注射の再生療法と高スループットの薬剤のスクリーニングのための 3 D への放射能

クライオゲル化を使用して弾性3Dマクロポーラスマイクロクライオゲルを作製する全体的な目標は、注射可能な再生治療とin vitroハイスループット薬物スクリーニングを容易にすることです。このビデオでは、汎用性の高い3D微小組織を作製し、それらを再生治療や薬物スクリーニングに適用するためのプロトコルを紹介しています。再生治療技術は、創傷部位への注射後の幹細胞の保持、生存、および治療機能を改善します。

また、使いやすさとハイスループットスクリーニングの可能性により、薬物スクリーニングも改善されています。一般的に、3Dカルチャーに不慣れな人は、複雑なプロトコルのために苦労します。この技術により、3D培養が簡素化され、研究者は結果として得られる3D微小組織をより詳細に制御できます。

これらの手順のデモンストレーションを支援するのは、私たちの研究室の4人の大学院生であるZhou Lyu、Liu Wei、Li Yaquian、およびYou Zhifengです。PMMAマイクロステンシルアレイチップを脱イオン水で洗浄し、レーザー彫刻に残っている破片を取り除きます。次に、マイクロステンシルアレイチップを摂氏60度で乾燥させます。

次に、乾燥したチップをプラズマクリーナーで4つのグループで処理します。まず、真空ポンプを2分間運転します。次に、18ワットのRF電力を3分間使用して、チップの親水性を高めます。

次に、5チップごとに1ミリリットルのゼラチン前駆体溶液を作成します。ゼラチンを摂氏60度の水浴に溶かし、溶液を氷上で5分間インキュベートします。わずかに冷却されたら、まだ液体で、グルタルアルデヒドをゼラチン前駆体溶液に完全に混合して、最終濃度0.3%のグルタルアルデヒドにします。

次に、準備した溶液を200マイクロリットルを各チップの上面にピペットで移します。曲がったガラス棒を使用して、溶液をチップ全体に均等に分散させます。次に、溶液をロードしたアレイチップを直ちにマイナス20°Cの冷凍庫に16時間移し、凍結します。

翌日、凍結乾燥機を約30分かけてマイナス40°Cに冷却します。次に、アレイチップをロードし、真空下で2時間凍結乾燥します。これらの条件下で氷は昇華し、チップは使用できるようになります。

まず、チップから個々のマイクロクライオゲルを回収します。まず、作製したPDMSエジェクターピンアレイの上に、作製したマイクロクライオゲルアレイチップを重ね合わせます。各マイクロクライオゲルをエジェクターピンに合わせます。

次に、マイクロクライオゲルアレイチップをアレイに押し込み、マイクロクライオゲルをウェルから移動させます。次に、排出されたマイクロクライオゲルを水浴に回収し、セルストレーナーを使用してそれらを収集します。1つのストレーナを使用して、1つのチップからすべてのマイクロクライオゲルを収集します。

次に、マイクロクライオゲルを水化ホウ素ナトリウムで氷上で洗浄します。架橋されていないアルデヒド残基を約20分間急冷します。次に、水素化ホウ素ナトリウムを廃棄し、マイクロクライオゲルを5ミリリットルの脱イオン水で15分間洗浄します。

続行する前に、合計3〜5回の水洗いを行います。最後の水洗浄からマイクロクライオゲルを取り出した後、ピンセットを使用して細胞ストレーナーから35mmのペトリ皿に移します。マイクロクライオゲルの各コレクションは、1つのクラスターを構成します。

次に、マイクロクライオゲルの各クラスターに50〜70マイクロリットルの脱イオン水を追加し、皿を覆います。次に、皿を軽くたたいて、積み重なったマイクロクライオゲルを水平にします。その後、マイクロクライオゲルをマイナス20°Cで4〜16時間凍結します。

その後、前と同じように2時間凍結乾燥します。次のステップは、3D微小組織を作成することです。まず、マイクロクライオゲルを滅菌します。

次に、トリプシンで細胞を回収し、その密度を定量化し、増殖培地に1ミリリットルあたり800万個の細胞で再懸濁します。次に、60マイクロリットルの細胞懸濁液をマイクロクライオゲルの各クラスターにピペットで移します。ディッシュを加湿チャンバーに保持し、細胞がゲルに吸収されるように摂氏37度で2時間インキュベー

インキュベーション後、各皿に2ミリリットルの培地を加え、一日おきに培地を交換しながら培養を続けます。2日で、3D微小組織が形成されます。3D微小組織をマウスに注入するには、まず5ミリリットルのピペットに移し、次に細胞ストレーナーにロードして培地をろ過します。

次に、3D微小組織を15%ゼラチン溶液に再懸濁します。移植のために動物を準備した後、微小組織をグラシリス筋の3つの位置に筋肉内に注入します。各注射には、150マイクロリットルの溶液に150マイクロクライオゲルが含まれている必要があります。.

23ゲージの針が付いた1ミリリットルの注射器を使用してください。オンチップ細胞培養用のマイクロクライオゲルアレイを組み立てた後、濡らさないように予熱した加湿チャンバーに慎重に入れます。次に、3マイクロリットルの完全に混合した細胞懸濁液を各マイクロクライオゲルウェルに直接慎重に分注します。

溶液を排出する前に、ピペットの先端をマイクロクライオゲルの表面に軽く触れさせてください。周辺ウェルに種をまかないでください。ウェルをロードした後、各ウェルに10マイクロリットルの選択培地を追加し、96チャンネルの液体ディスペンサーを使用して周辺ウェルに培地を追加して蒸発を遅らせます。

次に、チップを湿度チャンバーで24時間培養して、3D微小組織を形成します。翌日、96チャンネルの液体ディスペンサーを使用して、濃度勾配で各ウェルに10マイクロリットルの薬剤を4回追加し、DMSOコントロールを含む384のウェルすべてを完全に追加します。その後、24時間培養を続けます。

薬物治療の24時間後、各ウェルに4マイクロリットルのレサズリンストック溶液を追加し、プレートを2時間インキュベートして、細胞がレサズリンを代謝できるようにします。レサズリンの細胞代謝を測定するには、プレートリーダーを使用します。収穫されたゼラチンマイクロクライオゲルは、形状とサイズがあらかじめ定義されていました。

SEMによる分析により、マイクロクライオゲルには、細孔サイズが30〜80ミクロンの範囲の相互接続されたマクロ多孔質構造が含まれていることが示されました。ゼラチンマイクロクライオゲルの注入性は、注入後にそれらを培養することにより定量的に評価されました。1ミリリットルあたり1, 000を、臨床的に許容される力である10ニュートンよりも少ない6ニュートンで注入しました。

マイクロクライオゲル中の幹細胞は、5日間の培養中に注射後も高い生存率と大きな増殖能力を維持しました。このような細胞を用いて、マウス四肢虚血モデルを治療し、手術の28日後に虚血性四肢の生理状態を調べました。100, 000の幹細胞による微小組織処理により、四肢の救助が改善されました。

28日後に自発的な足指の切断を示したマウスはわずか25%でした。別のアプリケーションでは、3Dマイクロティッシュアレイをハイスループットの薬物試験に使用しました。肝細胞がん細胞をドキソルビシンで治療し、非小細胞肺がん細胞をIMMLG-8439で治療した。

いずれの場合も、3D培養により薬剤耐性が増加しました。このビデオを見れば、注射可能な再生治療を用いたオフチップ3D培養用の弾性3D微孔性マイクロクライオゲルの作製方法や、in vitroハイスループット薬物スクリーニング用のオンチップ3D細胞培養アレイの作製方法について十分に理解できるはずです。この技術は、細胞ベースの再生医療と薬物スクリーニングの分野の研究者が3D細胞培養を活用する道を開き、両方の研究分野を進歩させました。

グルタルアルデヒドと水素化ホウ素ナトリウムの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な保護服を着用したり、実験室のフードの下で作業したりするなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。