madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

このイメージングプロトコルの全体的な目的は、単分子局在化顕微鏡法を用いて、活性化T細胞における複数のタンパク質を可視化することです。この手法は、TCRまたはマイクロクラスター構成成分の単分子分布など、T細胞活性化分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、現在のスーパー解像度顕微鏡法で達成可能なレベルよりも、高度なマルチプレックス化が可能であることです。

まず、メーカー提供のラベル化プロトコルに従い、Alexa 647 抗体ラベル化キットを用いて、抗体を Alexa 647 染料で直接標識します。標識した抗体を 20,800 ×g で 5 分間遠心分離します。遠心分離後、上清を回収して凝集した抗体を除去します。次に、A12 カバースリップチャンバーを 0.1% poly-l-lyzine 250 µL で 15 分間コーティングします。

次に、洗浄せずに溶液を吸引し、チャンバーを65 degree celsiusで30分間乾燥させます。PBSを用いて100 nanometerの蛍光ナノダイヤモンド（FNDs）の希釈液を調製し、各視野で十分な量のFNDsが観察できることを確認するため、さまざまな希釈倍率でテストします。希釈したFNDsを1分間ボルテックスします。

次に、FND上清を高い出力設定で30秒間超音波処理します。超音波処理したFND上清を、poly-l-lyzineコート済みのA12カバースリップチャンバーに入れ、室温で30分間インキュベートします。チャンバーを1x PBSで5回洗浄した後、turf顕微鏡を用い、647 nanometerのレーザー励起でFNDコートされたチャンバーを可視化します。

100倍の対物レンズを使用して、61 by 61 micronの視野を確保します。FNDを適切に希釈していれば、視野内に4個から10個の個別のFNDが見え、撮像視野の各象限に少なくとも1個のFNDが存在している状態が理想的です。FNDの適切な密度が達成されたら、各ウェルに250 microlitersのanti-CD3抗体を添加します。

チャンバーを37 °Cで1時間、または4 °Cで一晩インキュベートします。インキュベーション後、ウェルから溶液を除去し、1x PBSを加えて30秒間洗浄します。この洗浄ステップを5回繰り返します。

1 mLのJurkat T細胞を800 ×gで6分間遠心分離します。遠心前に、Jurkat T細胞の濃度は理想的には0.5〜1 × 10⁶ cells/mLである必要があります。細胞を300 µLの1x HBS溶液で再懸濁します。

その間に、チャンバーの各ウェルに1x HBS溶液を150 µLずつ加え、37 °Cで15分間インキュベートします。次に、再懸濁したJurkat T細胞を各ウェルに50 µLずつ加え、37 °Cで3分間インキュベートします。続いて、4%パラホルムアルデヒドを各ウェルに300 µLずつ加え、37 °Cで30分間インキュベートします。

1x PBSで3回洗浄した後、0.1% Triton x溶液250 µLを加え、室温で5分間細胞を透過処理します。さらに1x PBSで3回洗浄した後、各ウェルに1%魚ゼラチン溶液250 µLを加え、室温で30分間静置します。最後に、細胞を1x PBSでさらに3回洗浄します。

0.1～0.5 µg/mLに調製した標識抗体200 µLを固定細胞に加え、室温で1時間反応させます。細胞を1x PBSで5回洗浄した後、STORMバッファー1 mLを加え、露出を制限するためにチャンバーをガラスカバースリップで覆います。顕微鏡ステージ上のクランプを使用して、カバースリップチャンバーを所定の位置に固定してください。

洗浄とインキュベーションを数回繰り返した後も、同一の視野を維持する必要があるため、このステップは大スケールのマルチプレックス解析において極めて重要です。ターフモードで647 nmレーザーの出力を低く設定し、視野内に少なくとも3つのFNDを含む染色細胞を特定します。その後、647 nmレーザーの出力を上げて画像をキャプチャします。

標準的なパラメータはテキストプロトコルで確認できます。細胞を1x tris-buffered salineまたは1x TBSで5回洗浄します。その後、溶出バッファーを1 mL加え、室温で1分間インキュベートします。

溶出を3回繰り返します。各抗体について指定された正確な溶出条件およびシグナルを除去するために必要な回数の溶出リンスを使用してください。その後、細胞を1x TBSで3回洗浄し、1x PBSを1 mL添加します。

この溶出ステップを適切に実行することで、あらかじめ結合した抗体が除去され、その後の抗体標識の効率を高めることができます。溶出ステップ間の沈殿を最小限に抑えるために、洗浄にはTBSを使用することが重要です。647 nmのレーザーを高出力で使用して細胞をフォトブリーチし、同時に405 nmのレーザーを2〜5 mWで使用して、ダーク状態にあるAlexa 647色素を光活性化させます。

未溶出した抗体からの残存信号がすべて光退色するまで待ちます。通常、これには2～5秒間のレーザー照射が必要です。溶出および光退色の後、STORM設定を用いてサンプル画像を撮影し、信号が除去されたことを確認します。

次に、4% paraformaldehydeを250 µL加え、15分間置きます。これにより、細胞内で固定された分子の逆架橋を防ぎます。その後、1x PBSで細胞を3回洗浄します。

複数の標的を逐次的に標識するために、これらの手順を繰り返します。最後に、テキストプロトコルに記載されている通り、マルチプレックス画像スタックのドリフト補正およびアライメントを行います。活性化したJurkat T細胞内のマイクロクラスターおよびその他の構造のマルチプレックスMET STORM画像を作成するために、sequential illusionおよびstanding法が用いられました。

最終的なMET STORM画像は、平均フィデューシャル補正とFNDフィデューシャルマーカーを用いて、ドリフト補正およびアライメント補正が行われています。ここでは、平均フィデューシャル補正によるドリフト補正前後における、30,000枚の画像フレームに局在する単一FNDの単一分子局在化顕微鏡画像を示します。同様に、ここでは、抗リン酸化SLP76抗体とFNDフィデューシャルマーカーで染色した活性化Jurkat T細胞の単一分子局在化顕微鏡画像について、平均フィデューシャル補正によるドリフト補正前後を示します。

このビデオを視聴することで、MET STORMを用いて活性化T細胞内のタンパク質のマルチプレックス超解像イメージングを行う方法について十分に理解できるはずです。この手法を習得すれば、マルチプレックスの1ラウンドあたり3時間で完了させることができます。この手順を行う際は、顕微鏡ステージ上の試料の位置を常に一定に保つことが重要です。

これはステージクランプを使用して行うことができます。当社の改良版STORMバッファーを用いた作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実施する際は、呼吸用保護具やゴーグルなどの予防措置を必ず講じてください。