Name: 臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 10 s
Description: 学ぼう、臍帯血由来iPS細胞から軟骨形成ペレットを作製する手法。本プロトコルは再生医療や軟骨修復研究に応用可能で、疾患モデリングや創薬スクリーニングにも活用できます。

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この作業は、韓国保健医療技術研究開発プロジェクト（HI16C2177）の助成を受けて行われました。

このプロトコルは、カトリック大学（KC12TISI0861）の制度審査委員会によって承認された。再プログラミングに使用したCBMCは、ソウル・セント・メアリー病院の臍帯血バンクから直接入手した。 1. iPSCとの軟骨形成分化<ol><li> CBMC-iPSC生成 <ol><li>先の研究23に示されたプロトコルを用いてCBMC-hiPSCを生成する。 </li><li>血球を15 mLコニカルチューブに集め、血球計数器を使用して数えます。 </li><li> 3×10 5細胞を調製し、515×gおよびRTで5分間遠心分離する。吸引によって上清を捨て、血球培地0.5mLに細胞を再懸濁する。 </li><li>細胞をコーティングされていない24ウェルプレートのウェルに移し、製造者の推奨に従って、センダイウイルス混合物を添加する。 </li><li> 1,150 xgおよび30℃で30分間プレートを遠心分離する。 </li><li>後部37℃、5％CO 2で一晩（O / N）インキュベートする。 </li><li>翌日、形質導入された細胞をマトリックス被覆ウェルに移す。 30℃で30分間1,150 xgでプレートを遠心分離する。 </li><li>遠心分離後、上清を除去し、1mLのiPSC培地を添加し、37℃、5％CO 2で細胞O / Nを維持する。 </li><li> 37℃および5％CO 2で付着細胞を維持する。毎日培地を交換し、新鮮なiPSC培地に交換してください。 注：コロニーは、形質導入後14日目〜21日に出現する。 </li></ol></li><li> EB生成 <ol><li> 37℃および5％CO 2で hiPSCを維持する。新鮮なEssential 8（E8）培地と交換して、培地を毎日交換してください。 </li><li> E8培地でビトロネクチンでコーティングした100 mmディッシュで2 x 10 6個の hiPSCを調製します。 </li><li>培養ディッシュからE8培地を除去し、滅菌リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄する。 </li><li> 1を加えるmLの1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を添加し、37℃および5％CO 2で2分間インキュベートする。 </li><li> 3mLのE8培地で細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。室温（RT）で2分間250xgで細胞を遠心分離する。 </li><li>細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引し、E8培地5 mLに細胞を再懸濁する。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を計数し、100mmペトリ皿ごとに2×10 6個の細胞を調製する。調製した細胞を、10μMのρ-関連キナーゼ（ROCK）阻害剤を含むE8およびEB培地（1：1）の10mL混合物中に再懸濁する。 </li><li> 37℃、5％CO 2で細胞をO / Nでインキュベートする。 </li><li>翌日、ピペットで集めたEBを採取する。細胞を250xgで1分間遠心分離する。上清を除去し、10mLの新鮮なE8培地にEBを再懸濁する。 </li><li>生成されたEBを5日間拡大し、毎日の変更をfresで行うh E8培地。さらに成熟するために、培養培地をE7培地に交換する。 37℃、5％CO 2でさらに5日間EBを維持し、新鮮なE7培地で毎日培地を交換する。 注：E7培地は、FGF2を含まないE8培地である。 </li></ol></li><li> EBからの伸長細胞誘導 <ol><li> 1％ゼラチン6mLを100mmディッシュに加え、37℃および5％CO 2で30分間インキュベートする。 </li><li>使用前にゼラチンを取り出し、2〜3時間完全に乾燥させます。 </li><li> EBを50 mLコニカルチューブに移す。 EBがコニカルチューブの底に落ち着くようにします。 EBを乱すことなく上清を除去する。 </li><li> EBを20％ウシ胎児血清（FBS）を含む10mLのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）に再懸濁する。 EBをゼラチンコートされた100mmディッシュに移す。 10μMのROCK阻害剤を添加する。 </li><li>細胞を37℃、5％CO 2で7日間インキュベートし、維持する。私を変えるROCK阻害剤を添加することなく1日おきに投与する。 </li></ol></li><li> 軟骨形成のペレット形成 <ol><li>皿から培地を吸引し、細胞をPBSで3回洗浄する。 </li><li> 1 mM EDTA 1 mLを加え、37℃、5％CO 2で2分間インキュベートする。 </li><li> 20％FBSを含む5mLのDMEMを用いて細胞を採取し、新しい15mLコニカルチューブに移す。 </li><li>細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。上清を捨て、20％FBSを含む10mLのDMEMにペレットを再懸濁する。 </li><li>濾過し、40μmの細胞ストレーナーを用いて細胞塊を捨て、単一の細胞を回収する。血球計数器を用いて単一細胞を計数する。 </li><li>細胞を250 xgおよび室温で2分間遠心分離する。 100μLの軟骨形成分化培地（CDM）を含む15mLコニカルチューブ中にペレットあたり上清および種子3×10 5細胞を除去する。 </li><li>ペレット形成のために、細胞を5分間、680×gおよびRT。 注：ペレットは、軟骨形成性のペレットの分化の間、15mLの円錐管中に維持される。 </li><li> 37℃および5％CO 2で一晩細胞をインキュベートする。 </li><li> 2〜3日ごとにCDMを変更してください。 3日以内に、ペレットは平らで回転楕円体の形態を示す。 37℃および5％CO 2で21日間ペレットを維持する。 </li></ol></li></ol> 2.染色による軟骨形成ペレットのキャラクタリゼーション<ol><li> 軟骨形成包埋 <ol><li>包埋する前に、58℃でパラフィンを調製し、溶解する。 </li><li>ペレットを1 mLの4％パラホルムアルデヒドに1.5 mLチューブで室温で2時間固定する。 注意：パラホルムアルデヒドは非常に有毒である。眼、皮膚、粘膜との接触を避ける。暴露を最小限にし、吸入を避ける。 </li><li>ガセットの1つの層をカセットに置き、ピペットを使用して固定ペレットを移す。折りたたむことでペレットを覆うカセット蓋を閉じます。 </li><li> 100mLの70％エタノール（EtOH）中で10分間ずつ2回脱水を開始する。 80％および95％EtOH中で連続的に10分間洗浄することによりペレットを脱水する。 </li><li>ペレットを10分間100％EtOHに移す。新鮮なEtOHで3回繰り返します。 </li><li> 「清澄化」するために、溶液をEtOHとキシレンの100mL、1：1混合物と交換し、続いてEtOHとキシレンの1：2混合物をそれぞれ10分間交換する。ペレットを100％キシレンで2回、それぞれ10分間インキュベートすることによって残りのEtOHを除去する。 </li><li>パラフィン浸透のために、ペレットを連続キシレンおよびパラフィン混合物中でインキュベートする。パラフィン浸透プロセス全体を58℃で実施する。ペレットを100mLのキシレンとパラフィンの2：1混合物に30分間インキュベートする。 </li><li>溶液をキシレンとパラフィンの1：1混合物100mLと交換し、30分間インキュベートする。 </li><li>この溶液をキシレンとパラフィンの1：2混合物100mLに交換し、30分。 </li><li>最終的な浸潤のために、ペレットを100％パラフィンの最初の浴に移し、2時間インキュベートする。 </li><li>ペレットを100％パラフィンの第2の浴に移し、58℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>翌日、ピンセットを使ってペレットを金型に静かに移す。パラフィンディスペンサーからモールドにパラフィンを加えます。パラフィンを4℃で30分間固めます。 </li><li>切片を7μmでスライスし、切片をスライド上に移す。スライドを一晩乾燥させ、使用準備が整うまでRTで保存します。 </li></ol></li><li> スライドの準備 <ol><li> 100％、90％、80％、および70％EtOHの各100mLを順次5分間ずつ移動させることにより、スライドを脱パラフィンする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li></ol></li><li> アルシアンブルー染色 <ol><li>スライドを1％アルシアンブルー溶液50 mLに30分間インキュベートする。 NOTE：アルシアンブルーを3％酢酸溶液で希釈する。酢酸を用いてpHを2.5に調整する。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で2分間すすいでください。 </li><li>スライドを脱イオン水（DW）ですすぎ、核高速赤色溶液で2分間対比染色する。 </li><li>スライドをガラス瓶に入れ、水道水で1分間すすいでください。 </li><li> 2.3.5）手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> トルイジンブルー染色 <ol><li>スライドを50mLのトルイジンブルー溶液で4分間インキュベートする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li><li>手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学的染色 <ol><li>内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、スライドを3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。 </li><li> 1：100に希釈した一次抗体（抗COL1A1および-COL2A1）200μLをトリスバスライドに1％ウシ血清アルブミン（BSA）と5％正常ヤギ血清（NGS）を含む生理食塩水（TBS）を加え、4℃でO / Nをインキュベートする。 </li><li>翌日、スライドをガラス瓶に入れ、0.1％ポリソルベート20（TBST）を含む50mLのTBSでそれぞれ5分間3回洗浄する。 </li><li>スライドに2次抗体（ヤギ抗ウサギIgG抗体、1％BSAおよび5％NGSを含有するTBS中に1：200希釈）200μLを適用し、RTで40分間インキュベートする。 </li><li>ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。 </li><li>シグナル増幅のために、HRP結合ストレプトアビジン溶液をスライドにアプライし、10分間インキュベートする。 </li><li>ガラス瓶にスライドを置き、それぞれ5分間50 mLで3回洗浄する。 </li><li> DAB-ペルオキシダーゼ基質溶液を混合し、各スライドに200μLの溶液を適用し、1分間インキュベートする。 </li><li>スライドガラスをガラス瓶に入れ、水道水で5分間すすぎます。 </li><li>対比染色Mayerのヘマトキシリンで1分間処理した。 </li><li> DWでスライドを洗う。 </li><li>手順2.6でスライドを脱水してマウントします。 </li></ol></li><li> 脱水とマウント <ol><li> 70％、80％、90％、および100％EtOHの各100mLを順番に移動させてスライドを脱水する。 </li><li>スライドを1分間、キシレンの2回の変更に浸漬する。 </li><li>カバースリップに50μLのマウント溶液を加え、スライドを上に置きます。 </li></ol></li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコルは、CBMCからhiPSCを首尾よく生成した。ヤマナカ因子24を含むセンダイウイルスベクターを用いて、CBMCをhiPSCに再プログラミングした24 。分化には3例を用い、すべての実験でこのプロトコールを用いて軟骨原性ペレットを作製した。多くの研究により、hiPSCの軟骨細胞への分化に関するプロトコールが報告されている25,26,27,28。しかし、CBMC-hiPSCsの軟骨の再生および回復の候補の使用を確認するためには、さらなる研究が必要である。 軟骨形成は、様々な体細胞型11,25,26,27,29から生成されたhiPSCを用いて確認された。多くのレポート再プログラムに使用される体細胞の起源がhiPSC30,31,32,33の分化結果に影響を及ぼし得ることを示す。臍帯血は、HSCおよびMSCが豊富な源である。血液細胞やMSCのような臍帯血由来の細胞の違いに関する報告はない。しかし、以前の研究では、関節軟骨細胞由来hiPSCは、臍帯血または皮膚線維芽細胞から産生されたh...

hiPSCsの使用は、薬物スクリーニングおよび種々の疾患の機械的研究のための新しい戦略を表す。再生的な観点から、hiPSCsはまた、関節軟骨1,2などの治癒能力が限定された損傷組織の置換のための潜在的な供給源でもある。 天然の関節軟骨の再生は、数十年にわたり挑戦されてきた。関節軟骨は柔らかく白い組織で、骨の端を覆い、摩擦から保護します。しかし、損傷したときの再生能力は限られており、自己修復はほとんど不可能である。したがって、数十年にわたって軟骨の再生に焦点を当てた研究が進行中である。 従来、軟骨形成系統へのインビトロ分化は、通常、膝関節から単離したBMSCまたは天然軟骨細胞を用いて行った3 。原因それらの軟骨形成能、BMSCおよび天然軟骨細胞は、軟骨形成におけるそれらの使用を支持する多くのメリットを有する。しかし、それらの限定された拡大および不安定な表現型のため、これらの細胞は、関節軟骨欠損の再構築にいくつかの限界に直面する。 インビトロ培養条件下では、これらの細胞は3-4継代後にそれら自身の特徴を失う傾向があり、最終的にそれらの分化能力に影響を及ぼす4 。また、天然軟骨細胞の場合、これらの細胞を得る際には、膝関節へのさらなる損傷が不可避である。 BMSCまたは天然軟骨細胞とは異なり、hiPSCはインビトロで無期限に増殖することができる。適切な培養条件では、hiPSCは軟骨分化の代替源として大きな可能性を秘めています。しかし、hiPSCの本質的な特性を変えることは難しい5 。さらに、それはいくつかの複雑なin vitro ste特定の細胞型にhiPSCsの運命を導くps。これらの合併症にもかかわらず、hiPSCsの使用は、自己複製能力が高く、軟骨細胞を含む標的細胞に分化する能力があるため、依然として推奨されている6 。 軟骨形成分化は、通常、MSC様前駆細胞を用いて、ペレット培養またはマイクロマス培養などの三次元培養系で行われる。 hiPSCを使用する場合、MSC様前駆細胞を生成するプロトコルは、既存のプロトコルとは異なる。いくつかのグループは、表現型をMSC様細胞に直接変換するために、hiPSCの単層培養を用いる。しかし、ほとんどの研究では、EBを用いてMSC8,9,10,11に似た外殖細胞を生成しています。 様々なタイプの成長因子を用いてコンドロゲを誘導するnesis。通常、BMPおよびTGFβファミリータンパク質は、単独でまたは組み合わせて使用​​される。分化は、GDF5、FGF2、およびIGF1などの他の因子によっても誘導されている12,13,14,15。 TGFβ1は、MSCs 16において用量依存的に軟骨形成を刺激することが示されている。他のアイソタイプであるTGFβ3と比較して、TGFβ1は、軟骨前軟骨間細胞の凝縮を増加させることによって軟骨形成を誘導する.TGFβ3は、間葉細胞増殖を有意に増加させることにより軟骨形成を誘導する17 。しかし、TGFβ3は、TGFβ1より研究者により頻繁に用いられる7,10,18,19。 BMP2は、ヒトにおける軟骨形成性マトリックス成分に関連する遺伝子の発現を増強するインビトロ条件下での関節軟骨細胞20 。 BMP2は、TGFβタンパク質21と組み合わせてMSCにおける軟骨形成に重要な遺伝子の発現を増加させる21 。 BMP2は、SmadおよびMAPK経路22を介してTGFβ3の効果を相乗的に増強することも示されている22 。 この研究では、CBMC-hiPSCを、低付着ペトリ皿中でEB培地を用いてEBに凝集させた。伸長細胞は、EBをゼラチンコートディッシュに付着させることによって誘導された。外胚葉細胞を用いた軟骨形成分化をペレット培養により行った。 BMP2およびTGFβ3の両方による処理は、細胞を首尾よく凝縮させ、軟骨形成ペレット形成のための細胞外マトリックス（ECM）タンパク質蓄積を誘導した。この研究は、CBMC-hiPSCを用いた単純で効率的な軟骨形成分化プロトコルを示唆している。

<table><tbody><tr><td>プラスチック製品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm ディッシュ</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コーニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コーニカルチューブ</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ディスポーザブルピペット</td><td>ファルコン</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL使い捨てピペット</td><td>ファルコン</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェル プレート</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>Description</td></tr><tr><td>E8 Medium Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>E8 Medium (500 mL)</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>E8 Medium (Conc.: 543 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S5261</td><td>E8 Medium&nbsp;(濃度:14 ng/mL)</td></tr><tr><td>ヒトトランスフェリン</td><td>Σ アルドリッチ</td><td>T3705</td><td>E8 ミディアム (Conc.: 10.7 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>ベーシック FGF2</td><td>ペプロテック</td><td>100-18B</td><td>E8 ミディアム&nbsp;(濃度:100 ng/mL)</td></tr><tr><td>Human Insulin</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>E8 Medium (濃度: 20 &mu;g / mL)</td></tr><tr><td>ヒトTGF&β;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>E8 Medium&nbsp;(濃度:64 &mu;g/mL)</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>strongカタログ番号</td><td>Description</td></tr><tr><td>品質管理材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mmカバーガラス</td><td>優れた</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4%パラホルムアルジヒド</td><td>技術&イノベーション</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ベクターラボ</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗 SSEA4 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>アンチ Oct4 抗体</td><td>サンタクルス</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sox2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-81 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf4 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 抗体</td><td>モレキュラープローブ</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 抗体</td><td>モレキュラープローブ</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>分子プローブ</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong gold退色防止試薬</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルジヒド</td><td>Tech &イノベーション</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ベクターラボ</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗コラーゲンII抗体</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>1:100</td></tr><tr><td>アルシアン ブルー</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A3157-10G</td><td></td></tr><tr><td>ファスト グリーン FCF</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>サフラニン O</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>090m0039v</td><td></td></tr><tr><td>核 ファスト レッド</td><td>Americanmastertech</td><td>STNFR100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>・デュクサン</td><td>115&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>デュクサン</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>メイヤーのヘマトキシリン溶液</td><td>和光純薬工業</td><td>LAK7534</td><td></td></tr><tr><td>DAP</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス コーティング</td><td>ヒョンイル Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマAldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>イソプリピルアルコール</td><td>ミリポア</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>説明</td></tr><tr><td>strong<>軟骨原性分化材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td>軟骨原性培地成分(500 mL)</td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>P4333軟</td><td>骨原性培地成分(濃度:1%)</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A8960</td><td>軟骨形成培地成分(Conc.: 64 &mu;g/mL)&nbsp;</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td>軟骨形成培地成分 (Conc.: 100 mM)</td></tr><tr><td>rhBMP-2</td><td>R&D</td><td>355-BM-050</td><td>軟骨形成培地成分(濃度:100 ng/ml)</td></tr><tr><td>組換えHman TGF-β3</td><td>R&D</td><td>243-B3-002</td><td>軟骨原性培地成分 (濃度:10 ng/ml)</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)</td></tr> <tr><td>ITS+ Premix</td><td>BD</td><td>354352</td><td>軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)</td></tr> <tr><td>デキサメタゾン-水溶性&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915-100MG</td><td>軟骨原性培地成分 (濃度:10-7 M)</td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>軟骨原性培地成分 (濃度: 1%)</td></tr> <tr><td>ピルビン酸ナトリウム溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8636</td><td>軟骨原性培地成分 (Conc.: 1%)</td></tr> <tr><td>L-プロリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607-25G</td><td>軟骨原性培地コンポーネント (40 &mu;g/ml)</td></tr></tbody></table>

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

人間の関節軟骨は、それ自体を修復する能力が欠けている。従って、軟骨変性は治癒的ではなく、保存的治療によって治療される。現在、 エクスビボで増殖した軟骨細胞または骨髄由来間葉系幹細胞（BMSC）を用いて損傷軟骨を再生する努力がなされている。しかしながら、これらの細胞の制限された生存能力および不安定性は、軟骨再建におけるそれらの適用を制限する。ヒトに誘導された多能性幹細胞（hiPSC）は、再生的応用のための新しい選択肢として科学的な注目を集めている。無制限の自己複製能力と多能性を有することにより、hiPSCは、軟骨修復のための新しい置換細胞源として注目されている。しかし、高品質の軟骨形成性のペレットを大量に得ることは、臨床応用への大きな課題です。この研究では、胚様体（EB）由来の外胚葉細胞を軟骨分化のために使用した。成功した軟骨形成は、PCRおよびアルシアンブルー、トルイジンブルー、およびコラーゲンI型およびII型（それぞれCOL1A1およびCOL2A1）に対する抗体で染色した。我々は、臍帯血単核細胞由来iPSC（CBMC-hiPSC）の軟骨形成性ペレットへの分化のための詳細な方法を提供する。

この研究では、EB細胞から伸長細胞を誘導することにより、CBMC-hiPSCから軟骨形成性ペレットを作製した。多分化能が高いことが確認されたCBMC-hiPSCを用いて軟骨形成分化を誘導した11 。我々のプロトコルの簡単なスキームを図1Aに示す 。分化の前に、iPSCコロニーを拡大した（ 図1B ）。拡大されたiPSCをEBとして組み立て、分化を開始した（ 図1C ）。生成したEBをゼラチンコートディッシュに付着させて、伸長細胞を誘導した（ 図1D ）。次いで、伸長細胞を回収し、軟骨形成性のペレットを生成するために使用した。 21日の分化後、小さなビーズ様軟骨形成性のペレットを得て、さらなる特徴付けに使用した（ 図1E ）。 <e...

ここでは、臍帯血単核球由来ヒト由来多能性幹細胞からの軟骨分化のプロトコールを提案する。

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

この手順の全体的な目的は、臍帯血由来の人工多能性幹細胞から軟骨分化ペレットを作製することです。このプロトコルを用いることで、比較的大量の軟骨分化ペレットを作製することが可能です。作製された軟骨分化ペレットは、研究や疾患モデリング、薬剤スクリーニング、および軟骨の性質に関する理解を深めるための研究から臨床への応用に利用できます。ヒトの軟骨は、昨年まで修復に時間がかかるとされていました。そのため、軟骨変性は保存的治療によって対処される必要があります。無限の自己複製能と多能性を備えたヒトiPSCsは、軟骨修復のための新たな代替細胞源として注目されています。手順の実演は、私の研究室の大学院生であるEugene NamとArie Alice Reamが行います。プロトコルを開始するために、15 mLコニカルチューブに血球を回収し、血球計数計を用いて計数します。3 × 10⁵ 個の細胞を準備し、室温で515 ×gで5分間遠心分離します。吸引により上清を除去し、0.5 millilitersの血球用培地で細胞を再懸濁します。次に、細胞を非コートの24ウェルプレートのウェルに移し、製造元の推奨に従ってセンダイウイルス混合液を添加します。プレートを1, 150 times G、30 degrees celsiusで30分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を一晩インキュベートします。翌日、滲出細胞をコード付きマトリックスウェルに移します。プレートを遠心分離します。遠心分離後、上清を除去し、1 mLのiPSC培地を加えて細胞を維持します。培地は毎日交換し、新鮮なiPSC培地を用いてください。ヒト人工多能性幹細胞（HIPSC）を維持します。培地を毎日交換し、新鮮なEssential Eight（E8）培地で置き換えます。100 mLのvitronectinコーティング済みディッシュに、2 × 10⁶個のHIPSCとE8培地を調製します。次に、培養皿からE8培地を取り除き、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞を洗浄します。1 mMのEDTAを1 mL加え、ディッシュを2分間インキュベートします。次に、3 mLのE8培地で細胞を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。室温にて250 ×gで2分間遠心分離します。細胞層を乱さないように上清を吸引し、5 mLのE8培地で細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターで細胞数をカウントした後、100 mmペトリ皿1枚あたり2 × 10⁶個の細胞を準備します。準備した細胞を、10 µMのROCK阻害剤（Y-27632）を含む、E8培地とEB培地を1:1で混合した10 mLの溶液で再懸濁します。細胞を凝集させるため、一晩インキュベートします。翌日、ピペッティングにより凝集したEBを回収します。上清を除去し、10 millilitersの新鮮なE8培地にEBを再懸濁します。生成したEBを5日間拡大培養し、新鮮なE8培地で毎日交換を行う。さらに成熟させるため、培地をE7培地に変更する。EBを37°C、5% CO₂の条件下でさらに5日間維持し、新鮮なE7培地で毎日培地交換を行う。1%ゼラチン6 mLを100 mmディッシュに加え、30分間インキュベートします。ゼラチンを除去し、使用前にこのディッシュを2～3時間完全に乾燥させます。EBを50 mLコニカルチューブに移します。胚様体（EB）をコニカルチューブの底に沈殿させます。EBを乱さないように上清を除去します。次に、20% 胎児牛血清（FBS）を含む、あらかじめ温めておいたDulbecco改良イーグル培地（DMEM）10 millilitersでEBを再懸濁します。EBをゼラチンコーティングした100 millimeterディッシュに移します。10 micromolarのROCK阻害剤を添加します。細胞を7日間培養・維持します。ROCK阻害剤を添加せずに、1日おきに培地を交換します。ディッシュから培養液を吸引します。直ちに1 mMのEDTAを1 mLディッシュに加え、細胞を2分間インキュベートします。次に、20% FBS含有DMEMを5 mL用いて細胞を回収し、新しい15 mLコニカルチューブに移します。室温で250 ×g、2分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを20% FBS含有DMEM 10 mLで再懸濁します。40 µmのセルストレーナーを用いて細胞塊をろ過して除去し、単一細胞を回収します。ヘモサイトメーターを使用して単一細胞をカウントします。その後、細胞を遠心分離します。上清を除去し、15 mL コニカルチューブに 300 µL の軟骨分化誘導培地（CDM）と共に、ペレットあたり 3 × 10⁵ 個の細胞を播種します。ペレット形成のため、細胞を遠心分離し、一晩インキュベートします。3日以内に、ペレットは扁平な球状の形態を示します。ペレットを21日間維持します。包埋の前に、パラフィンを準備し、58 °Cで融解させます。1.5 mLチューブ内で、ペレットを1 mLの4%パラホルムアルデヒドに浸し、室温で2時間固定します。カセットにガーゼを1層敷き、ピペットを用いて固定済みペレットを移します。ガーゼを折りたたみ、カセットの蓋を閉じてペレットを覆います。70% ethanol 100 millilitersを用いて脱水を開始します。80%および95%のエタノールで順次洗浄し、ペレットを脱水します。その後、ペレットを100%エタノールに10分間移します。透徹のために、溶液をエタノールとキシレンの1:1混合液100 mLに交換し、10分間置きます。次に、1:1溶液をエタノールとキシレンの1:2混合液に交換し、10分間置きます。ペレットを100%キシレン中でインキュベートし、残りのエタノールを除去します。パラフィン浸透させるために、ペレットを段階的なキシレンおよびパラフィンの混合液でインキュベートします。パラフィン浸透工程全体を58 °Cで行います。ペレットをキシレンとパラフィンの2:1混合液100 mLに30分間浸漬させます。次に、溶液をキシレンとパラフィンの1:1混合液100 mLに交換し、30分間浸漬させます。次に、溶液をキシレンとパラフィンの1:2混合液100 mLに交換し、30分間インキュベートします。最終浸透のために、ペレットを100%パラフィンの第1バスに移し、2時間インキュベートします。その後、ペレットを100%パラフィンの第2バスに移し、58 °Cで一晩インキュベートします。翌日、ピンセットを使用してペレットを慎重に型へ移します。パラフィンディスペンサーを用いて、型にパラフィンを加えます。4 °Cで30分間、パラフィンを凝固させます。切片を7 µmの厚さで切り出し、スライドガラスに転写します。スライドガラスを一晩乾燥させ、使用時まで室温で保存します。分化させる前に、iPSCコロニーを拡大させました。増幅させたiPSCをEBとして集積させ、分化を開始させました。生成されたEBをゼラチンコートしたディッシュに接着させ、アウトグロース細胞を誘導しました。分化から21日後、小粒のビーズ状の軟骨形成ペレットが得られ、以降の特性解析に使用しました。軟骨分化ペレットの品質を21日目に組織学的に評価し、BMSC軟骨分化ペレットをポジティブコントロールとして用いた。分化した軟骨細胞によって分泌されたECMタンパク質の蓄積を、アルシアンブルー染色およびトルイジンブルー染色により確認した。CDMC HIPSCsから作製された軟骨分化ペレットは、CBMSC HIPCs由来のペレットよりも高いCOL2A1発現を示した。線維性軟骨のマーカーであるI型コラーゲンの発現は、COL2A1の発現と比較して、CBMC HIPSC由来ペレットで低くなっていました。21日目の軟骨分化ペレットにおける軟骨細胞外マトリックスタンパク質の遺伝子発現をリアルタイムPCRで確認しました。CBMC HIPSC由来ペレットのアグリカン発現は、BMSC由来ペレットと同程度でした。臍帯血単核細胞由来iPS細胞を軟骨分化ペレットへ分化させるための詳細な手法を提示しました。この技術を習得し、適切に実施すれば、2か月で完了させることができます。このビデオを視聴することで、iPS細胞から軟骨分化ペレットを生成する方法について十分に理解できるはずです。

chondrogenic-pellet-formation-from-cord-blood-derived-induced

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

機械的ストレスは幹細胞の軟骨分化を誘発し、損傷した軟骨の修復のための潜在的な治療アプローチを提供します。遠心重力(CG)を使用して脂肪由来幹細胞(ASC)の軟骨形成分化を誘導するプロトコルを提示します。CGによるSOX9のアップレギュレーションは、軟骨原性表現型の発症をもたらします。...

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。...

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

我々は、胚様体（EB）形成、線維芽細胞増殖および軟骨形成誘導を含む無組み込み法を用いて、誘導末梢血（PB）から誘導された多能性幹細胞（iPSC）を介して軟骨系統を生成するためのプロトコールを提示する。...

末梢血由来ヒト誘導多能性幹細胞からの軟骨細胞の分化

これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス...

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in...

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

このプロトコルでは、ヒトiPS細胞を間葉系間質細胞(MSC)に分化させるための2つの代表的な方法を説明し、比較します。単層法は、低コスト、操作の簡便さ、骨形成の分化の容易さを特徴としています。胚様体(EB)法は、時間消費が少ないという特徴があります。...

ヒト人工多能性幹細胞から間葉系間質細胞への分化のための2つの代表的な方法の比較

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。...

フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

本研究では、重力を利用して低接着条件下で細胞をスフェロイドに凝集させ、得られたスフェロイドをミニバイオリアクターで培養することにより、軟骨球性スフェロイドを作製する方法について述べています。...

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。...

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

学ぼう、臍帯血由来iPS細胞から軟骨形成ペレットを作製する手法。本プロトコルは再生医療や軟骨修復研究に応用可能で、疾患モデリングや創薬スクリーニングにも活用できます。

臍帯血由来誘導多能性幹細胞からの軟骨形成ペレット形成

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