Name: 注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T11:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: 学ぶ 3Dマイクロクリオゲルの作製法と細胞封入による再生医療および高スループット薬剤スクリーニングへの応用。この手法は幹細胞の保持と生存率を向上させ、創傷治癒における治療効果を高めます。

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この作品は中国国家自然科学基金によって財政上支えられる (補助金: 81522022、51461165302)。著者は、デュ研究室メンバーの一般的な支援を認めたいと思います。

著者が明らかに何もありません。

薬剤スクリーニングのための再生医学との in vitroモデルは、組織工学5,6,7,8,9の 2 つの重要なアプリケーションです。これらの 2 つのアプリケーションは、非常に異なるニーズを持って、それらの間の共通点ある培養条件詳細バイオミメティックのセル関数19を強化する必要があります。研究で改良されたセル関数のみを我々 は病気より20,21, を扱うことができるし、我々 が薬物探索6,7を加速することが培養細胞は薬...

培養皿やウェル プレートなどの平面的な 2次元 (2 D) 表面に従来の携帯文化はほとんどのネイティブ状態に近い細胞の挙動を引き出すことができます。様々 な種類の細胞、細胞外マトリックス三次元 (3 D) アーキテクチャ1,2,3 の生理活性の可溶性因子を構成するネイティブの細胞微小の正確な反復、4、、リニアアクチュエータ組織体外組織工学・再生医学のアプリケーションの構築に不可欠な基礎的生物学および創薬探索5,6,7 ,8,9。
2 D の細胞培養の代わりに生体模倣マイクロ アーキテクチャを事前に 3 D 細胞培養を用い、培養細胞の機能。人気の 3 D 細胞培養法は、集計細胞スフェロイド7,8,9,10にすることです。細胞スフェロイドは、高度な細胞保存と分散した細胞の注入と比較する生存と負傷者の組織に注入できること。ただし、非一様回転楕円体サイズと注入中に流体せん断力によって細胞に課された必然的な機械的損傷が悪い細胞治療効果11,12,13に します。同様に、回転楕円体の集計中に固有の不均一 3 D 細胞を用いた高スループット薬剤のスクリーニングの挑戦10への翻訳をしました。
3 D 細胞培養のための別の方法は、通常水性ゲルまたは多孔質のセルをカプセル化する生体材料学分野の援助によって達成されます。3 D アーキテクチャを構築する上で大きな柔軟性が可能です。治療のため一括足場にカプセル化細胞通常外科的移植、侵襲性、外傷性、それゆえに枕元にその翻訳を制限することで動物の体に配信されます。その一方で、水性ゲルは、熱 - 化学か酵素架橋11経由の in situゲルを許可する、動物の体にヒドロゲル前駆体溶液中に浮遊細胞を注入することにより低侵襲治療を有効にします。ただし、ヒドロゲル前駆物質水溶液の州はまだながら、細胞が配信されると彼らにさらされている機械的せん断注入中。ない限り、その場でゲル化ハイドロゲルの中に化学か酵素の架橋も内細胞への損傷を課す可能性があります。薬剤スクリーニングのため生体材料による細胞培養の均一性、制御性とスループットの問題に直面します。ヒドロゲルを使用すると、細胞の通常関与するゲル化、中にセル実行可能性と機能、プロセスを影響可能性があります。ヒドロゲルの細胞、播種前にゲル化を防ぐために氷の上に保持する必要がありますのでヒドロゲルの精度を確保するため通常非常に薄い調剤のヒント ・ ジャムが、細胞中にゲル化もほとんどの高スループット装置によって使用を妨げ高スループット スクリーニング。前もって形成された足場でした可能性のある個別の生体材料作製手順細胞培養から足場ベースの製品が比較的低いスループット14バルク材料として利用できるしかし、ほとんど。
現在の 3 D 培養法の欠点のいくつかを克服するために市販で使いやすい microcryogel アレイ チップ15を作製する微細加工 cryogelation 統合技術を開発しました。このプロトコルでは、それは生体適合性、分解性、費用対効果と細胞接着に必要なそれ以上の変更はない microcryogel 作製技術を実証するためゼラチンが選択されます。天然または合成のソースの他のポリマーは、作製、アプリケーションによっても使用できます。この技術を使って制御可能なサイズ、形状、レイアウトと小型と高弾性 microcryogels 作製することができます。さまざまな種類の細胞と共に読み込まれる、3 D への放射能は様々 なアプリケーションに対して作成でした。これらのユニークな特徴は、噴射に生体内で強化された治療効果について希望 injectability、セルの保護およびサイト指示された保存を有効にします。ない限り、一般的な実験装置と多彩な薬剤のスクリーニングおよび他の細胞アッセイのハイスループットの細胞培養を実現する機器と互換性のある 3 D 微少アレイを形成するため、microcryogels をさらに処理でした。ここで、我々 もの microcryogels と個々 の 3 D への放射能または 2 つの重要なアプリケーション、細胞治療、創薬スクリーニング、それぞれ10,15 の 3 D 微少配列とその後の治療の作製プロセスを詳細します。.

<table><tbody><tr><td>ゼラチン</td><td>sigma</td><td>G7041</td><td>他のすべての試薬は、特に明記されていない限り、Sigma-Aldrich(ミズーリ州セントルイス)から購入しました。</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド&nbsp;</td><td>J&K</td><td>902042</td><td>材料調製の架橋剤として使用されます。</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ(24 x 50 mm)</td><td>CITOGLASS、中国</td><td>10212450C</td><td>マイクロステンシルアレイチップにprcursor溶液をこすり落とします。</td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;水素化ホウ素、NaBH4</td><td>北京化学工場</td><td>116-8</td>ゲル<td>化後に残っているグルタルアルデヒドを洗い流すため。</td></tr><tr><td>真空ジャー</td><td>アスペルト、中国</td><td>VC8130</td>真空<td>下でマイクロゲルを保存するため。</td></tr><tr><td>ポリメチルメタクリレート(PMMA)シート&nbsp;</td><td>Sunjin Electronics Co.、Ltd、中国</td><td></td><td>普通PMMAシート。</td></tr><tr><td>レイジェットレーザーシステム</td><td>レイジェット、オーストラリア</td><td>レイジェット50 C30</td><td>PMMAシートを彫刻してウェルを形成します。</td></tr><tr><td>プラズマ</td><td>クリーナーMycro Technologies、米国</td><td>PDC-32GPMMA</td><td>を好温性にするため。</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td>ボイカン、中国</td><td>SC21CL</td><td>材料を凍結乾燥します。</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液(0.4%)</td><td>Zhongkekeao、中国</td><td>DA0065</td>マイクロ<td>ゲルを染色する。</td></tr><tr><td>ドキソルビシン塩酸塩</td><td>ENERGY CHEMICAL, China</td><td>A01E0801360010</td><td>2Dまたは3Dマイクロゲル中の細胞の薬剤耐性をテストします。</td></tr><tr><td>Live/Dead Assay</td><td>同人堂モレキュラーテクノロジーズ(熊本県熊本市)</td><td>CS01-10</td><td>生きた細胞と死んだ細胞を区別するために。</td></tr><tr><td>Cell Titer-Blue</td><td>Promega(米国ウィスコンシン州)。</td><td>G8080</td><td>細胞の生存率をテストするため。</td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>BD Biosciences, USA</td><td>352360</td><td>マイクロゲルを採取します。</td></tr><tr><td>D-ルシフェリン</td><td>SYNCHEM(ドイツ)</td><td>s039</td>細胞<td>を粘着する。</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>FEI, USA</td><td>Quanta 200</td><td>マイクロゲルの形態を特徴づけるため。</td></tr><tr><td>&nbsp;機械試験機</td><td>Bose, USA</td><td>3230</td><td>機械的特徴の測定に。</td></tr><tr><td>プログラマブルシリンジポンプ&nbsp;</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>ALADINI 1000</td><td>試験用。</td></tr><tr><td>デジタルフォースゲージ</td><td>HBO、Yueqing Haibao Instrument Co.、Ltd.、中国</td><td>H-50&nbsp;</td><td>injactabiliyをテストするため。</td></tr><tr><td>エチレンオキシド滅菌システム</td><td>Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC</td><td>AN74i</td><td>マイクロゲルをエチレンオキシドガスで滅菌します。</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices,USA</td><td>M5</td><td>マイクロアレイの蛍光強度を測定するため。</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ニコン、日本</td><td>A1Rsi</td><td>細胞の分布を3Dで観察します。</td></tr><tr><td>Xenogen&nbsp;ルミナIIイメージングシステム</td><td>キャリパーライフサイエンス社(米国)</td><td>IVIS</td><td>動物の細胞を追跡します。</td></tr><tr><td>液体作業統計</td>アプリ<td>コットデザイン、米国</td><td>Sピペット</td><td>媒体または細胞懸濁液を高スループットでロードします。</td></tr></tbody></table>

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 d への放射能

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

伝統的な 2 D 細胞培養を 3 D 細胞培養にアップグレードするには、多孔質マイクロ cryogels (microcryogels)、様々 な 3 D への放射能を形成する細胞の種類を読み込むことができますを生成する cryogelation 技術が微細加工を統合されている私たち。ここで、多彩な 3 D への放射能と再生医療および創薬スクリーニングに応用を作製するプロトコルを提案する.サイズと形状制御 microcryogels アレイ チップ、またはことができる収穫のオフチップ注射再生療法の個別セル ロード キャリアとして高スループットの 3 D 微少配列にアセンブルされたオンチップ更なる加工できます。薬剤のスクリーニング。これらのマイクロ スケール cryogels の高弾性性質のため 3 D への放射能は射出中に機械的せん断力から細胞を保護することにより低侵襲細胞療法のための素晴らしい injectability を展示します。これにより強化された細胞の生存とマウス下肢虚血モデルにおいて治療効果。一方、標準的なマルチ 384 ウェル フォーマットで 3 D 微少配列のアセンブリは高スループット薬剤のスクリーニングのこの汎用性の高い 3 D 細胞培養プラットフォームで有効にする共通研究施設や設備の使用を促進します。

作製と 3 D の微少の形成のための microcryogels の評価。
このプロトコルによれば microcryogels はフォーム 3 D への放射能と個々 の microcryogels または microcryogel アレイを作製し、再生治療や創薬スクリーニング、それぞれ (図 1) に適用されました。PMMA から作製した Microstencil アレイ チップは、microcryogel アレイ チップの micromolds として適用されました。可変の幾何学的なデザインは、microstencil アレイ チップの準備でした。我々 は (すなわち円、楕円、三角形、およびクローバー) 様々 な形やサイズの異なる円形の microstencil アレイ チップを含んだ例として代表的な 45 mm × 14 mm micro...

このプロトコルは、cryogelation の技術で微細加工を統合することにより弾性三次元多孔体 microcryogels の作製をについて説明します。セルの読み込み、時に、容易に注入の生体内再生治療を容易にすることができますまたは高スループット薬剤スクリーニングの in vitroの配列に組み立てに 3 D への放射能を生成します。

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

クライオゲル化を用いて弾性のある3Dマクロ多孔性マイクロクライオゲルを作製する全体の目的は、注入可能な再生医療およびin vitroでのハイスループット薬剤スクリーニングを促進することです。このビデオでは、汎用性の高い3Dマイクロ組織を作製し、それを再生医療と薬剤スクリーニングに応用するためのプロトコルを紹介します。この再生医療技術により、創傷部位への注入後の幹細胞の保持率、生存率、および治療機能が向上します。使いやすさとハイスループットスクリーニングの可能性により、薬物スクリーニングも改善されます。一般的に、3D培養に不慣れな人は、プロトコルの複雑さに苦心します。本手法は3D培養を簡素化し、得られる3Dマイクロ組織に対して研究者がより高度な制御を行うことを可能にします。これらの手順のデモンストレーションを補助するのは、当研究室の大学院生4名のZhou Lyu、Liu Wei、Li Yaquian、You Zhifengです。PMMAマイクロステンシルアレイチップを脱イオン水で洗浄し、レーザー彫刻後に残った残渣を除去します。その後、マイクロステンシルアレイチップを60 °Cで乾燥させます。次に、乾燥させたチップをプラズマクリーナーで4個ずつ処理します。まず、真空ポンプを2分間作動させます。その後、RF電力を18 Wで3分間印加し、チップの親水性を高めます。次に、チップ5枚あたり1 mLのゼラチン前駆体溶液を調製します。ゼラチンを60 °Cのウォーターバスで溶解させ、溶液を氷上で5分間インキュベートします。溶液がわずかに冷却され、かつ液状の状態であるときに、グルタルアルデヒドを最終濃度0.3%になるようにゼラチン前駆体溶液に十分に混合します。次に、調製した溶液を各チップの上表面に 200 µL ずつピペッティングします。曲げガラス棒を用いて、溶液をチップ全体に均一に広げてください。その後、溶液を載せたアレイチップを速やかに -20 °C のフリーザーに移し、16 時間かけて凍結ゲル化させます。翌日、凍結乾燥機を約30分かけて−40°Cまで冷却します。次に、アレイチップをセットし、真空状態で2時間凍結乾燥させます。この条件下で氷が昇華し、チップが使用可能な状態になります。まず、チップから個々のマイクロクライオゲルを回収します。作製したマイクロクライオゲルアレイチップを、作製したPDMSエジェクタピンアレイの上に重ね合わせます。各マイクロクライオゲルをエジェクタピンに合わせて配置してください。次に、マイクロクライオゲルアレイチップをアレイに押し込み、ウェルからマイクロクライオゲルを押し出します。続いて、放出されたマイクロクライオゲルをウォーターバスへ回収し、セルストレーナーを用いて回収します。1枚のチップから得られるすべてのマイクロクライオゲルを回収するために、1つのストレーナーを使用してください。次に、マイクロクライオゲルを氷上で水素化ホウ素ナトリウムで洗浄します。架橋されていないアルデヒド残基を約20分間クエンチさせます。その後、水素化ホウ素ナトリウムを捨て、5 mLの脱イオン水で15分間マイクロクライオゲルを洗浄します。次へ進む前に、合計3回から5回の水洗浄を行います。最後の水洗浄からマイクロクライオゲルを取り出した後、ピンセットを用いて、セルストレイナーから35mmペトリ皿に移動させます。マイクロクライオゲルの各収集分が1つのクラスターとなります。次に、各マイクロクライオゲルのクラスターに50〜70 µLの脱イオン水を加え、ディッシュに蓋をします。その後、ディッシュを軽く叩いて、重なっているマイクロクライオゲルを平らにします。そして、マイクロクライオゲルを−20 °Cで4〜16時間凍結させます。その後、以前と同様に2時間凍結乾燥させます。次のステップは3Dマイクロ組織を作製することです。まず、マイクロクライオゲルを滅菌します。次に、トリプシンで細胞を回収し、細胞密度を定量した後、増殖培地を用いて1 mLあたり800万個の密度で再懸濁します。続いて、マイクロクライオゲルの各クラスター上に、細胞懸濁液を60 µLずつピペットで分注します。ディッシュを加湿チャンバー内に保持し、37 °Cで2時間インキュベートして、細胞をゲル内に吸収させます。インキュベーション後、各ディッシュに2 mLの培地を加え、1日おきに培地を交換しながら培養を継続します。2日後には、3Dマイクロ組織が形成されます。3Dマイクロ組織をマウスに注入するには、まずそれらを5 mLピペットに移し、次にセルストレーナーにロードして培地をろ過します。次に、3Dマイクロ組織を15%ゼラチン溶液に再懸濁します。動物の移植準備が整った後、薄筋の3箇所にマイクロ組織を筋肉内注射します。各注射には、150 µLの溶液に含まれる150個のマイクロクライオゲルを含める必要があります。23ゲージの針を装着した1mLシリンジを使用します。オンチップ細胞培養用のマイクロクライオゲルアレイを組み立てた後、濡らさないように注意して、あらかじめ加熱した加湿チャンバー内に配置します。次に、十分に混合した細胞懸濁液3µLを、各マイクロクライオゲルウェルに直接、注意深く分注します。溶液を吐出する前に、ピペットチップをマイクロクライオゲルの表面に軽く接触させてください。外周のウェルには播種しないでください。ウェルへのロード後、各ウェルに10 µLの選択培地を添加し、さらに96チャンネル液体分注機を用いて外周のウェルに培地を添加し、蒸発を抑制します。その後、チップを湿度チャンバー内で24時間培養し、3Dマイクロ組織を形成させます。翌日、96チャンネル液体分注機を使用して、各ウェルに濃度勾配となるように薬剤を10 µLずつ4回添加し、DMSOコントロールを含む全384ウェルへの添加を完了させます。その後、さらに24時間培養を継続します。24時間の薬剤処理後、各ウェルに4 µLのレサズリンストック溶液を加え、プレートを2時間インキュベートして、細胞にレサズリンを代謝させます。細胞によるレサズリンの代謝を測定するために、プレートリーダーを使用します。回収されたゼラチンマイクロクライオゲルは、あらかじめ定義された形状とサイズを持っていました。SEM分析の結果、マイクロクライオゲルは30から80ミクロンの範囲の細孔径を持つ相互連結したマクロポーラス構造を含んでいることが示されました。ゼラチンマイクロクライオゲルの注入性は、注入後の培養によって定量的に評価されました。1 mLあたり1,000個の粒子が、臨床的に許容される力である10 newtonsを下回る6 newtonsで注入されました。マイクロクライオゲル中の幹細胞は、注入後5日間の培養を経て、高い生存率と優れた増殖能を維持していました。これらの細胞を用いてマウス肢虚血モデルの治療を行い、手術から28日後の虚血肢の生理的状態を検討しました。100,000個の幹細胞を用いたマイクロ組織による治療により、肢の救済率が向上しました。28日後、自発的な指断端を示したマウスはわずか25%でした。別の応用例として、この3Dマイクロティッシュアレイを高スループットの薬剤試験に使用しました。肝細胞癌細胞にはdoxorubicinを、非小細胞肺癌細胞にはIMMLG-8439を投与しました。いずれの場合においても、3D培養によって薬剤耐性が向上しました。このビデオを視聴することで、注入可能な再生医療のためのオフチップ3D培養、またはin vitroでのハイスループット薬剤スクリーニングのためのオンチップ3D細胞培養アレイに使用する、弾性のある3D微多孔性マイクロクライオゲルの作製方法について十分に理解できるはずです。この技術は、細胞ベースの再生医療および薬剤スクリーニング分野の研究者が3D細胞培養を活用することを可能にし、両研究分野を前進させました。グルタラアルデヒドおよび水素化ホウ素ナトリウムの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な保護衣の着用やラボ用フード内での作業など、常に十分な予防措置を講じてください。

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バイオエンジニアリング（生体工学）

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ヒトiPSC由来心筋細胞、心臓線維芽細胞、内皮細胞を用いた3次元心臓ミクロ組織アレイの作製

本プロトコールは、調整可能な機械的特徴を有するヒドロゲルのハイスループット光架橋を容易にするカスタムメイドのUV照明装置を使用して、3Dマトリックス模倣培養における患者由来の膠芽腫細胞の化学療法応答に対する機械的および生化学的手がかりの効果を評価するための実験プラットフォームを記載する。...

ハイドロゲルアレイにより、3D腫瘍モデルにおけるマトリックス成分および治療薬の効果をスクリーニングするためのスループットの向上が可能

このプロトコルは、3Dエンジニアリングされた心臓および骨格筋組織を生成するための方法を提供し、前臨床薬物スクリーニングモダリティにおけるそれらの使用について説明します。記載された方法は、磁気センシングシステムを利用して、24個の組織の同時評価を並行して容易にする。...

スケーラブルな3Dエンジニアリング筋肉組織における前臨床薬物検査

学ぶ 3Dマイクロクリオゲルの作製法と細胞封入による再生医療および高スループット薬剤スクリーニングへの応用。この手法は幹細胞の保持と生存率を向上させ、創傷治癒における治療効果を高めます。

注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

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