エントリのモードと抗真菌植物のディフェンシンの細胞内局在を検討する真菌細胞の生細胞イメージング

植物のディフェンシンは、病原体に対する植物の防衛のために重要な役割を果たします。アクション (MOA) の彼らのモードについての抗真菌剤としてこれらの抗真菌ペプチドの有効利用は重要なです。ここでは、これらのペプチドの MOA の重要な側面を研究する生細胞イメージング法を説明します。

この生細胞イメージング法の全体的な目標は、真菌細胞における抗真菌植物ディフェンシンの作用機序の重要な側面を研究することです。高度な共焦点顕微鏡技術の出現により、生細胞イメージングは、抗真菌性植物ディフェンシンの作用機序を研究するための強力なツールになりました。この技術を利用して、抗真菌植物ディフェンシンの作用機序を理解する上で重要な質問に答えるのに役立つ方法を紹介します。

私たちの焦点は、これらのペプチドが真菌細胞にどのように取り込まれるか、そしてこれらのペプチドがどのように細胞小器官に局在するか、または細胞質内で拡散するかです。Fusarium graminearumのPH-1株の針分懸濁液を作るには、まず、完全な培地を含むプレート上に菌株の培養物を設定します。摂氏28度で5日間かけて培養します。

分生子を作製するには、5日齢の培養液の直径10ミリメートルのプラグ4つを50ミリリットルのカルボキシメチルセルロース培地に接種します。これらのプラグを摂氏28度で4〜7日間、180rpmに設定されたロータリーシェーカーで培養します。培養物が赤い色になると、分生子が形成されています。

分生子を懸濁液に集めるには、液体培養物をボルテックスし、その1ミリリットルを2層のろ過材料でろ過し、2ミリリットルの微量遠心チューブに入れます。懸濁液を2分間遠心分離し、上清を捨てます。その後、ペレットを1ミリリットルの滅菌水で洗浄し、遠心分離を繰り返します。

次に、ペレットを1ミリリットルの2x SFMに再懸濁します。次に、血球計算盤を使用して分生子を数え、懸濁液の密度を100, 000分生子/ミリリットルに調整します。Neurospora crassa 分生子懸濁液を作製するには、分生子をストック培養物からVogelの寒天培地が入った傾斜チューブに移し、チューブを室温で5日間一定の光の下でインキュベートします。

5日後、接種ループを使用して、少量の増殖培養物を2ミリリットルのVogel液体培地を含むマイクロ遠心チューブに移します。分生子をループから混ぜてください。次に、懸濁液をろ過し、遠心分離機にかけ、分生子のペレットを洗浄ステップなしでVogelの培地に再懸濁します。

最後に、最終的なサスペンションをミリリットルあたり 100 、 000 分子に調整します。共焦点顕微鏡用のgermlings調製物を作るには、50マイクロリットルの分生子懸濁液を35ミリメートルの培養皿にピペットで移し、分生子を室温で3〜6時間発芽させます。共焦点顕微鏡法では、50マイクロリットルの針分懸濁液をガラス底皿の10ミリメートルマイクロウェルにピペットで移します。

次いで、所定の最小阻害濃度で、50マイクロリットルの蛍光標識ディフェンシンを懸濁液に加え、標識されたディフェンシンと共に分生子を室温で2.5時間インキュベートする。インキュベーション後、2マイクロリットルの膜選択性色素FM4-64を添加し、最終濃度を5マイクロモルにします。次に、分生子を検査する前に、室温で30分間培養物をインキュベー

共焦点顕微鏡をセットアップするには、白色光レーザーを選択します。488ナノメートルと550ナノメートルのレーザーを使用して、それぞれロダミン標識ディフェンシンとFM4-64色素を励起します。これらのレーザーを強度を1%に設定し、次に、検出波長をロダミン標識ディフェンシンの場合は580〜700ナノメートルに、FM4-64色素の場合は690〜800ナノメートルに設定します。

次に、画像を収集します。タイムラプスイメージングの場合は、50マイクロリットルの分生子懸濁液をガラス底のマイクロウェル皿に加えます。次に、マイクロウェルディッシュを顕微鏡に取り付け、低電力で細胞を見つけます。

次に、100x、1.44の石油対物レンズに切り替えます。DyLight550で標識されたディフェンシンを観察するには、レーザーラインを励起用に550ナノメートルに、検出用に560〜600ナノメートルに設定します。次に、スキャンモードをxyztに設定します。

次に、必要に応じて、Z位置、ズーム、画像キャプチャの頻度などを設定します。次に、分生子懸濁液に、3マイクロモルの最小阻害濃度で50マイクロリットルの蛍光色素標識ディフェンシンを添加し、2マイクロリットルの膜選択性色素FM4-64を添加して最終濃度を5マイクロモルにします。次に、必要に応じて光学系の焦点を合わせ直します。

画像を撮影する前に、湿った濾紙をマイクロウェル皿に入れて蒸発を防ぎます。次に、2.5時間かけて3.5分ごとに画像をキャプチャして処理します。Medicago truncatula由来の2つのディフェンシンの内在化と細胞内局在を追跡し、比較するために、生細胞イメージングを実施しました。

化学的に合成されたロダミン標識ディフェンシン4は、Neurospora crassaとFusarium graminearumで異なる方法で取引されました。FM4-64は、両方の真菌の原形質膜を標識しました。しかし、フザリウムでは、ディフェンシン4が細胞質に拡散しています。

一方、ニューロスポラでは、小胞体に運ばれます。比較のために、Neurospora crassaのDyLight550標識とFM4-64による原形質膜標識を用いて、ディフェンシン5を可視化しました。タイムラプスイメージングは、このディフェンシンが30〜40分以内に細胞に入り、その後細胞質を通って拡散することを示しています。

これは、細胞に入り込み、3時間後も小胞体内に閉じ込められたままのディフェンシン4の人身売買とは異なります。要約すると、生細胞イメージングは、抗真菌植物の違いの作用機序についての理解を深めるための強力なツールです。他の重要な蛍光色素や細胞マーカーとともに、他の抗菌ペプチドに修飾する柔軟性があります。

最終的に、この技術は、農業や医療における抗菌ペプチドを抗真菌剤として使用するための新しい戦略の開発に役立つ可能性があります。