Name: In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 学ぶテロメア長の直接定量法。in-gelハイブリダイゼーションを用いた改良型TRF解析により、キロベース単位で平均テロメア長を正確に測定し、老化研究や細胞生物学の比較研究に応用できます。

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著者らは、P30CA047904賞の一部が支持されているピッツバーグ癌研究所生物行動学腫瘍学部共用施設の支援を認めている。

<ol><li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="https://utsouthwestern.influuent.utsystem.edu/en/publications/analysis-of-telomeres-and-telomerase">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 18 Unit 18 16(2003).</li>
<li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Restriction+Fragment+%28TRF%29+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li>
<li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+Telomerase%3A+The+Means+to+the+End+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li>
<li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Discovery%3A+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li>
<li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Ends%3A+Just+the+Beginning+%28Nobel+lecture%29%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li>
<li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres%2C+Aging%2C+and+Plants%3A+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review%5BTitle%5D)+AND+%22Gerontology%22%5BJournal%5D)">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li>
<li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres-Structure%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li>
<li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64(2016).</li>
<li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , Epub ahead of print (2016).</li>
<li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+%28Albany+NY%29%22%5BJournal%5D)">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li>
<li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere-Associated+Aging+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , Epub ahead of print 1568-1637 (2016).</li>
<li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li>
<li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Telomere+Biology%3A+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging%2C+Disease+Risks%2C+and+Protection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li>
<li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length%3A+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li>
<li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li>
<li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li>
<li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TECHNICAL+ADVANCES%3A+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ecol+Resour%22%5BJournal%5D)">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li>
<li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li>
<li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+telomere+sequences+in+birds%3A+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Cell+Genet%22%5BJournal%5D)">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li>
<li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+%28flow+FISH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li>
<li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+in+epidemiology%3A+a+biomarker+of+aging%2C+age-related+disease%2C+both%2C+or+neither%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li>
<li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214(2015).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

電気泳動後、ゲノムDNAスミアは800bpより高い。これは、制限酵素が欠損している場合、または（上記のような）追加の酵素が必要な場合に発生する可能性があります。もう一つの可能​​な説明は、タンパク質が依然としてDNAに結合していることである。分光光度計によりDNA濃度を決定する場合、260/280比は約1.8であるべきである。この比が&lt;1.5である場合、制限酵素消化を妨害し得るタンパク質混入が存在する。 DNAサンプルを再単離する必要があるか、またはタンパク質をプロテイナーゼK消化およびフェノール：クロロホルム抽出およびその後のエタノール沈殿により除去する必要がある。市販のDNA単離キットを使用すると、日常的には、260/280の比が1.8〜1.85のDNAが得られる。 ゲルの蛍光体スクリーンへの曝露の後、テロメア断片は検出されない。これは、貧弱なラジオ標識テロメアプローブ、不適当なハイブリダイゼーション条件またはゲノムDNAの開始量が不十分である。テロメアプローブを調製する場合、G-25カラムの遠心分離の終わりに、フロースルー（放射標識テロメアプローブを表す）において容易に...

テロメアは、染色体の末端に位置し、細胞遺伝情報を保護するのに重要な役割を果たす配列TTAGGG（ヒト染色体上）のヌクレオチド反復である3,4,5 。テロメアは、数千塩基対の長さであり、DNA複製の間、染色体の残りの部分の完全性を保護するのに役立つ。染色体の複製は完全ではないので、染色体の末端が完全にコピーされない。この複製の非効率性は「複製終了の問題」と呼ばれ、複製の各ラウンド6,7の間にいくつかのテロメア反復の損失をもたらす。テロメア長は、失われたテロメア配列8,9を置換する酵素であるテロメラーゼによる細胞分裂後に回復することができる。しかし、テロメラーゼは、ほとんどのヒト体細胞において活性化され、結果として、時間の経過と共にテロメアが短くなり、最終的に細胞の老化が起こる。テロメア短縮のために、テロメアは加齢および加齢性疾患のリスクのバイオマーカーとみなされている11,12 。さらに、テロメアの長さは、テロメアの長さが毒物学的、疫学的および行動学的研究におけるバイオマーカーとしての役割を果たすことができることを示す、遺伝的、環境的、および生活習慣因子および酸化的ストレスなどの他の刺激によって影響され得る13,14,15。 この記事では、Mender and Shay 2およびKimura et al。から適応された改変されたターミナル制限フラグメント（TRF）分析を用いてテロメア長を測定する技術を示す。 16 、Herbert、Shay、Wrigに似ていますht 1とHaussmannとMauck 17 。伝統的に、TRF分析はサザンブロット手順を含む。サザンブロットは、テロメアの長さを研究するための「ゴールドスタンダード」と考えられ、疫学研究では白血球テロメアの長さを調べるために積極的に使用されている18 。このTRF分析は、消化したゲノムDNAを用いてテロメア反復を残す。その後、DNA断片をゲル電気泳動により分離し、変性させてニトロセルロース膜に転写する。テロメア配列は、テロメアオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズする。分離したテロメアを膜に転写するのではなく、他のTRF技術はDNAの変性の有無にかかわらずゲル内ハイブリダイゼーション技術を使用する。いくつかの種で報告されている間質性テロメアの検出を考慮する場合、変性の包含は重要である19 。変性工程がない手順では、一本鎖DNAは末端テロメアにオーバーハングし、間質テロメア配列には結合しない18 。 TRF分析の他に、テロメアの長さを測定するためのいくつかの他の方法があり、それぞれに長所と短所があります。 Flow-FISH法は、フローサイトメトリー16,20を用いて別個の細胞型の個々の細胞の平均テロメア長を測定することができる。 Flow-FISHは高価で、効率が悪く、新鮮なサンプルと高度な技術を必要とする技術者を必要とし、疫学研究の能力が限られています16 。さらに、この方法は、細胞集団における染色体数の潜在的変化を説明していない。別の技術、qPCRは、疫学研究のためのテロメア長の測定手段として広く受け入れられている<sup class = &quot;xref&quot;&gt; 16であり、他の方法と比較してDNAの量が少なくて済み、高スループットで低コストであることが要求されます。しかしながら、qPCRは、単一のコピー遺伝子に対する平均テロメアDNA含量のみを測定することができ、したがって、平均テロメア長の間接的推定である。また、サザンブロットと比較して、比較研究において高いばらつき係数が得られ、疑わしい精度21につながる。 TRF手続きには、いくつかの研究での使用を制限する独自の欠点があります。 TRF法は、他の方法と比較して大量のDNAを必要とする（サンプルあたり2〜3μg）。これは、十分なゲノムDNAを収集することができ、分解されたDNAサンプルに使用することができない臨床サンプルのテロメア長を調べることへのこの技術の適用を制限する。さらに、TRF分析は費用がかかり、労働集約的であり、結果を得るのに4~5日を要する。しかし、TRFは、低い分散係数をもたらすその再現性を付与する。このプロトコールは、従来のサザンブロット（ in situゲルハイブリダイゼーションを利用する ）とは異なるが、2つの技術は基本的に同じである。 ここに示す技術は、サザンブロットとイン・ゲルハイブリダイゼーションの組み合わせである。サザンブロットからのDNA変性工程をイン・ゲル・ハイブリダイゼーションと関連付ける工程。この組み合わせは、サザンブロットと比較して改善されたプローブシグナル強度の利点を有し、我々の研究室で定量可能な結果を​​一貫して得ている。さらに、化学発光プローブではなく放射能プローブを使用することにより、シグナル強度が高くなり、蛍光イメージング装置による可視化と定量が可能になり、TRFの分析がユーザーフレンドリーになります。

<table><tbody><tr><td>Biologics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rsa1、制限酵素</td><td>New England Biolabs, Inc</td><td>R0167S</td><td>10,000 U/mL、DNA消化&nbsp;Cutsmart Buffer(消化バッファー)</td></tr><tr><td>Hinf1、制限酵素</td>New <td>England Biolabs, Inc</td><td>R0155S</td><td>10,000 U/mL、DNA消化が付属しています。Cutsmart Buffer(消化バッファー)が付属</td></tr><tr><td>Seakem GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50071</td>電気<td>泳動グレードアガ</td></tr><tr><td>ロースオプチキナーゼ&nbsp;</td><td>affymetrix</td><td>78334X 500 UN</td><td>T4 Polynucleotide Kinase</td></tr><tr><td>SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S7567</td><td>Syber Green</td></tr><tr><td>exactGene DNA Ladder 24- kB</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2580100</td><td></td></tr><tr><td>C-Strand Probe (3'-(G3AT2)4-'5)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>カスタムオーダー DNA オリゴヌクレオチド</td></tr><tr><td>Gamma-ATP-P32</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z</td><td>放射性同位元素</td></tr><tr><td>Qiagen 血液および細胞培養 DNA ミニキット</td><td>Qiagen</td><td>13323</td><td>DNA 抽出キット</td></tr><tr><td>GE Illustra Microspin G-25 カラム</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>27-5325-01</td><td>既活性オリゴプローブ</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td></td><td></td><td>非イオン性合成ポリマー</td></tr>の精製用<tr><td>機器/ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Owl A5 ゲル電気泳動システム (20 cm x 25 cm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>Horizon 11.4 ゲル電気泳動システム (11 cm x 14 cm)</td><td>Corel Life Sciences</td><td>11068020</td><td>ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ、50、12インチ x 12インチ</td> <td>Ted Pellam, Inc</td><td>41-12105</td><td></td></tr><tr><td>GE Storage 蛍光体スクリーン</td><td>GE Healthcareライフサイエンス</td><td>28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>蛍光体スクリーン露光カセット</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>63-0035-44</td><td></td></tr><tr><td>アイソテンプ ハイブリダイゼーション インキュベーター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-247-20Q</td><td></td></tr><tr><td>円筒形ハイブリダイゼーションチューブ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-247-300</td><td></td></tr><tr><td>ベリーダンサー オービタルシェーカー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z768499-1EA</td><td>オービタルシェーカー</td></tr><tr><td>タイフーン9400</td><td>ABI</td><td></td><td>ゲルや蛍光体スクリーンのイメージング用</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 6</td><td>GraphPad</td><td>バージョン6.05</td><td>グラフ作成プログラム</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Office 365</td><td>スプレッドシートプログラム</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrp 2000</td><td>分光光度計</td></tr></tbody></table>

in-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

テロメアの長さを測定するには、それぞれに長所と短所があります。従来のアプローチであるテロメア制限フラグメント（TRF）解析は、ゲノムDNAサンプルを制限酵素で消化し、テロメアDNAリピートといくつかのサブテロメリックDNAを残すDNAハイブリダイゼーション技術を利用しています。これらをアガロースゲル電気泳動で分離し、フィルター膜に移し、テロメア制限断片を視覚化するために化学発光または放射能のいずれかで標識されたオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズさせる。このアプローチは、PCRのような他の技術よりも多量のDNAを必要とするが、細胞集団のテロメア長分布を測定することができ、絶対キロベースで表される測定を可能にする。この原稿は、テロメアの長さを決定するための修飾されたDNAハイブリダイゼーション手順を実証している。まずゲノムDNAを制限酵素（切断しないテロメア）、アガロースゲル電気泳動で分離した。次いで、ゲルを乾燥させ、DNAを変性させ、放射標識オリゴヌクレオチドプローブにその場でハイブリダイズさせる。このin situハイブリダイゼーションにより、テロメアDNAの消失が回避され、シグナル強度が改善されます。ハイブリダイゼーション後、ゲルを蛍光スクリーンを利用して画像化し、テロメア長をグラフプログラムを用いて定量する。この手順は、Drsの研究所によって開発された。テキサス大学南西部1,2 での Woodring WrightとJerry Shay。ここでは、いくつかの変更を加えて、この手順の詳細な説明を示します。

細胞株BJ-hTERT（テロメラーゼ不死化ヒト包皮線維芽細胞） 22およびヒト末梢血単核細胞（PBMC）から単離された3つの濃度のDNA（1,2および3μg）をテロメア長について分析した。 表1は、各DNAサンプルのレーン割り当てを示す。 図1は、ゲルの核酸蛍光染色を示す。分子量標準がはっきりと見える。ゲルの上部から各分子量標準までの距離を測定した（ 図2 ）。 図3は、テロメアプローブとのハイブリダイゼーション後のゲルのリン光を示す。テロメアバンドは、各レーンに塗抹標本として示される。各レーンと1つのバックグラウンドレーンに150ボックスのグリッドを計算しました（ 図4 ）。分析の分野は、各サンプルセットのテロメアバンドを含むゲルを<strong cla...

この記事では、テロメアの長さを迅速かつ効率的に直接測定できる改良されたターミナル制限断片解析を使用してテロメアの長さを定量化するための詳細なプロトコルについて説明します。この技術は、テロメアの長さを定量するためのDNAの様々な細胞源に適用することができる。

In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

この手順の全体的な目的は、Jerry W. Shay博士、Woodring Wright博士および同僚らによって記述されたテロメア制限断片分析法の改変版を用いて、真核細胞におけるテロメアの長さを測定することです。テロメア長に関するデータを提供することで、この手順は細胞生物学、行動医学、疫学、感染症、ならびに年齢、ストレス、薬剤治療、感染の影響に関する疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、さまざまな細胞における平均テロメア長をキロベース（kb）単位で直接測定できることです。分析対象のゲノムDNAサンプルは、テキストプロトコルに記載されている通り、市販のDNA抽出キットを用いて細胞から抽出しました。ゲノムDNAの消化を、最終容量20～40 µLで行います。各マイクロ遠心チューブに以下を合わせてください：3 µgのゲノムDNA、10x DNA消化緩衝液、1 µLのRsa1制限酵素、1 µLのHinf1制限酵素、および最終容量まで加えた滅菌脱イオン水。チューブの底にすべての成分が集まるように、短時間遠心分離します。消化液を37°Cで少なくとも16時間インキュベートします。この手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている方法で0.6%アガロース溶液を準備してください。ゲル電気泳動システムをゲルのキャスティング用に準備します。キャスティングトレイにエンドゲートを取り付けます。アガロースゲル溶液が50°Cまで冷却されたら、それをキャスティングトレイに注ぎ、ゲルの中にコーンを配置し、蓋をせず室温で45分間放置してゲルを凝固させます。キャスティングトレイからエンドゲートを取り除き、ゲルからコームを取り出します。電気泳動装置の充填線まで電気泳動バッファーを満たし、ゲルが完全にバッファーに浸かっていることを確認します。ゲルのウェルにDNAサンプルをロードし、サンプル間には空のウェルを1つ設けてください。ゲルの両端にあるウェルにDNAラダーを10 µLずつ加えます。DNAを速やかにゲル内に移動させるため、150 Vで30分間、ゲル電気泳動を行います。30分後、電圧を57 Vに調整し、18〜24時間泳動させます。ゲルを18〜24時間泳動させた後、電気泳動装置の電源を切り、電気泳動バッファーからゲルが入ったゲルキャスティングトレイを取り出します。ゲルの向きの基準とするため、ゲルの右上隅を切り取ります。フィルターペーパーを、ゲルのサイズよりわずかに大きい大きさに切り出します。フィルターペーパーをキャスティングトレイ内のゲルの上に置き、ゲル上の過剰な溶液をペーパーに吸収させます。ピペットをローラーとして使い、気泡を側面から押し出すようにして、フィルターペーパーとゲルの間の気泡を慎重に取り除きます。ゲルとフィルターペーパーを裏返し、ペーパーがゲルの下になるようにして、キャスティングトレイから取り出します。ろ紙とともにゲルをゲルドライヤーに移し、ゲルをプラスチックラップで覆います。ピペットをローラーとして使用し、プラスチックラップとゲルの間の気泡をすべて取り除きます。50 °Cで2時間、ゲルを乾燥させます。ゲルの乾燥後、プラスチックラップを取り除き、ゲルとフィルターペーパーを250 millilitersの脱イオン水を入れたガラス皿に移します。フィルターペーパーを慎重に取り除き、ゲルを室温で15分間インキュベートします。その後、ゲルを12 by 12 inchのナイロンメッシュの上に置きます。ゲルが自分自身に接触しないように注意しながら、ナイロンメッシュとゲルを一緒に丸めます。メッシュとゲルをハイブリダイゼーションチューブに入れます。100 millilitersの5x SSCと12 microlitersの緑色蛍光核酸染色剤を混合し、ハイブリダイゼーションチューブに入れます。回転機能付きハイブリダイゼーションオーブンを用い、42 °Cで30分間インキュベートします。溶液は遮光してください。30分後、ハイブリダイゼーションチューブからナイロンメッシュとゲルを取り出します。ロール状のものを開き、250 millilitersの脱イオン水を含むガラス製シャーレの中に平らに置きます。ナイロンメッシュを慎重に取り除きます。指定の設定でフォスホリメイジャーを用いてゲルのイメージングを行います。放射性物質の取り扱いに関する施設の規定に従い、放射性テロメアプローブを調製します。マイクロ遠心チューブに以下を混合します。テロメアプローブ 2 µL、10x ポリヌクレオチドキナーゼ反応バッファー 2.5 µL、γ-リン酸基に P32 で標識された ATP 3 µL、T4 ポリヌクレオチドキナーゼ 4 µL、および最終容量 20 µL になるまで DNase フリーの滅菌脱イオン水。チューブを短時間遠心します。チューブを37°Cのウォーターバスで1時間インキュベートします。チューブを短時間遠心分離し、65°Cで20分間インキュベートして反応を停止させます。調製したG25クロマトグラフィーカラムに放射性プローブ溶液をロードし、700 ×gで2分間遠心分離します。放射性テロメアプローブを含むろ液を回収します。ゲルを250 millilitersの変性溶液（Denaturing Solution）を入れたガラス皿に入れ、室温で15分間インキュベートします。変性溶液を除去し、250 millilitersの滅菌脱イオン水に交換します。室温のオービタルシェーカーで10分間インキュベートします。脱イオン水を除去します。250 millilitersの中和溶液に置換し、室温で15分間インキュベートします。ゲルをナイロンメッシュに巻き付け、ハイブリダイゼーションチューブに入れます。ハイブリダイゼーション溶液を20 milliliters加え、ハイブリダイゼーションオーブンにて42 degrees Celsiusで10分間、回転させながらインキュベートします。10分後、ハイブリダイゼーション溶液を取り除き、新鮮なハイブリダイゼーション溶液20 millilitersと交換します。テロメアプローブを全量加え、ハイブリダイゼーションオーブンにて42 °Cで回転させながら一晩インキュベートする。テロメアプローブとのハイブリダイゼーションが完了したら、ハイブリダイゼーションチューブからゲルとメッシュを取り出し、250 millilitersの2x SSCが入ったガラス皿に入れる。ナイロンメッシュを広げて皿から取り出す。ガラス皿をオービタルシェーカーに置き、室温で15分間インキュベートします。2x SSCを除去し、0.1x SSCおよび0.1% SDS溶液250 mLに置換し、オービタルシェーカーを用いて室温で15分間インキュベートします。0.1x SSCおよび0.1% SDS溶液を除去します。250 mLの2x SSCに交換し、オービタルシェーカーでさらに15分間インキュベートします。ゲルを2x SSCから取り出し、ラップで包みます。ゲルとラップの間の気泡や隙気をすべて取り除いてください。ゲルをフォスフォースクリーンが入った露光カセットに入れ、一晩、フォスフォースクリーンにゲルを露光させます。翌日、フォスフォーイメージャーを用いて、露光したフォスフォースクリーンの画像を撮影します。得られたフォスフォー画像は、テキストプロトコルに記載されている通り、テロメア長の定量に使用します。不死化したヒト前皮線維芽細胞株およびヒト末梢血単核細胞から抽出された3つの濃度のDNAを用いて、テロメア長の解析を行った。緑色蛍光核酸染色剤で染色し乾燥させたアガロースゲルのこのフォスファーイメージでは、1レーン目と8レーン目のDNAラダーバンドの位置が示されている。ゲルの上端から各分子量標準まで測定された距離を青色の矢印で示している。テロメアプローブを用いたハイブリダイゼーションの後、各レーンのテロメアバンドはスメア状に現れます。各レーンおよびバックグラウンド用の1レーンに対して、150個のボックスからなるグリッドを算出しました。各サンプルセットで選択された解析領域を示します。各サンプルセットにおいてバックグラウンド強度が同等であることを確認するため、Bと表記された個別のバックグラウンドレーンを選択しました。平均テロメア長の算出により、不死化細胞株における平均テロメア長が、ヒト末梢血単核球よりも長いことが明らかになりました。また、これらの結果は、ハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを得るためには、各レーンで解析するゲノムDNAの量が極めて重要であることを示しています。この手法に習熟すれば、適切に実施した場合、2回の一夜越しのインキュベーションを含め、2日半にわたる合計12時間で完了させることができます。本手順を行う際は、各サンプルに少なくとも3 µgのDNAを使用し、各サンプルを二連（デュプリケート）で測定することが重要です。この手法の開発により、ヒトを含むさまざまな動物種においてテロメア長を維持するメカニズムを探索することが可能となり、老化研究分野に道が開かれました。このビデオを視聴することで、テロメア自体の平均長を直接的に決定する方法について十分に理解できるはずです。放射性物質の取り扱いは非常に危険であるため、この手順を行う際は、常に白衣や手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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