そのセンターの蛍光質量イメージングによるゴルジ体タンパク質の量的なローカリゼーション

このイメージングベースの手法の全体的な目標は、ナノメートル分解能でゴルジ体タンパク質を定量的に局在することです。この方法は、ゴルジ体の構造や仕組みなど、研究における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法の主な利点は、従来の光学顕微鏡とソフトウェアツールを使用していることです。

まず、HeLa細胞をDMEMのT25フラスコで培養し、10%FBSを補足して培養し、37度C、5%二酸化炭素で培養します。細胞が約80%のコンバーシティに達したら、培養培地を吸引し、フラスコに25%トリプシンEDTAを1ミリリットル加えます。細胞を37度で2分間培養します。

細胞をインキュベーターから取り出し、1ミリリットルの完全な培地を加えてフラスコの壁から細胞を優しく洗い流します。剥離した細胞を無菌遠心分離管に移し、500gで2分間回して細胞をペレット状にします。上清液を吸引した後、1ミリリットルの全培地を使って細胞ペレットを懸浮させます。

滅菌ガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、約100,000個のセルをウェル内にシードします。ウェルの体積を5ミリリットルまで補充するために、完全な培地を使いましょう。次に、5%の二酸化炭素を含む37度の環境で培植します。

細胞が80%のコンフルエンスに達したら、80ナノグラムのGalT-mCherryと320ナノグラムのTPST1-EGFPプラスミドDNAおよびトランスフェクション試薬を用いて、製造元のプロトコルに従って細胞をトランスフェクトします。細胞を4〜6時間培養した後、培地を交換し、細胞をインキュベーターに戻して12時間過ごします。培地を井戸で吸引し、33マイクロモールドのノコダゾールを5ミリリットル追加し、37度摂氏、5%二酸化炭素で3時間培養します。

テキストプロトコルに従ってガラスカバースリップを洗浄した後、1マイクログラム/マイクロリットルのBSAを含むPBSを1回使い、110ナノメートルの多色蛍光ビーズを80倍に希釈します。ビーズアグリゲージを分散させるために、短時間チューブをボルテックスさせます。ピペットの先端を使って、薄めたビーズ60マイクロリットルをきれいなカバーのスリップに塗ります。

暗闇ではカバースリップを35ミリの皿に入れ、アルミホイルで覆います。カバーを暗闇の中で乾燥させ、真空ポンプに接続した乾燥機で拭き取ります。次に50マイクロリットルのマウントメディウムを使ってカバースリップをガラススライドに取り付けます。

適切に清潔なカバースリップは蛍光のゴミを除去するために不可欠です。緑、赤、遠赤のチャンネルで多色ビーズを撮影するには、撮影セッションの開始時に3D画像のスタックを取得し、最適な焦点面の上下の3セクションを撮影します。スタックをTIFFファイルとして保存してください。

ゴルジミニスタックを画像化するには、蛍光標識スライドでトランスフェクトしたTPST1-EGFPとGalT-mCherryを用いて、TPST1-EGFPおよび低または中レベルのGalT-mCherryを発現する細胞を探します。先ほど示した3D画像スタックを取得してください。画像を解析するには、画像Jを開き、「ファイル」「画像」「開く」を選択し、3つのTIFFファイルからなるビーズ画像のセットを開きます。

赤いチャンネルで最も焦点が合ったセクションの周りで、画像、スタック、Zプロジェクトを選択し、3連続したセクションを平均化します。開始スライスと停止スライスのセクション番号を入力し、投影タイプの中から平均強度を選択します。画像にビーズを含まない背景のROIを描く。

次に「分析、測定値を設定」では、平均グレー値と標準偏差(SD)のみをチェックします。「分析」「測定」を実行し、背景平均強度と標準偏差を取得します。「プロセス」「数学」「減算」を選択して、背景平均強度に標準偏差の6倍を加えた画像を差し引きます。次に、このチャネルに対応する計算値を入力します。

同じ開始・終了スライスと同じ背景ROIを使って、緑と遠赤チャネルの画像スタックで平均化と減算を繰り返します。画像、カラー、チャンネルを統合する方法で、チャンネルRを赤、チャンネルGを緑、チャンネルBを青を選択し、3つの処理済み画像をマージします。分析、ツール、ROIマネージャーを選択してROIマネージャーを起動します。

単一のビーズに正方形のROIを描きましょう。その後、キーボードのTキーを押してROIマネージャーにROIを追加します。「分析、測定設定」では重心のみをチェック。

ROIマネージャーでチャネルRを選択し、「測定」をクリックすると、結果ウィンドウ内のROI中心のX座標とY座標を取得します。2つの列をコピーしてスプレッドシートに貼り付けます。チャネルGとチャネルBのROI中心座標を取得します。スプレッドシートをbeads.csvとして保存してください。

画像Jでは、プラグインをインストールして2つのマクロ、マクロゴルジのROI検査、マクロ出力の3チャンネルデータをインストールします。ROIマネージャーと結果ウィンドウをクリアしてください。3つのTIFFファイルからなるゴルジミニスタック画像のセットを開きます。

このビデオの前半で示したように、後で使うために背景の引き算画像を生成します。そして画像を複製します。「プロセス」の画像計算機で、背景を差し引いたチャンネルG、チャンネルR、チャンネルB画像を追加してください。

画像→調整→閾値の「Image→Adjust→Threshold」で「Set to input 1」を最低閾値レベルとして選びます。「Analyze」→「Analyze Particles」の中で、ピクセルのサイズ範囲も入力してください。50を無限大に入力し、エッジの除外を確認し、マネージャーに追加します。

次に、Image, Color, Merge Channelsを使って、以前に生成された3つの背景減算画像を合成します。これは、チャンネルRを赤、チャンネルGを緑、チャンネルBを青として選択することで合成されます。次に、プラグイン、マクロ、ゴルジROI検査を選択してマクロの高ルジROI検査を実行します。画像セット内に単一のゴルジミニスタックを含むROIをできるだけ多く選択することが重要です。

「分析、測定値を設定」では、面積、平均グレー値、重心のみをチェック。マクロツールを起動してデータを取得します。3チャンネルデータを出力します。ここに記載された順序で中心座標をスプレッドシートにコピーしてください。

その後、スプレッドシートをministacks.csvとして保存してください。中心のクロマティックシフト補正と、テキストプロトコルに基づく局在性商(LQ)の計算に進みます。ここで使われているような単純なアポクロマティックレンズを備えた現代の研究用光学顕微鏡は、色のシフトが最小限に抑えられます。

しかし、多色のビーズの画像を注意深く調べると、それが明らかになります。赤色蛍光の中心はビーズの真の位置として定義されます。緑色蛍光と遠赤蛍光の相対的な色のずれはベクトルで表現できます。

イメージング面内の色ずれは、各ビーズの緑色と青色のベクトルで示されています。ここで示すように、クロマチックシフト補正はクロマチックシフトを大幅に減少させます。哺乳類の細胞では、ゴルジ体複合体は核周囲に集まり、従来の光学顕微鏡では通常分解できません。

ノコダゾール治療後、核周ゴルジ体は消失し、細胞質内の小胞体の出口部位に数十のゴルジミニスタックが集まります。このビデオで示された画像解析を用いて生成された例画像をここに示します。マクロゴルジROI検査ツールを用いて、40の選定されたゴルジミニスタックがリストアップされました。

3つの基準を適用した後、21のゴルジミニスタックを解析し、TPST1-EGFPのLQ計算に用いられました。一度習得すれば、蛍光標識後1時間でこの技術を行うことができます。この方法の開発後、この方法はゴルジ体を研究する研究者が、免疫電子顕微鏡と同等の解像度でゴルジタンパク質を定量的に局在させることへの道を開きました。