In-gelハイブリダイゼーションを用いたテロメア長の定量化のための末端制限制限断片の解析

この手順の全体的な目標は、Jerry W.Shay博士、Woodring Wright博士らによって説明されているテロメア制限フラグメント解析手順の修正版を使用して、真核細胞のテロメアの長さを決定することです。テロメアの長さに関するデータを提供することで、この手順は、細胞生物学、行動医学、疫学、感染症、年齢、ストレス、薬物治療、感染症の影響に関する質問に答えることができます。この手法の主な利点は、さまざまな細胞の平均テロメア長をキロベース単位で直接測定できることです。

解析されるべきゲノムDNAサンプルは、テキストプロトコルに記載されているように、市販のDNA抽出キットを使用して細胞から抽出した。ゲノムDNAの最終容量20〜40マイクロリットルで消化を行います。各微量遠心チューブに以下を組み合わせます:3マイクログラムのゲノムDNA;10x DNA消化バッファー;1マイクロリットルのRsa1制限酵素。1マイクロリットルのHinf1制限酵素;無菌の脱イオン水は最終容量まで。

短時間遠心分離して、すべてのコンポーネントがチューブの底にあることを確認します。消化物を摂氏37度で少なくとも16時間インキュベートします。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように0.6%アガロース溶液を調製することから始めます。

ゲルキャスティング用のゲル電気泳動システムを準備します。エンドゲートをゲルキャスティングトレイに取り付けます。アガロースゲル溶液が摂氏50度に冷却されたら、ゲルキャスティングトレイに注ぎ、ゲルにコーンを置き、ゲルを室温で蓋をせずに45分間硬化させます。

キャスティングトレイからエンドゲートを取り外し、コームをゲルから取り外します。ゲル電気泳動システムを電気泳動バッファーで充填ラインに充填し、ゲルがバッファーに完全に沈んでいることを確認します。ゲルのウェルにDNAサンプルをロードし、サンプル間にブランクウェルを残します。

10マイクロリットルのDNAラダーをゲルの反対側の端にあるウェルに加えます。ゲル電気泳動を150ボルトで30分間実行し、DNAをゲルに迅速に移動させます。30分後、電圧を57ボルトに調整し、18〜24時間運転します。

ゲルを18〜24時間泳動した後、エレクトロフォレーシスソースをオフにし、ゲルが入ったゲルキャスティングトレイをエレクトロフォーレーシスバッファーから取り外します。.ゲルの向きの基準として役立つゲルの右上隅のスライス。濾紙をゲルより少し大きいサイズにカットします。

濾紙をキャスティングトレイのゲルの上に置き、紙がゲル上の余分な溶液を吸収するのを待ちます。濾紙とゲルの間の気泡を慎重に取り除き、ピペットをローラーとして使用して側面から気泡を絞り出します。ゲルとフィルターペーパーを裏返して、紙がゲルの下にくるようにして、キャスティングトレイからゲルを取り出します。

濾紙でゲルをゲルドライヤーに移し、ゲルをラップで覆います。ラップとジェルの間にある気泡を、ピペットをローラーとして使用してすべて取り除きます。ゲルを摂氏50度で2時間乾燥させます。

ゲルが乾いたら、ラップをはがし、250ミリリットルの脱イオン水が入ったガラス皿にゲルと濾紙を移します。濾紙を慎重に取り除き、ゲルを室温で15分間インキュベートします。12 x 12インチのナイロンメッシュの上にジェルを置きます。

ナイロンメッシュとジェルを一緒に転がして、ゲルがそれ自体に接触していないことを確認します。メッシュとゲルをハイブリダイゼーションチューブに入れます。100ミリリットルの5x SSCと12マイクロリットルの緑色蛍光核酸染色剤を組み合わせ、ハイブリダイゼーションチューブに入れます。

42°Cで30分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションオーブンで回転させます。溶液を光から保護します。30分後、ハイブリダイゼーションチューブからナイロンメッシュとゲルを取り出します。

転がして開き、250ミリリットルの脱イオン水が入ったガラス皿に平らに置きます。ナイロンメッシュをそっと取り外します。示された設定でリン酸化鏡を使用してゲルを画像化します。

放射性テロメアプローブは、施設の放射能取り扱い規則に従って準備してください。マイクロ遠心チューブには、次のものを組み合わせてください:テロメアプローブの2マイクロリットル。2.5マイクロリットルの10xポリヌクレオチドキナーゼ反応緩衝液;3マイクロリットルからATPまで、P32でγリン酸基に標識。4マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼ;DNaseフリーの滅菌脱イオン水で、最終容量は20マイクロリットルです。チューブを短時間遠心分離します。

チューブを摂氏37度の水浴中で1時間インキュベートします。チューブを短時間遠心分離し、摂氏65度で20分間インキュベートして反応を停止します。調製したG25クロマトグラフィーカラムに放射性プローブ溶液をロードし、700 gで2分間遠心分離します。

放射性テロメアプローブを含む濾液を保存します。250ミリリットルの変性溶液が入ったガラス皿にゲルを入れ、室温で15分間インキュベートします。変性溶液を取り出し、250ミリリットルの滅菌脱イオン水と交換します。

オービタルシェーカーで室温で10分間インキュベートします。脱イオン水を取り除きます。250ミリリットルの中和溶液と交換し、室温で15分間インキュベートします。

ゲルをナイロンメッシュに丸め、ハイブリダイゼーションチューブに入れます。20ミリリットルのハイブリダイゼーション溶液を加え、42°Cのハイブリダイゼーションオーブンで10分間回転させてインキュベートします。10分後、ハイブリダイゼーション溶液を取り出し、20ミリリットルの新鮮なハイブリダイゼーション溶液と交換します。

テロメアプローブ全体を添加し、摂氏42度のハイブリダイゼーションオーブンで一晩回転させてインキュベートします。テロメアプローブによるハイブリダイゼーションが完了したら、ハイブリダイゼーションチューブからゲルとメッシュを取り出し、250ミリリットルの2x SSCを含むガラス皿に入れます。ナイロンメッシュを広げて皿から取り出します。

ガラス皿をオービタルシェーカーに置き、室温で15分間インキュベートします。2x SSCを取り外し、250ミリリットルの0.1x SSCと0.1%SDS溶液と交換し、オービタルシェーカーで室温で15分間インキュベートします。0.1x SSC と 0.1%SDS 溶液を取り出します。

250ミリリットルの2x SSCと交換し、オービタルシェーカーでさらに15分間インキュベートします。2x SSCからゲルを取り出し、ジェルをラップで包みます。ジェルとラップの間にある気泡とエアポケットをすべて取り除きます。

蛍光体スクリーン付きの露光カセットにゲルを入れ、蛍光体スクリーンをゲルに一晩露光します。翌日、蛍光体イメージャーを使用して、露光した蛍光体スクリーンを画像化します。蛍光体画像は、その後、テキストプロトコルに記載されているように、テロメア長の定量化に使用されます。

不死化ヒト包皮線維芽細胞株およびヒト末梢血単核細胞から単離されたDNAの3つの濃度をテロメアの長さについて分析した。緑色蛍光核酸染色剤で染色した乾燥エイゲローズゲルのこの蛍光体画像は、レーン1と8のDNAラダーバンドの位置を示しています。ゲルの上部から各分子量標準までの距離は、青色の矢印で示されています。

テロメアプローブによるハイブリダイゼーションに続いて、テロメアバンドは各レーンに塗抹標本として現れます。150 ボックスのグリッドは、各レーンと 1 つのバックグラウンド レーンで計算されました。サンプルの各セットについて選択した分析領域が表示されます。

サンプルセットごとにBとマークされた個別のバックグラウンドレーンが選択され、各サンプルセットでバックグラウンド強度が類似していることを確認しました。平均テロメア長の計算では、不死化細胞株の平均テロメア長は、ヒト末梢血単核細胞よりも高いことが明らかになりました。これらの結果は、各レーンで分析されたゲノムDNAの量が、ハイブリダイゼーション後に検出可能なシグナルを得るために重要であることも示しています。

一度習得すると、このテクニックは2日半にわたって12時間で実行でき、適切に実行されれば2回の一晩のインキュベーションで実行できます。この手順を試みるときは、各サンプルに少なくとも3マイクログラムのDNAを使用し、各サンプルを重複して測定することを忘れないでください。その開発後、この技術は、老化の分野の研究者が、人間を含むさまざまな動物種のテロメアの長さを維持するメカニズムを探求する道を開きました。

このビデオを見れば、テロメア自体の平均長を直接決定する方法をよく理解できるはずです。放射能を扱う作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは、白衣や手袋の着用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。