Name: 赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: 学ぶ 造血幹細胞移植後のキメリズムモニタリング法。フローサイトメトリー、コロニー形成アッセイ、STR解析を組み合わせ、赤血球系前駆細胞の増殖と分化を評価し、移植後の再発リスクを特定する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、Kinderkrebshilfe Regenbogen スッドチロルによって支えられました。

1 です複数パラメーター蛍光活性化細胞選別による造血骨髄細胞の分離 <ol>プロセスを開始する前に サンプル染色 <ol><li><li>、次の項目は、収集する必要が。準備: <li>12 × 75 mm フロー チューブの汚損のための細胞</li> の <li>核の準備のためグラデーション メディア細胞 (GM)、50 mL コニカル チューブ</li> <ol><li>染色バッファー: リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 3% 牛胎児血清 (FCS)</li> <li>ピペット </l私 > <li>FC ブロックと染色抗体 (CD34 APC、CD36 FITC、CD45 V450 BD バイオ サイエンス)。この螢光色素の組み合わせで他のチャンネルにごくわずかの波及があるが、その他の適切な螢光色素の組み合わせも可能です</li>。
			<li>補償ビーズ (必要に応じて)</li>
			<li>懸濁液バッファー: ハンク &#39; s バランスの取れた塩ソリューション (HBSS) + 25 mM HEPES + 3% の FCS</li>
			<li>トリパン ブルーと検定</li>
			<li>コレクション チューブ: 細胞のコレクションの高い血清チューブ (1 mL FCS + 25 mM HEPES を含む) と、豊富な媒体を使用できます</li>。
			<li>骨髄サンプル: 腰の骨の背面の腸骨から骨髄生検のためのインフォームド コンセントが一般的に必要です。骨髄サンプルがより染色まで RT でヘパリン注射器で保管です。次のプロトコル手順を実行機関のガイドラインに準拠して &#39; s 人間福祉人間研究倫理委員会</li>。
		</ol></li> <li>骨髄のサンプルの単一細胞懸濁液を生成します。GM の 3 mL を遠心管に追加します。慎重に GM ソリューションに単一細胞懸濁液 4 mL をレイヤーします。550 g で 20 ° 摂氏 (C) で 30 分間遠心 (ブレーキをオフ)。プラズマと界面単核細胞層を妨げられていない残して、滅菌ピペットを使用して血小板を含む上側のレイヤーの描画します。滅菌ピペットを使用して滅菌遠心管に単核細胞の層を転送します</li>。
		<li>染色バッファー 5 mL で洗浄した後、2 mL の懸濁液のバッファーに細胞を再懸濁します、細胞濃度を決定します。スクリュー キャップ テスト チューブに細胞懸濁液の場所 5 μ L。0.2% トリパン ブルー染色の 95 μ L を追加します。ミックス徹底的。室温で 5 分間立つことを割り当てください。細胞数については検定をご記入ください。顕微鏡で観察非実行可能な場合は、染色および実行可能なセルを数える</li>。
		<li>で 20 ° C で 10 分間 250 g 細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、100 μ L あたり最大 1 x 10 6 の濃度のバッファーを染色の細胞を再懸濁します</li>。
		<li>2.5 μ g で 10-15 分間氷の上 1 x 10 の 6 セルごとに Fc ブロックの使用によってブロック FcR</li>
		3 ml のバッファーを染色洗浄工程に続いて <li>追加 10 μ g mAb の適切な組み合わせを 1 x 10 の 6 セルを汚し、暗闇の中の 4 ° C で 20 分間インキュベートします。正しい補償のため細胞 (またはできれば補償ビーズ) の小さい因数がそれぞれの単一の抗体で染色します。無染色の残り 1 つの因数</li>。
		<li>20 × 10 6 セル/mL の濃度を調整します</li>。
		<li>セットとセルソーターを最適化します。流れの cytometer とソフトウェアの設定のプロセスは会社によって提供される詳細な命令で標準化されて、適切に訓練を受けた専門家によって実行される必要があります</li>。
	</ol></li> <li>セルソーターの並べ替え <ol><li>ステップ 1.1.1.9 からコレクション チューブを用意します</li>。
		<li>(FSC) 前方散乱、側方散乱 (SSC) を表示する 2 変量プロットを含むテンプレートを設定します</li>。
		<li>セルを実行し、FSC/SSC には規模で興味の人口の場所を調整します</li>
		<li>ネガティブ コントロール チューブを記録します</li>。
		<li>1 つの肯定的な制御管を実行; 各チューブのデータを記録します</li>。
		<li>集録ソフトウェアによって提供される機能を手動でまたは自動的に賠償額を計算します</li>。
		<li>実験的サンプルを取得し、2 変量 FSC/SSC ドット プロット ( 図 1 a) リンパ性と骨髄性のセルを含めるためにゲートのそれら。FSC (すなわち 高さ、幅、および地域) の異なる信号を比較することによってダブレットと集計を除外する ( 図 1 b)。CD45 と CD36 表示変量ドット プロットに一重項細胞を可視化する ( 図 1)。イベント CD45 陽性、白血球 (その祖先を含む)、それらは負の CD45 の CD36 の正は赤芽球系前駆細胞。CD36 + (もし、必要に応じてこれらの細胞分類できます CD36 高で、低を表現する細胞) を定義するゲーティング ツールと CD45 陽性細胞を使用します。CD45 + CD34 と SSC のパラメーターを表示する別のドット プロットでイベントを可視化します。CD34 陽性細胞 (白血球前駆細胞) と SSC 高細胞 (骨髄性細胞分化の各段階で) 定義するツールをゲーティング使用します</li>。
		<li>外部コレクション チューブに並べ替えゲート ゲートを確認すると、選択できます</li>。
		<li>必要なセル数を取得するまで 4 ° C で並べ替えを続行</li>
		<li>ソートされた細胞集団 ( 図 1E、1 f) の純度を決定する並べ替え後の分析を実行します</li>。
	</ol></li></ol> 2。クローン形成法 <ol><li>試薬の調製 プロセスを開始する前に、次の項目を収集し、準備必要があります: <ol><li>トリパン ブルー色素と検定</li> <li>ピペット、100 mm の版</li> <li>を再構成少なくとも 0.1% を含む滅菌 PBS で 500 U/mL で人間の遺伝子組換えエリスロポエチン (EPO) ひと血清アルブミン。小さい因数にこのソリューションを分割し、凍結融解の繰り返しを避けるために-20 ° C で維持します</li>。
		<li>準備完了 Iscove &#39; s 修正ダルベッコ &#39; s を最終濃度 5% の FCS、2 mM グルタミン、100 単位/ml ペニシリン/ストレプトマイシン (PS) の培地 (IMDM)。完全の IMDM 培地に独立した井戸で異なる濃度でヒト組換型エリスロポエチン (EPO) を追加: 3 台 EPO/まあ、6 ユニットと EPO 12/EPO ユニット/ウェル (1 x, 2 x, 4 x EPO それぞれ).</li>
	</ol></li> <li>骨髄細胞の準備 <ol><li>10 mL を 20 mL の PBS で希釈した骨髄サンプルにゆっくりと 15 mL 密度勾配媒体 2 つのフェーズと明確なインターフェイスを維持する 50 mL の円錐管に重ねるnder 無菌状態。9 として設定加速度と減速 0 (ブレーキを) として設定室温 (RT) で 30 分間 550 x g で 15 mL の円錐管を遠心します</li>。
		<li>遠心分離の後新しい 50 mL のチューブにインターフェイスを削除し、50 mL の最終巻に PBS を追加します</li>。
		<li>250 g 10 ° C で 10 分間遠心分離後、上清を除去し、約 0.5 × 10 6 セル/mL で完全 IMDM 培地で細胞を再懸濁します。マイクロ チューブに細胞懸濁液の 10 μ L を取る、トリパン ブルー溶液 (0.4%) の同じ量混ぜて、診断を数える</li>。
		<li>Optional: Milteny CD34 ビーズ製造によって与えられた指示に従って並べ替え磁気細胞 CD34 陽性細胞が濃縮します。この濃縮のステップの主な利点は 50 ng/mL 幹細胞因子 (SCF) 20 ng/mL 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF) 20 ng/mL で追加した半固体マトリックスで栽培されている造血幹細胞の品質を検出するには1.4 のように EPO の 3 濃度 20 ng/mL 顆粒球コロニー刺激因子 (G-CSF)、20 ng/mL インターロイキン 6 (IL-6) 3-インターロイキン (IL-3).</li>
		<li>希釈 0.1 - セル 0.15 x 10 の 6 単核細胞/mL または 2 x 10 3 CD34 + Methocult H4434 培地 3 mL に EPO と転送 300 μ L を添加した細胞/ml 完全 IMDM 培地を追加することによって。撹拌し 5 分板 3 の短い潜伏時間 1, 1 後 35 mm ディッシュの mL。第三 - 水 - でいっぱいの文化料理、これらの 2 つは、100 mm の版に配置されます</li>。
		<li>14 日間 5% CO 2 と加湿の 37 ° C のインキュベーターで培養されるセルです</li>。
	</ol></li> <li>植民地の解析 <ol><li>その形態によると得点グリッド付け培養皿で 40 倍の倍率で倒立顕微鏡と植民地を獲得しています。4 つのカテゴリーに分類されます我々 の分析のために、コロニー形成単位 (CFU): 多分化能幹細胞 (CFU ジェム)、顆粒球・ マクロファージ系前駆細胞 (CFU-GM)、バースト形成ユニット-赤芽球 (BFU E) とコロニー形成単位赤血球 (CFU-E)。製造元を参照してください &#39; s についてさらにコロニー下位分類します</li>。
		<li>の詳細な分析、CFU アッセイ プレートから細胞により回収されて別に 4 つのカテゴリーによると 4 mL 室温 2% を含む PBS で中断する FCS/IMDM。4 ° C で 10 分間 400 g で遠心分離後、セルの PBS で再停止される、カウント、および DNA の抽出のための処理です</li>。
	</ol></li></ol> 3。キメリズム解析 <ol><li><ol><li>ペレットで 400 g で 10 分間の遠心分離によって細胞</li> の DNA の隔離
		<li>血 DNA 抽出キット (QIAmp DNA 血液抽出キット) を使用して特定の DNA。あらかじめ溶離された DNA の収量を高めるために 37 ° C で溶出バッファー (AE) をウォームします</li>。
		<li>は、ND Nanodrop 1000 スペクトル光度計と DNA 濃度を測定します。さらに分析用サンプルと OD 260/280 1.8 2.0 間</li>。
		<li>DNAase 無料 H 2 O 50 μ L の総ボリュームで 0.1 ng/μ L の DNA を希釈します</li>。
	</ol></li> <li>STR 分析 <ol><li>反応混合物、AmplTaq 金 DNA ポリメラーゼとプロファイラー プラス プライマー セット 20 μ L の DNA とを混合することによって PCR の反作用を設定 (0.1 ng/μ L)、マニュアルによると (プライマー キットが含まれています、STR 遺伝子座 D3S1358、女性組合、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、および D7S820、および性別マーカー アメロゲニンを増幅するバッファーでラベル付けされていないプライマー)。ヌクレアーゼ フリー水をネガティブ コントロールとして、肯定的な制御として 9947A が含まれます。中古移植ドナーとレシピエントの両方から DNA が含まれています</li>。
		<li>エッペン mastercycler グラデーションを使用して以下の条件で行う PCR の反作用: 11 分、95 ° C 1 分、59 ° C 1 分、72 ° C 1 分、95 ° C の 28 の増幅サイクルに続いて 45 分の 60 ° C</li>
		12 μ L を追加することによってフラグメントを <li>セット分析反応やあ・ ディ ・ Formamid と 0.5 μ L GeneScan 500 ROX サイズ標準 (すべてアプライドバイオシステムズジャパン) 1 μ L の PCR の製品を。最初と最後の位置で (Genotyper アンプ Fl STR 青、グリーン II、黄色、アプライドバイオシステムズジャパン) Allelic 梯子が必要です</li>。
		<li>電気泳動装置、電気泳動および集録を開始します</li>。
		<li>分析遺伝子、対立遺伝子、サンプルおよびコントロール ソフトウェア 13 とのピーク高さ</li>。
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Angelucci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+major+and+sickle+cell+disease%3A+indications+and+management+recommendations+from+an+international+expert+panel%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel.</a> Haematologica. 99, 811-820 (2014).</li>
<li>Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+and+sickle+cell+anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825(2012).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+chimerism+in+haemoglobinopathies%3A+from+risk+of+graft+rejection+to+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Antigens%22%5BJournal%5D)">Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance.</a> Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+mixed+chimerism+in+patients+transplanted+for+the+treatment+of+thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia.</a> Blood. 87, 3494-3499 (1996).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+of+ex-thalassemic+patients+with+persistent+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation.</a> Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).</li>
<li>Kumar, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+prophylactic+ex+vivo+costimulated+donor+leukocyte+infusion+after+reduced-intensity+conditioned+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Blood+Marrow+Transplant%22%5BJournal%5D)">Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).</li>
<li>Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytogenetic+follow-up+studies+of+recipients+of+T-cell+depleted+allogeneic+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow.</a> Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).</li>
<li>McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemopoietic+chimerism+following+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transfus+Apher+Sci%22%5BJournal%5D)">Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation.</a> Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).</li>
<li>Dewald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter+investigation+with+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+using+X-+and+Y-chromosome+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med+Genet%22%5BJournal%5D)">A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes.</a> Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).</li>
<li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitatively+different+red+cell%2Fnucleated+cell+chimerism+in+patients+with+long-term%2C+persistent+hematopoietic+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation+for+thalassemia+major+or+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease.</a> Haematologica. 96, 128-133 (2011).</li>
<li>Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Split+chimerism+between+nucleated+and+red+blood+cells+after+bone+marrow+transplantation+for+haemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Chimerism%22%5BJournal%5D)">Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies.</a> Chimerism. 2, 21-22 (2011).</li>
<li>Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+management+of+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplant+in+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major.</a> Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).</li>
<li>Kimpton, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+DNA+profiling+employing+multiplex+amplification+of+short+tandem+repeat+loci%5BTitle%5D)+AND+%22PCR+Methods+Appl%22%5BJournal%5D)">Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.</a> PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).</li>
<li>Centis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+erythroid+expansion+in+determining+the+extent+of+apoptosis+in+erythroid+precursors+in+patients+with+beta-thalassemia+major%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major.</a> Blood. 96, 3624-3629 (2000).</li>
<li>Miccio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+selection+of+genetically+modified+erythroblastic+progenitors+leads+to+long-term+correction+of+beta-thalassemia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

現在の研究の目的は、赤血球の溶血の治療を受けた次の造血幹細胞移植患者における赤芽球前駆細胞のドナー/受信者キメリズムの分析のための 2 つの方法を組み合わせて観客を提供するためにある: 1.) 蛍光活性化細胞ソーティング造血前駆細胞の骨髄サンプル短いタンデム繰り返しの 2 分析続く。)コロニー形成単位の成長, 骨髄細胞の前駆細胞各種におけるコロニーの分類は続く短いタンデム繰り返しの分析。このアプローチの目新しさは個々 のコロニーでドナー/受信者キメリズムを評価するためのプロトコルの技術を組み合わせることで。
このアプローチの特定の重要性は、赤血球の溶血、造血幹細胞移植患者のための治療後混合キメリズムのコンテキストで見つけることができます。いくつかの研究を示している患者のかなりの割合を表現と相関する赤芽球系の前駆細胞混合キメリズム造血3、長期的な安定と結果ドナーの骨髄系細胞の割合が低い 11;対照的に、同じ患者のドナー由来の赤血球の割合が高い (2 〜 5 倍成熟した...

同種造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) はさまざまな高い危害の無病生存率 90% 以上を達成するため、造血系の先天性の遺伝疾患でのみ利用可能な治癒アプローチと人生限られた患者1。この重要な治療ツールの有効性は、制限前の毒性によって最適化されている-レジメン2、移植後、閉じるモニタリングによる定量化は、安定した機能を維持を目的とした介入によってもドナー由来細胞の3,の4,5。
一般に、完全キメリズム (CC) ドナー由来細胞によるリンパ ・血液新生コンパートメントの総入れ替えを意味混合キメリズム (MC) という用語は、ドナーと受信者由来細胞が様々 な同時に存在する場合に使用されます。プロポーション。分割キメリズム (SC) は、赤芽球のコンパートメントで単一細胞系統の観察混合キメリズムの共存を示します。造血幹細胞移植後キメリズム ステータスの迅速定量は病気再発と開始以降免疫調節戦略、ドナーのリンパ球輸注や免疫抑制の減少などの影響を受けやすい患者を識別することがありますので、重要です。治療6。
いくつかの方法は、造血幹細胞移植後の生着を監視するために開発されています。免疫グロブリンのアイソタイプ識別と細胞遺伝学の分析感度が悪いとポリモーフィズム7、8を検出する機能が制限されます。蛍光その場で交配 (魚) の導入は、造血幹細胞移植後キメリズムのモニタリングで感度を向上させることができますが、セックスの不一致移植9に制限されています。現在、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) のキメリズムの検出に使われる最も普及している方法で、変数数タンデム繰り返し (繰り返し) の従来の agarose アクリルアミド電気泳動に基づくまたは短いタンデム繰り返し (Str)。日常的に使用される量的な PCR は造血幹細胞移植に続く残留ドナー細胞の非常に小さい割合を検出することができます。研究の主な制限は、これまでのところは、MC 検出が成熟した赤血球は有核の細胞の存在にほとんど専ら制限されて、すなわち細胞が患者の機能的に重要な発生する赤血球の溶血です。顕解析は c、D、E、および e10赤血球抗原 ABO と C に向けモノクローナル抗体を用いた赤色の血液細胞のキメリズムを識別することを思い出して価値がある別の血液型と患者の,11. 赤芽球系列のキメリズムの評価の異なる、しかし、非常に興味深い手段は流れフローサイトメトリーは、クローンのアッセイでの培養赤芽球系前駆細胞と赤芽球前駆細胞の様々 な種類の選択の並べ替えの組み合わせSTR12の分析が続きます。このアプローチは、赤芽球コンパートメントでドナーと受信者のキメリズムの相対的な割合を計測することは、骨髄移植を維持するために戦略に活用することがあります。

<table><tbody><tr><td>フィコール・パケ</td><td>GEヘルスケア</td><td>GE17-1440-02&nbsp;</td><td>RBCを削除</td></tr><tr><td>50 mLコニカルチューブ</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td>サンプル調製</td></tr><tr><td>12 x 75 mm フローチューブ</td><td>Falcon</td><td>352002</td><td>FACS ソーティング</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>PBS</td></tr><tr><td>子牛胎児血清</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>16000-044</td><td>FCS (熱不活化)</td></tr><tr><td>CD34 APC</td><td>BD Bioscience</td><td>561209</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD36 FITC</td><td>BD Bioscience</td><td>555454</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>CD45 V450</td><td>BD Bioscience</td><td>642275</td><td>FACS-Ab</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>自動セルカウント</td></tr><tr><td>Hank'S 平衡塩溶液</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>FACS分析における懸濁液バッファー</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>懸濁液バッファーの成分</td></tr><tr><td>FcR</td><td>BD Bioscience</td><td>564220</td><td>ブロックFCR</td></tr><tr><td>FACS Aria I</td><td>BD Bioscience</td><td>23-11539-00</td><td>FACS ソーター</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト エリスロポエチン</td><td>Affimetrix eBioscience</td><td>14-8992-80</td><td>EPO</td></tr><tr><td>イソコーブs 変性ダルベッコ's Medium</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>IMDM</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>培養培地の成分</td></tr><tr><td>CD34+ 磁気ビーズ</td><td>Milteny Biotech</td><td>130-046-702</td><td>CD34+ 精製</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト G-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2031</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト SCF</td><td>Gibco</td><td>CTP2113</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト GM-CSF</td><td>Gibco</td><td>PHC2015</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト IL-3</td><td>BD Bioscience</td><td>554604</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>組換え&nbsp; ヒト IL-6</td><td>BD Bioscience</td><td>550071</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>Methocult H4434 Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4444</td><td>CFU-Assay</td></tr><tr><td>QiAmp DNA 血液抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>51306</td><td>DNAの分離</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000スペクトル光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND 1000</td><td>DNAの定量化</td></tr><tr><td>DNAase 自由な H2O</td><td>Thermo Scientific</td><td>FEREN0521</td><td>DNAの準備</td></tr><tr><td>AmplTaq 金DNAポリメラーゼ</td><td>Applied Bioscience</td><td>N8080240</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Eppendorf mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td>PCR&nbsp;</td></tr><tr><td>Hi-Di Formamid</td><td>Applied Bioscience</td><td>4311320</td><td>PCR</td></tr><tr><td>GeneScan 500 ROX サイズ標準</td><td>Applied Bioscience</td><td>4310361</td><td>PCR</td></tr><tr><td>3130 Genetic Analyzer</td><td>Applied Bioscience</td><td>313001R</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

不完全なキメリズムの存在は、鎌状赤血球症やサラセミア メジャーの骨髄移植後の患者の大きい割合で示されます。この観測は、以降治療免疫戦略は、臨床結果を改善することができます大きな影響です。従来、短いタンデム繰り返しのポリメラーゼ連鎖反応に基づく解析を使用して、ドナー血液細胞のキメリズムを識別します。ただし、このメソッドは、有核細胞に制限されて、解離の単一セル血統を区別できません。フローサイトメトリーによるソートの造血前駆細胞を流れる短いタンデム繰り返しの解析を適用し、骨採集両方選択したバースト形成ユニット - 赤芽球コロニーから得られた短いタンデム繰り返しの分析とこれを比較して骨髄。この方法で我々 は異なる増殖と赤芽球のコンパートメントのドナー細胞の分化を実証することが。この技術は現在設定幹細胞移植におけるキメリズムの監視を完了する資格が、将来的に臨床応用の研究、幹細胞研究と遺伝子治療臨床試験のデザインになる可能性があります。

FACS セルを並べ替えることでリンパ ・血液新生前駆細胞の分離
ここから下流の STR 分析のための必要な細胞集団を並べ替え結果を示す.骨髄細胞は、V450 標識抗 CD45、FITC 結合抗 CD36 APC 共役抗 CD34 と染色された.興味の人口は巨核球赤芽球系前駆細胞 (MEP)、核細胞赤血球の開発を担当です。これらの細胞は CD36、エクスプレスしますが、白血球共通抗原 CD45 陰性 (図 1)。必要に応じて、これらの細胞が、さらに区別ベースの CD36 の発現レベルに。コントロールとして機能するいくつかの追加の集団を並べ替えることができます。私たちは成熟した骨髄系細胞 (図 1) として CD45 + CD34 + 高い SSC 信号の別の前駆細胞集団と CD45 陽性細胞としてリン...

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

本手順の全般的な目的は、幹細胞移植におけるキメリズムをモニタリングすることです。本手法は、ヘモグロビン異常症患者に対する造血幹細胞移植の生着など、移植分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、フローサイトメトリーに基づく細胞分取、カラム情報アッセイ、およびそれに続くショートタンデムリピート（STR）解析を組み合わせることで、赤芽球系における前駆細胞の増殖と分化を評価できる点にあります。この技術の意義は、移植片拒絶反応の治療にまで及びます。なぜなら、疾患の再発が起こりやすい患者の特定に役立ち、それに続く免疫調節戦略を開始できる可能性があるためです。さらに、今後の臨床研究、幹細胞研究、および皮膚治療試験の設計にも応用可能です。このプロセスは習得が困難であり、訓練を受けた専門員によって実施される必要があるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。この手順を実演するのは、私の研究室の技術員である Elisabeth Hoflehner です。まず、脂肪染色のために、骨髄サンプルの単一細胞懸濁液を調製します。そのためには、骨髄を入れたセルストレーナーを遠心チューブの上にセットし、ねじ込んで固定します。シリンジのプランジャーを使用して、組織片をメッシュに通します。すべての材料を回収するため、数 mL の懸濁バッファーで洗浄します。遠心チューブに 3 mL の密度勾配培地を加え、その上に単一細胞懸濁液を慎重に重層させます。チューブを550 G、20 °Cで30分間遠心分離します。この際、加速度は9に、減速度は0に設定してください。ピペットを用いて、血漿と血小板を含む上層を回収します。その際、界面にある単核細胞層を乱さないように注意してください。この単核細胞層を遠心分離チューブに移します。次に、10 mLの懸濁緩衝液で細胞を洗浄します。チューブを4 °Cで250 G、5分間遠心分離します。上清を捨て、ピペッティングにより細胞を2 mLの完全Isokov修飾Dulbecco培地に再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定するには、96ウェルプレートに2%トリパンブルー染色液を95 µL分注します。ここに細胞懸濁液を5 µL加え、十分に混合した後、室温で短時間インキュベートします。ヘモサイトメーターに充填し、顕微鏡下で観察します。染色された生存細胞のみをカウントします。その後、細胞懸濁液を25 °Cで250 Gにて10分間遠心分離します。FC受容体をブロックするために、100 µLあたり2.5 µgのブロック剤を使用します。氷上で10〜15分間インキュベートします。細胞染色の使用量に適した、あらかじめ滴定したモノクローナル抗体の混合液を添加します。4 °Cの暗所で20分間インキュベートします。3 mLの染色バッファーで細胞を洗浄し、遠心分離します。細胞濃度を調整した後、細胞懸濁液を70 µLのセルストレーナーでろ過して凝集物を取り除きながら、標準的なフローサイトメトリー用チューブに分注します。次に、製造元の指示に従って、セルソーターとソフトウェアの設定および最適化を行います。前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を表示するための2次元プロットを含むテンプレートを設定します。目的の細胞集団を適切なスケールに配置するため、ソーターで細胞を走査し、FSCとSSCを調整します。まずネガティブコントロールチューブのデータを記録し、その後、各シングルステイン補正コントロールチューブのデータを記録して補正値を算出します。その後、リンパ球と骨髄系細胞の両方を含むように、実験サンプルをFSCおよびSSCの二変量ドットプロットでゲートします。FSCの異なるシグナルを比較することで、ダブレット（凝集二量体）と凝集物を除外します。次に、CD45およびCD36を発現するシングレット細胞を二変量ドットプロットで可視化します。CD45陽性イベントは白血球およびその前駆細胞を示します。CD45陰性かつCD36陽性のイベントは、赤芽系前駆細胞を示します。CD36陽性細胞およびCD45陽性細胞を定義するためにゲーティングツールを使用し、その後、CD45陽性イベントと、CD34およびSSCパラメータを表示する別のドットプロットを可視化します。次に、ゲーティングツールを使用して、CD34陽性細胞（または白血球前駆細胞）およびSSC高値細胞（または分化段階にある骨髄系細胞）を定義します。その後、外部回収チューブへソートするためのゲートを選択します。最後に、目的の細胞数を取得するまで、4 °Cで細胞ソートを継続します。ヒト組換えエリスロポエチン（EPO）を添加した完全IMDM培地を加え、細胞を希釈します。希釈した細胞300 µLを3 mLのH4434培地に転移し、室温で5分間振とうしながらインキュベートします。次に、35 mmディッシュ3枚に、細胞懸濁液を1 mLずつ播種します。2枚の培養皿を、水を入れた3枚目の皿とともに100mmプレート内に配置します。これらの細胞を、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で14日間培養します。40倍の倒立顕微鏡とスコアリンググリッド付きの培養皿を用いて、コロニーをその形態に基づいてスコアリングします。コロニー形成単位（CFU）を、多能性前駆細胞、顆粒球・単球前駆細胞、赤血球系造血単位（BFU-E）、および赤血球系コロニー形成単位（CFU-E）に分類します。まず、テキストのプロトコルに従ってFACSまたはCFUアッセイプレートから細胞を回収し、DNA抽出に進みます。細胞を遠心分離した後、自動血液DNA抽出装置を用いてペレットから核酸を単離します。フルオロメーターを用いてDNA濃度を測定します。メーカーの指示に従ってサンプルを調製し、フルオロメーターのサンプルチャンバーにセットします。マニュアルに従い、DNAポリメラーゼ、プライマーセット、および反応ミックスの混合物に希釈したDNAを加えてPCR反応をセットアップします。ドナーおよびレシピエントの移植前DNA、ならびに陰性対照としてのヌクレアーゼフリー水を含め、陽性対照には9947Aを使用します。PCR結果を解析するために、変性させたDNAサンプルを10 µLずつ96ウェル反応プレートの各ウェルに分注します。プレートを密封し、短時間遠心した後、氷上に置きます。メガカリオサイト・エリスロイド前駆細胞は、CD36陽性かつCD45抗原陰性の集団として分取した。加えて、CD45陽性かつCD34陽性の細胞をリンパ球・骨髄系前駆細胞として、またSSCシグナルが高いCD45陽性細胞を成熟骨髄系細胞として同定した。分取後のエリスロイド前駆細胞の純度は85%以上であり、骨髄系細胞の純度は95%以上であった。CD34特異的磁気ビーズを用いて分離した骨髄細胞を14日間培養した。これらの細胞の一部は、増殖、分化し、コロニーを形成するように見えます。さまざまな濃度のEPOによる刺激により、鮮明な赤色の赤芽球系コロニーの形成が増加しました。レシピエントおよびドナーDNAに特異的なショートタンデムリピート（STR）のPCR解析により、細胞内のキメラ状態を検出できます。この手法により、骨髄細胞のセルソーティングにより得られた細胞、およびコロニー形成アッセイにより得られた細胞における、レシピエントDNA量とドナーDNA量の定量に成功しました。習熟すれば、適切に実施することで4時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、本手法が標準化されている必要があり、適切にトレーニングを受けた担当者が実施する必要があることに留意することが重要です。本手順に従うことで、残存するドナー由来の赤血球系前駆細胞をさらに解析し、遺伝子矯正された赤血球系幹細胞の選択的優位性などの追加的な疑問に対する答えを得ることができます。本手法の開発により、幹細胞移植分野の研究者が、赤血球系コンパートメントにおける前駆細胞の増殖と分化を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヘモグロビン症の患者における幹細胞移植後の生着をモニタリングする方法について、十分な理解を得ることができます。

detection-residual-donor-erythroid-progenitor-cells-after

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

直接収穫したてのマウスの骨髄、脾臓や胎児の肝臓における分化段階特異的マウス赤血球前駆細胞と前駆体の同定と分子解析のためのフローサイトメトリー法。アッセイは、細胞表面マーカーCD71、TER119、およびセルサイズに依存しています。...

CD71/TER119フローサイトメトリーアッセイを用いてマウス赤血球前駆細胞の同定と解析

レンチウイルスを介したノックダウン中生体外で</emヒト造血幹細胞の>赤血球

分化胚性幹細胞(ESC)における時間的遺伝子発現の操作は、誘導性遺伝子システムを使用して達成することができます。しかし、これらの細胞株の作製には費用と時間がかかります。このプロトコルは、ES由来細胞の分化における導入遺伝子の迅速な発現と、その後の下流の造血分化の解析を実現します。...

マウス胚のレトロウイルス感染は、造血分化の解析のための細胞由来の胚様体幹細胞

このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。...

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

フローサイトメトリーによる主な急性骨髄性白血病細胞白血病幹細胞マーカーの同時発現を検出するためのプロトコルの概要を説明します。3 前駆細胞集団と増加する成熟の程度と推定される LSC...

フローサイトメトリーを診断とフォローで主に急性骨髄性白血病、白血病幹細胞患者由来異種での見積もりに

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

Hoxb5レポーターシステムを使用して、長期造血幹細胞(LT-HSC)および短期造血幹細胞(ST-HSC)を分離するための段階的なプロトコルを提示します。...

長期および短期造血幹細胞の単離方法

本研究では、骨形成タンパク質-2をロードしたゼラチン足場をトリガーとする in vivo...

治療用造血幹細胞/前駆細胞を回収するためのin vivoオステオオルガノイドアプローチ

赤血球生成のモデリングは、このプロセスにおけるアクターの生物学的意義を理解し、分化欠陥を緩和する可能性のある新しい治療アプローチを評価する貴重な機会を提供します。ここでは、ex...

ヒト赤血球生成の効率をin vitroおよびex vivoで評価するための包括的なパイプライン

学ぶ 造血幹細胞移植後のキメリズムモニタリング法。フローサイトメトリー、コロニー形成アッセイ、STR解析を組み合わせ、赤血球系前駆細胞の増殖と分化を評価し、移植後の再発リスクを特定する。

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

さらに動画を探す