンス キット) (から適応し、ライブラリ、およびライブラリのロードのビーズをつないだ (LLB; シーケンス キットから)。</li>
	<li>0.2 mL の遠心管に RBF の 25.5 μ L と部屋の温度で保たれるヌクレアーゼ フリー水の 12 μ L を追加します。</li>
	<li>上下ピペッティングで LLB をミックスします。0.2 μ L チューブに LLB の 26.5 μ L を追加します。上下ピペッティングによる試薬を混ぜます。 注: LLB は、混合物の解決する傾向があります。</li>
	<li>0.2 μ L 管に適応し、つなぎ縄でつながれた図書館の 11 μ L を追加します。パルス遠心分離によって反転してスピン ミックスします。</li>
	<li>9.4 のステップからの 75 μ L のサンプルを「生き残る」ポートに滴下し追加します。各ドロップは、次を追加する前にポートに流れていることを確認します。</li>
	<li>慎重に、栓が入港できるようにサンプル ポート カバーを取り付けて、デバイスふた。</li>
</ol>
11. シーケンス ソフトウェア プロトコル スクリプトを開始
<ol>
	<li>「プログラムの選択」下のドロップ ダウン メニューを開き、「48 時間シーケンス」を選択</li>
	<li>スクリプトを起動する「実行」ボタンをクリックします。</li>
	<li>MUX をスキャンでアクティブな毛穴の数の通知ストリームで報告Mux のスキャンの結果を確認します。 注: この数は実行 QC で毛穴の数から異なる場合があり、大きな違いは、問題を示すことがあります。<ol>
		<li>ある場合 QC 実行からアクティブな毛穴の大幅な削減はソフトウェアを再起動し、有意な差がある場合は、コンピューターを再起動します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>シーケンス ソフトウェア スクリプトによって報告されるよう、ヒートシンク温度が 34 ° C であることを確認します。 注: 温度は 34 ° C でない場合、あるされません実行十分なアクティブな毛穴です。</li>
	<li>シーケンスの長さが予想されると実験的なデザインの適切なかどうかを判断する読み取りの長さのヒストグラムを確認してください。</li>
	<li>'近くに ' 終了シーケンス ソフトウェア web GUI を閉鎖を使用してデスクトップのエージェントを閉じます。コンピューターからデバイスを取り外します。</li>
</ol>
12. 実行と結果の解析
注: シーケンスの実行中にデータを監視できますデスクトップ エージェントを使用して、「レポートの表示」プログラムを使用しています。中に実行が完了すると、ファイル、ファイル形式でデータ → 読み取り → フォルダー (既定値) を渡す FAST5 で使用できますか。シーケンスがアクティブな間、このフォルダーが開いている場合、コンピューターがフリーズします。
<ol>
	<li>表示し、シーケンスを操作するには、"HDFViewer"をダウンロードします。</li>
	<li>シーケンス ファイルを表示するには、直接開いて HDF ビューアー → オープン データ フォルダー → 選択すべてのファイルの種類 → 選択 c: ドライブ (デフォルト) → 選択 → 選択読み取り → 選択渡す。</li>
	<li>検索して左のドロップ ダウン メニューに FASTQ ファイルを選択ファイルが開き、FASTQ 形式で保存することができます。 注: 学生実験の目的のため、以上 350 ヌクレオチドのシーケンスは、さらに分析に選ばれました。基本の呼び出しからの出力では、サイズに基づいてシーケンス リードを並べ替えできます。ブラスト (NCBI) やその他の生物情報学プログラムを介して FASTQ ファイルを分析できます。</li>
</ol>

<ol><li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time%2C+portable+genome+sequencing+for+Ebola+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Real-time, portable genome sequencing for Ebola surveillance.</a> Nature. 530 (7589), 228-232 (2016).</li>
<li>Greninger, A. L., et al. <a target="_blank" href="https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-015-0220-9">Rapid metagenomics identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis.</a> Genome Med. 7, 99(2015).</li>
<li>Quick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+draft+sequencing+and+real-time+nanopore+sequencing+in+a+hospital+outbreak+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid draft sequencing and real-time nanopore sequencing in a hospital outbreak of Salmonella.</a> Genome Biology. 16, 114(2015).</li>
<li>Ashton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MinION+nanopore+sequencing+identifies+the+position+and+structure+of+a+bacterial+antibiotic+resistance+island%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MinION nanopore sequencing identifies the position and structure of a bacterial antibiotic resistance island.</a> Nat Biotechnol. 33, 296-300 (2015).</li>
<li>Loman, N. J., Quick, J., Simpson, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+bacterial+genome+assembled+de+novo.+using+only+nanopore+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">A complete bacterial genome assembled de novo. using only nanopore sequencing data.</a> Nat Method. 12, 733-735 (2015).</li>
<li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+Sequencing+as+a+Rapidly+Deployable+Outbreak+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Nanopore Sequencing as a Rapidly Deployable Outbreak Tool.</a> Emerg Infect Dis. 22 (2), 331-334 (2016).</li>
<li>Petrosino, J. F., Highlander, S., Luna, R. A., Gibbs, R. A., Versalovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+pyrosequencing+and+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Metagenomic pyrosequencing and microbial identification.</a> Clin Chem. 55 (5), 856-866 (2009).</li>
<li>Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+for+Microbial+Identification+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization.</a> J. Vis. Exp. (78), e50405(2013).</li>
<li>Rothberg, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v475/n7356/full/nature10242.html?foxtrotcallback=true">An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing.</a> Nature. 475, 348-352 (2011).</li>
<li>Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zero-mode+Waveguides+for+Single-Molecule+Analysis+at+high+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Zero-mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations.</a> Science. 299, 682-686 (2003).</li>
<li>Eid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+DNA+Sequencing+from+Single+Polymerase+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules.</a> Science. 323, 133-138 (2009).</li>
<li>Stoddart, D., Heron, A. J., Mikhailova, E., Maglia, G., Bayley, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide+discrimination+in+immobilized+DNA+oligonucleotides+with+a+biological+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide discrimination in immobilized DNA oligonucleotides with a biological nanopore.</a> PNAS. 106, 7702-7707 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Hanlee, J. Next generation DNA sequencing. Nat Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Daniel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metagenomics+of+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Metagenomics of Soil.</a> Nat Rev Microbiol. 3, 470-478 (2005).</li>
</ol>

著者の開示があります。

多くの次世代シーケンシング メソッドが生成されている、合成によるシーケンスに依存する各ヌクレオチドを識別する検出プラットフォームごとに異なります。NS、市場に最近加わったまたは標識ヌクレオチド シーケンス反応を必要としない完全に別の方法を使用します。このメソッドは、電化の細孔を通過するときに既に組み込まれたヌクレオチドの料金差の利点を受け取ります。各ヌクレオチドの同定、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の変調と発生します。この多重化システムでは、一度に多くの断片をシーケンス処理することができます。DNA の両方の鎖を配列することによってシーケンスの精度は大幅に向上し、シーケンス ソフトウェアは、ラップトップ コンピューターに読み込むことができます、信号を処理し、分析することができますシーケンス情報を提供します。
パイロシークエンス、合成 (SBS) 法によるシーケンス テンプレートに組み込まれて特定の塩基の検出はルシフェラーゼ アッセイと化学発光シグナル8世代に依存します。イオン半導体シーケンスで pH が減少リリースの水素イオンはイオン センサー9によって検出されます。1 分子リアルタイム ・ シーケンシング機能はゼロ モード波ガイド (ZMW)10、法人のヌクレオチドにタグ付きの蛍光分子を検出の照らすに依存します。SBS では、ユニークなメソッドを使用して、一意のシーケンスのクラスターが生成された13ターゲット DNA を増幅します。タグのヌクレオチドの蛍光が記録されたとき、追加されたヌクレオチドの検知が可能します。NS その一方では、他の方法に比べてユニークな利点それ限られた技術的な資源を必要とするポータブル、長いシーケンスの読み取りを生成、事前の DNA 増幅を必要としない、他の方法と比較して低コストで運営することができます。生徒たちは、新しい、急速なライブラリ準備プロトコルが単純で、3 時間授業を受けやすいを発見しました。私たちの問題のいくつかがのフロー ・ セルで泡を削除することは困難であった、重要なコンピューターの電源 (1 テラバイトのストレージ) が必要なデータの現在の出力は、FAST5 ファイル、シーケンス フロー ・ セルがそれの前に限られた棚の生活低下します。さらに、NS の Ligation のシーケンス プロトコル (長いプロトコル) の他の不利な点はそれいくつかのライブラリの準備手順が必要です、分子生物学の技術の専門知識を必要とする、いくつかと比較してときに減らされたシーケンス再現性を生成します配列方法論3。ただし、新しい急速なライブラリの準備キットの最近の進歩はライブラリの準備のため 10 分のみを必要とし、減らされたシーケンス エラー率を示しています。新しいライブラリの製法だった演習クラスでの使用に非常に従う義務があります。
フロー ・ セルの QC で特にプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。これは初期の QC を実行するフロー ・ セルの受領後 5 日以内、8 週間以内にそれらを使用して含まれています。8 週を超えていたフローセルを使用しているが、オープン/アクティブ毛穴の数は大幅に削減されます。流れ細胞を最大限に活用を実現して、タイムラインに合わせて実験を計画することが重要です。洗浄のプロトコルを使用し、成功を収めてフローセルを再利用しました。
土壌微生物の多様性の未開発の遺伝的貯留層を表すメタゲノムを調査しています。たとえば、土壌 1 グラムが 10 間で含んでいると推定される7 - 109原核細胞14。また、土の有機体、新規天然、酵素や抗生物質の主な情報源です。したがって、土壌メタゲノム DNA シーケンス解析は、教育のすべてのレベルで学生のための貴重な教育ツールを表します。NS の技術の使いやすさと低コストをこのシステムの非常に効果的な教育ツールです。学生が環境試料のシーケンスし、シーケンスの完了時に利用可能なバイオインフォマティクスのツールを使用して識別し、検体中の微生物とメタゲノム シーケンスを特徴付けます。NS テクノロジーを使用して、学生があるまで今のうちに到達している実験室のコースで使用する高度な技術的専門知識と他のシーケンスのプラットフォームで試薬、機器、およびメンテナンスはコスト高のため真の実践的な経験。最近、(j. ハリソン、パーソナル通信) 私達の生徒の一人は農耕地土壌の環境モニタリング プロジェクトでこの技術の使用を報告しました。教育空間のこの技術の多くのアプリケーションがあることを見込んでいます。

この手順の目的は、シーケンス、ナノポア フロー セル シーケンス デバイスの使用率の環境 DNA ライブラリの準備のために必要な手順を示すとシステム ソフトウェアを使用して生成された DNA シーケンスの解析を実行して土壌中の微生物の種を識別するために国立センター生物工学情報 (NCBI) のバイオインフォマティクス ツール。現在、ほとんどの DNA シーケンスのプラットフォーム技術トレーニングとリソース劣悪環境やフィールド アプリケーションで実現されていない複雑な計測に多大な投資が必要です。ナノ細孔シーケンシング (NS) プラットフォームのコスト、これらの問題を排除簡単にライブラリの準備のプロトコル、およびポータブル デバイスを使用してシーケンスおよび様々 な核酸1,3のさまざまな種類を分析します。修士課程の学生のいくつかの実験室のクラスに NS プラットフォームを組み込みました。
シーケンス生体分子のナノ細孔技術は、細菌やウイルスの病原体1,2,6, 環境生物多様性の識別を含む生命科学の広いアプリケーションを示しています。研究、食品の安全性の監視、ゲノム解析3,5、および細菌の抗生物質耐性4の評価。NS が基づいている主義「シーケンスの繊維」は電気の中断を検出することにより個々 のヌクレオチド塩基の配列によって、電化に挿入されたナノポアを通過する単一鎖 DNA シーケンス核酸を高速かつ正確な方法合成高分子膜。NS、ゲノム断片化、最後修理およびゲノム断片、アダプターとテザー アニーリング dna の 3' dA-テーリングのため DNA の準備手順 DNA ライブラリ精製とナノポア流れ携帯デバイスにライブラリを読み込みます。〜 8 kb のサイズにゲノムの断片化を実現するには、g 管断片化管を通してゲノム DNA の 1-2 μ g を遠心分離します。断片化したゲノムの端は修復し、市販のキットを使用してポリ dA と尾を持ちます。ナノポア モータータンパク質と互換性のある、単一の孤立したアダプターのシーケンスが追加されます (図 1) ナノ細孔を介して DNA シーケンスをガイドに使用される DNA の両端に。テザーのシーケンスは、DNA の浄化および細孔膜への DNA の分子をローカライズするために必要。ヘアピンは、dA 尾ライブラリの 1 つの端にヘアピン アダプターを縛ることによって生成されます。DNA の両端にヘアピン構造 (図 2) ナノポアを通過する DNA センスとアンチセンス鎖の読むことができます。準備のゲノム ライブラリーは、ナノポア フローセル分析のためにサンプルをロードすることによってその後磁場を用いたストレプトアビジン ビーズを用いた反応から浄化されます。
シーケンスの DNA が品質評価し、分析に適した配列読み取り微生物を識別するためにいくつかのバイオインフォマティクスのツールを受けます。シーケンスは、FAST5 形式から FASTQ に「翻訳」。FASTQ 形式でシーケンスを高炉解析で使用できます。

<table><tbody><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>LifeECO</td><td>BTC42096</td><td></td></tr><tr><td>Covaris g-TUBE</td><td>Covaris 520079</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBNext End Repair Module</td><td>New England BioLab</td><td>E7546</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td></td></tr><tr><td>NEB Blunt/TA Ligase Master Mix</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>MyOne C1ストレパビジンビーズ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>65001</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ微量遠心機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td>モデル5420</td></tr><tr><td>ナノドロップ UV分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ND-2000</td><td>モデル2000</td></tr><tr><td>ベリーダンサー オービタルシェイカー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z768499</td><td></td></tr><tr><td>パワー 土壌DNA分離キット</td><td>MO BIO</td><td>12888-50</td><td></td></tr><tr><td>ライゲーションシーケンシングキット 2D</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-LSK208</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Sequencing Kit for Genomic</td> DNA <td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td></td></tr><tr><td>End-Prep Reaction Buffer and enzyme mix (NEB Blunt/TA Ligase Naster Mix)</td><td>New England BioLab</td><td>MO367</td><td></td></tr><tr><td>AmPure XP Magnetic</td><td>Beads ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>ベーシックスターターパック&nbsp;</td><td>オックスフォード・ナノポア&nbsp;</td><td></td><td>MinION&nbsp;シーケンシングデバイスおよびフローセル</td></tr><tr><td>MinKNOWソフトウェア</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲノムDNA用ラピッドシーケンシングキット</td><td>Oxford Nanopore&nbsp;</td><td>SQK-RAD002</td><td>には、燃料付きランニングバッファ(RBF)、フラグメンテーションミックス(FRM)、ラピッドアダプタ(RAD)、ライブラリローディングビーズ(LLB)が含まれています</td></tr></tbody></table>

ナノポア dna シーケンス メタゲノム土壌分析用

Nanopore DNA Sequencing for Metagenomic Soil Analysis

土壌、調製とナノ細孔のフロー ・ セルの使用およびコンピュータ ・ ソフトウェアを使用して特定の DNA 配列の解析から DNA ライブラリの構築のための手順について説明します。ナノ細孔中の DNA の配列は、細菌やウイルスの種を識別するために急速な微生物ゲノム細菌の緊張の特徴に、抗生物質への耐性を付与する遺伝子の突然変異を検出することができます柔軟な手法です。ナノポア ライフ サイエンス (NS) を配列の利点には、低複雑さ、コストの削減、およびゲノム DNA の精製、PCR 産物、cDNA サンプル、または RNA の迅速なリアルタイム ・ シーケンシング機能があります。NS は、合成高分子系膜に挿入されているナノ細孔を通して単一鎖 DNA の分子を導くことによって DNA シーケンスを含む「鎖シーケンス"の例です。膜を有する個々 の拠点、ナノポアを通過する電流は 4 つのヌクレオチドの塩基によって程度に破壊されるので、それを渡って適用される電流。各ヌクレオチドの同定は、ナノポアを通過するとき、異なる拠点で電流の特徴的な変調を検出することにより発生します。USB 電源ポータブル デバイス、ナノ細孔アレイを含む使い捨てフローセル、NS システムは、ハンドヘルド機の成っています。ポータブル デバイスは読み込み、コンピューターのソフトウェアを使用して DNA のシーケンスを記録する標準的なラップトップ コンピューターに差し込みます。

実験の設計とナノ細孔技術土壌 DNA シーケンス処理する学生のため高速かつ安価な方法を提供します。代表的な実行は、800 以上孔シーケンスに使用可能な品質管理パラメーターを渡されます。5.38 kb の中央値のシーケンスの長さと研究利用可能以上 125,000 の読み取り実行となりました。シーケンスは、品質スコアを与えられているし、許容可能なスコアを持つシーケンスのみを行ったし。シーケンスの出力として反応は FAST5 形式、シーケンスはシーケンスを高炉解析互換性のある FASTQ 形式に変換する HDF ビューアーで表示されたブラスト (NCBI) などのプログラムで受け入れられていないです。将来的にソフトウェアのイテレーション データは HDF ビューアーの必要性を排除 FASTQ 形式として使用できます。参照してください補足数字 1、2、および 3 です。
50 長さ 350 以上のヌクレオチド シーケンスは BLASTN (ヌクレオチド塩基配列データベースに対して) または BLASTX (アミノ酸配列に翻訳のヌクレオチド) による解析の対象となった (NCBI) 土壌試料中の有機体を識別するために。時間を与えられたクラスの制約および実験方法とないバイオインフォマティクスにコースの焦点である、私達はこれらのパラメーター内のシーケンス分析学生があります。私たちの生物情報学のクラスは、パイプライン分析ツールの開発のため、データを使用できます。バイオインフォマティクス解析のこのレベルは、実験室ベースのクラスでは説明しません。表 1より小さい 4 e-04 の e 値と識別された有機体のリストです。通常、4 e-04 未満の e 値は、入力シーケンス (クエリ) と一致したシーケンスの間の強い類似性を示します。(非冗長 (nr) データベース) に対して BLASTN によって識別される生物からさまざまな種があり、さらにゲノム ・ タンパク解析。土壌は、ボルティモア郡、メリーランドの庭から来たのこのサンプルは決して、土壌中に有機体がかもしれないものを決定するための以前のデータがないのでテストされていた。BLASTN (nr データベース) に対して分析分析では、nr データベースでない類似性を持つシーケンスがあったまた示されました。これらは本当に新規シーケンスをあるかどうか、さらなる研究が必要です。BLASTX でいくつかのシーケンス解析は BLASTN 解析で表されていない生物からいくつかのタンパク質を明らかにしました。表 2は、いくつかの可能なタンパク質性エンドペプチグーゼ、Atpase のようなタンパク質などを示します。シーケンスのこのライブラリを使用すると、学生講師が指示された場合は、さらに分析を実行するより高度なバイオインフォマティクスのツールを使用する機会があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig1.jpg"> 
図 1: ゲノム ライブラリー作製。ナノ細孔を用いたシーケンスの genomic DNA ライブラリの準備のための手順を実行します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55979/55979fig2.jpg"> 
図 2.ナノポアを使用して DNA の配列の模式。DNA は電気信号の生成とベースの識別を持つナノ細孔膜を通過します。この図は、必要なアクセス許可が変更されています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>生物</td>
			<td>e 値</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>放線菌由来。</td>
			<td>3.00 E-06</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocardoides sp。</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gordonia sp。</td>
			<td>5.00E-04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>併せ持つ nitrativorens</td>
			<td>1.00E-139</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Starkeya ノヴェッラ</td>
			<td>1.00E-31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>併せ持つ系</td>
			<td>1.00E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibomicrobium sp。</td>
			<td>5.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>緑膿菌 sp。</td>
			<td>2.00E-15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodothemus marinus</td>
			<td>1.00E-17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turneiella パルヴァ</td>
			<td>2.00E-24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エシェリヒア属大腸菌</td>
			<td>0.00 E + 00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>根粒菌 sp。</td>
			<td>3.00 E-30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gemmatirosa kalamazoonesis</td>
			<td>1.00E-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>病菌 sp。</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>スフィンゴモナス sp。</td>
			<td>8.00E-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellumonas sp。</td>
			<td>6.00 E-11</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1: BLASTN 分析の結果を選択します。土壌メタゲノム DNA シーケンス NCBI 非冗長塩基配列データベースに対して BLASTN 類似検索を受けます。報告されたデータは、4 x e-4 以下の e 値を持ちます。
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>タンパク質</td>
			<td>生物</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>タンパク質</td>
			<td>Acidobacter 菌</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>サム依存メチルトランスフェラーゼ</td>
			<td>H. 系</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Atp アーゼ</td>
			<td>Jannaschia sp。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エンドペプチダーゼ</td>
			<td>赤痢菌体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>溶解タンパク質</td>
			<td>エシェリヒア属大腸菌</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 2: BLASTX 分析の結果を選択します。NCBI の重複を除いた蛋白質データベースに対して BLASTX 類似検索を受ける土壌メタゲノムの DNA 配列。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig1.jpg"> 
補足図 1: プラットフォーム QC 結果します。QC のプラットフォームの結果が掲載されています。右上隅で、アクティブな毛穴の QC の結果です。フロー ・ セルの各象限は、アクティブな毛穴のためテストされます。メインのページは動的であり、各象限のテストを変更します。この実行で 1,414 単一毛穴が検出されました。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig2.jpg"> 
補足図 2: FASTQ ファイルに変換する FAST5 ファイル。ここで、右側にある、シーケンス実行からデータの出力です。それぞれの行は、個々 のシーケンスを表します。図の左側は、シーケンスを詳しく分析するために使える FASTQ ファイルに変換する HDF ビューアーで右サイドから強調表示されているシーケンスを示しています。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/55979/55979supfig3.jpg"> 
補足図 3: HDF ビューアーで例の FASTQ シーケンス。このシーケンス (読み取り 803) は、ヌクレオチドに FAST5 データを変換する FASTQ ファイル。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55979/55979supfig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

シーケンスの生体分子のナノ細孔技術、幅広い病原体、食品安全監視、ゲノム解析、metagenomic 環境の監視、および細菌の特性の識別を含む生命科学で抗生物質耐性。この記事でメタゲノム土壌 DNA 塩基配列ナノ細孔シーケンシング技術を使用して種の同定をする手順について説明します。

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

This article describes the steps for construction of a DNA library from soil, preparation and use of the nanopore flow cell, and analysis of the DNA ...

このビデオの全体的な目標は、ナノポアシーケンシング法を使用してメタゲノム土壌DNAをシーケンシングする方法を示すことです。この方法は、教育者がDNAシーケンシングを教室に導入し、分析のための新しいDNAシーケンシングデータをリアルタイムで生成するのに役立ちます。この手法の主な利点は、高速で手頃な価格であり、必要な実験装置が最小限であることです。この手法により、学生は、通常、実験室のクラスで利用できるより洗練されたバイオインフォマティクスツールを使用する機会も得られます。この短いプロトコルは、ラピッドシーケンシングキットで機能します。まず、0.2ミリリットルの薄肉チューブに200ナノグラムの高分子量DNAを加え、蒸留水で7.5マイクロリットルまで容量を補充します。次に、キットから2.5マイクロリットルのフラグメンテーションミックスを加え、反転を使用してチューブを穏やかに混合します。次に、遠心分離のパルスを使用して、チューブの内容物をスピンダウンします。次に、チューブをサーモサイクラーに移し、摂氏30度で1分間サイクルを行い、続いて摂氏75度で2回目の1分間サイクルを行います。次に、チューブを再度パルススピンします。適合したテザーライブラリを完成させるには、1マイクロリットルのラピッドアダプターと0.2マイクロリットルのブラント/TAリガーゼマスターミックスを追加します。次に、反転を使用してチューブを混合し、続いて別のパルススピンを行い、チューブを氷上に保存します。まず、シーケンサーをセットアップし、フローセルをパッケージから取り出して、ポータブルリアルタイムシーケンサーに取り付けます。次に、USBケーブルを使用してシーケンサーをコンピューターに接続し、シーケンシングソフトウェアを起動します。ソフトウェアで、start deviceコマンドを選択し、QCプラットフォームのオプションを選択します。次に、実行を押して品質管理を実行します。約 7 分後には、品質管理の実行が完了します。読み出しの緑色のハイライトは、DNAシーケンシングに使用可能なアクティブな細孔があることを示しています。少なくとも800個のアクティブポアが必要です。次に、ダイアログボックスに移動します。[Sample ID] フィールドに、シーケンシングするサンプルの名前を入力します。フローセルIDには、フローセルの上部に貼られているステッカーに記載されているコードを入力します。次に、シーケンサーの蓋を開けてから、プライミングポートカバーを左にスライドさせてポートにアクセスします。次に、よく存在する小さな泡を含む数マイクロリットルのバッファーを取り除きます。次に、センサーアレイを埋めるのに十分なバッファを作成します。作りたての完全に混合されたプライミングバッファーを1ミリリットル調製します。次に、800マイクロリットルのプライミングバッファーを追加し、5分間待ちます。5分後、残りの200マイクロリットルのプライミングバッファーを追加します。RBF1 と LLB を氷上でチルロードするためのライブラリを準備するには、適合したテザリング ライブラリを使用します。次に、新しい0.2ミリリットルの遠心分離チューブに、25.5マイクロリットルのRBF1と12マイクロリットルの室温の核フリー水を追加します。次に、LLBをピペットトリチュレーションで混合し、次に26.5マイクロリットルのアリコートを取り、希釈したRBF1でチューブに加えます。試薬をより多くのトリチュレーションを使用して混合し、内部のビーズが沈降するのを防ぎます。次に、適合してテザーされたライブラリを11マイクロリットル加え、反転を使用してチューブを穏やかに混合します。次に、パルススピンを使用してサンプルをプールします。ビーズを避けながら、サンプルの75マイクロリットルを取り、ポートドロップ賢明なスポットに追加します。次のドロップを追加する前に、各ドロップがポートに流れ込むことを確認してください。サンプルをロードするときは、次の液滴が追加される前に各液滴がポートに入ることが重要です。また、サンプルポートをロードする際にビーズを再懸濁してポートを詰まらせないようにすることも重要です。次に、元に戻しますampポートカバー 栓がポートに入ることを確認します。次に、デバイスの蓋を元に戻し、ソフトウェアで選択した48時間シーケンシング実行オプションの実行に進みます。記載されている手順を使用すると、教育目的で土壌DNAをシーケンシングするための迅速かつ安価な方法が提供されます。ランは通常、125, 000以上のリードをもたらし、平均して5, 000ベースペアを超えました。各実行には、さらなる分析に最も役立つものを選択するための品質スコアが与えられました。次に、各学生は、サンプルから生物を同定するために、少なくとも350ヌクレオチドの50配列をBLASTNまたはBLASTX分析にかけました。e値が0.0004未満の同定された生物は、強い一致と見なされます。BLASTNにかけられた多くの配列は、比類のないものや作られたもので、新規生物に関連しています。BLASTXは、BLASTN解析で表されなかった生物由来のいくつかのタンパク質を明らかにしました。興味深いのは、エンドペプチダーゼとATPアーゼ様タンパク質が同定されたことです。このビデオを見れば、ナノポアシーケンシング技術を使用してシーケンシングするための土壌DNAの調製方法と分析方法について十分に理解できるはずです。このプロトコルは2時間半で完了でき、最小限の実験装置や技術的な専門知識を必要とせず、教室の設定で完了することができます。この手順を試行して完了する際には、試薬を慎重に配管し、サンプルを完全に混合し、サンプルの損失を防ぐためにステップ間でサンプルを遠心分離することを忘れないでください。

nanopore-dna-sequencing-for-metagenomic-soil-analysis

Research

JoVE Journal

Environment

環境

土壌微生物群集から、高分子量、高品質のゲノムDNAを単離する方法論が説明されています。...

土壌と堆積物から高分子量のゲノムDNAの抽出

微生物群集の特徴を明らかにすることは、環境微生物学における長年の目標でした。次世代のシーケンシング法により、最小限のコストと労力で、これまでにない深さで微生物群集の特性評価が可能になりました。ここでは、ベンチトップシーケンサーを使用して細菌の16SリボソームRNA遺伝子を配列決定するアプローチについて詳しく説明します。...

16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

Metagenomicsを使用して、サイレージ牛の飼料のマイクロバイオームを調査しました。解析はショットガンシーケンシングによって行われました。このアプローチは、牛の飼料中の微生物群集の組成を特徴付けるために使用されました。...

サイレージのメタゲノム解析

同時に単一の土壌サンプルからの代謝、蛋白質および脂質の抽出、低下したサンプル準備時間を許して、数量限定でサンプルのマルチ弔質量分析を有効にするプロトコルが表示されます。...

マルチ弔土壌試料の分析のための MPLEx プロトコル

ここでは、土壌、根圏、ルート endosphere 内細菌叢解析・増幅シーケンス...

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

フィールドから植物の根の発掘だけでなく、土壌、根圏、endosphere に試料の加工は、DNA...

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

長い読み取りシーケンス大きく複雑なゲノム構造の変化の特徴付けとアセンブリを容易にします。ナノポア ベースのシーケンスのプラットフォームで超長いシーケンスを生成する方法について述べる。アプローチは、人間の細胞から中程度の範囲でプラスミド読み取りの数百人を生成する変更したライブラリの準備に続いて最適化された DNA...

全 Genomic DNA 分析のための超長いリード シーケンス

ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs...

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

我々は、ナノポアシーケンシングプラットフォーム上でアンプリコンベースの全ゲノムウストゥウイルス(USUV)シーケンシングのプロトコルを検証した。ここでは、ナノポアR10フローセルの誤差率をより詳細に用いた方法について説明する。...

全ゲノムナノポアシーケンシングの検証、例としてUsutuウイルスを用いた

本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

本研究は、土壌微生物バイオマスおよび菌類と細菌の比率を定量化するための迅速なddPCR法を提示します。ddPCR由来の微生物バイオマス炭素はクロロホルム燻蒸推定値との相関は弱いものの、追加の土壌サンプリングや厳しい手法を用いずに微生物の存在量を評価するための感度が高くスケーラブルな分子アプローチを提供します。...

デジタルドロップレットPCR(ddPCR)を用いた土壌中の微生物バイオマスの測定

学ぼう　ナノポアシーケンスを用いた土壌メタゲノムDNA解析法。高速で低コスト、最小限の機器で教室でも実施可能。BLASTN・BLASTXによる生物同定と新規タンパク質発見を通じて、学生がバイオインフォマティクスツールを実践的に学べる教育プロトコルです。

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用

さらに動画を探す

ナノポア DNA シーケンス メタゲノム土壌分析用

さらに動画を探す

ナノポア DNA シーケンスメタゲノム土壌分析用