赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

本手順の全般的な目的は、幹細胞移植におけるキメリズムをモニタリングすることです。本手法は、ヘモグロビン異常症患者に対する造血幹細胞移植の生着など、移植分野における重要な課題の解決に寄与します。本手法の主な利点は、フローサイトメトリーに基づく細胞分取、カラム情報アッセイ、およびそれに続くショートタンデムリピート（STR）解析を組み合わせることで、赤芽球系における前駆細胞の増殖と分化を評価できる点にあります。

この技術の意義は、移植片拒絶反応の治療にまで及びます。なぜなら、疾患の再発が起こりやすい患者の特定に役立ち、それに続く免疫調節戦略を開始できる可能性があるためです。さらに、今後の臨床研究、幹細胞研究、および皮膚治療試験の設計にも応用可能です。このプロセスは習得が困難であり、訓練を受けた専門員によって実施される必要があるため、本手法を視覚的に提示することは極めて重要です。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術員である Elisabeth Hoflehner です。まず、脂肪染色のために、骨髄サンプルの単一細胞懸濁液を調製します。そのためには、骨髄を入れたセルストレーナーを遠心チューブの上にセットし、ねじ込んで固定します。

シリンジのプランジャーを使用して、組織片をメッシュに通します。すべての材料を回収するため、数 mL の懸濁バッファーで洗浄します。遠心チューブに 3 mL の密度勾配培地を加え、その上に単一細胞懸濁液を慎重に重層させます。

チューブを550 G、20 °Cで30分間遠心分離します。この際、加速度は9に、減速度は0に設定してください。ピペットを用いて、血漿と血小板を含む上層を回収します。その際、界面にある単核細胞層を乱さないように注意してください。この単核細胞層を遠心分離チューブに移します。

次に、10 mLの懸濁緩衝液で細胞を洗浄します。チューブを4 °Cで250 G、5分間遠心分離します。上清を捨て、ピペッティングにより細胞を2 mLの完全Isokov修飾Dulbecco培地に再懸濁します。

ヘモサイトメーターを用いて細胞濃度を測定するには、96ウェルプレートに2%トリパンブルー染色液を95 µL分注します。ここに細胞懸濁液を5 µL加え、十分に混合した後、室温で短時間インキュベートします。ヘモサイトメーターに充填し、顕微鏡下で観察します。

染色された生存細胞のみをカウントします。その後、細胞懸濁液を25 °Cで250 Gにて10分間遠心分離します。FC受容体をブロックするために、100 µLあたり2.5 µgのブロック剤を使用します。

氷上で10〜15分間インキュベートします。細胞染色の使用量に適した、あらかじめ滴定したモノクローナル抗体の混合液を添加します。4 °Cの暗所で20分間インキュベートします。

3 mLの染色バッファーで細胞を洗浄し、遠心分離します。細胞濃度を調整した後、細胞懸濁液を70 µLのセルストレーナーでろ過して凝集物を取り除きながら、標準的なフローサイトメトリー用チューブに分注します。次に、製造元の指示に従って、セルソーターとソフトウェアの設定および最適化を行います。

前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）を表示するための2次元プロットを含むテンプレートを設定します。目的の細胞集団を適切なスケールに配置するため、ソーターで細胞を走査し、FSCとSSCを調整します。まずネガティブコントロールチューブのデータを記録し、その後、各シングルステイン補正コントロールチューブのデータを記録して補正値を算出します。

その後、リンパ球と骨髄系細胞の両方を含むように、実験サンプルをFSCおよびSSCの二変量ドットプロットでゲートします。FSCの異なるシグナルを比較することで、ダブレット（凝集二量体）と凝集物を除外します。次に、CD45およびCD36を発現するシングレット細胞を二変量ドットプロットで可視化します。

CD45陽性イベントは白血球およびその前駆細胞を示します。CD45陰性かつCD36陽性のイベントは、赤芽系前駆細胞を示します。CD36陽性細胞およびCD45陽性細胞を定義するためにゲーティングツールを使用し、その後、CD45陽性イベントと、CD34およびSSCパラメータを表示する別のドットプロットを可視化します。

次に、ゲーティングツールを使用して、CD34陽性細胞（または白血球前駆細胞）およびSSC高値細胞（または分化段階にある骨髄系細胞）を定義します。その後、外部回収チューブへソートするためのゲートを選択します。最後に、目的の細胞数を取得するまで、4 °Cで細胞ソートを継続します。

ヒト組換えエリスロポエチン（EPO）を添加した完全IMDM培地を加え、細胞を希釈します。希釈した細胞300 µLを3 mLのH4434培地に転移し、室温で5分間振とうしながらインキュベートします。次に、35 mmディッシュ3枚に、細胞懸濁液を1 mLずつ播種します。

2枚の培養皿を、水を入れた3枚目の皿とともに100mmプレート内に配置します。これらの細胞を、37°C、5% CO₂の加湿インキュベーター内で14日間培養します。40倍の倒立顕微鏡とスコアリンググリッド付きの培養皿を用いて、コロニーをその形態に基づいてスコアリングします。

コロニー形成単位（CFU）を、多能性前駆細胞、顆粒球・単球前駆細胞、赤血球系造血単位（BFU-E）、および赤血球系コロニー形成単位（CFU-E）に分類します。まず、テキストのプロトコルに従ってFACSまたはCFUアッセイプレートから細胞を回収し、DNA抽出に進みます。細胞を遠心分離した後、自動血液DNA抽出装置を用いてペレットから核酸を単離します。

フルオロメーターを用いてDNA濃度を測定します。メーカーの指示に従ってサンプルを調製し、フルオロメーターのサンプルチャンバーにセットします。マニュアルに従い、DNAポリメラーゼ、プライマーセット、および反応ミックスの混合物に希釈したDNAを加えてPCR反応をセットアップします。

ドナーおよびレシピエントの移植前DNA、ならびに陰性対照としてのヌクレアーゼフリー水を含め、陽性対照には9947Aを使用します。PCR結果を解析するために、変性させたDNAサンプルを10 µLずつ96ウェル反応プレートの各ウェルに分注します。プレートを密封し、短時間遠心した後、氷上に置きます。

メガカリオサイト・エリスロイド前駆細胞は、CD36陽性かつCD45抗原陰性の集団として分取した。加えて、CD45陽性かつCD34陽性の細胞をリンパ球・骨髄系前駆細胞として、またSSCシグナルが高いCD45陽性細胞を成熟骨髄系細胞として同定した。分取後のエリスロイド前駆細胞の純度は85%以上であり、骨髄系細胞の純度は95%以上であった。CD34特異的磁気ビーズを用いて分離した骨髄細胞を14日間培養した。

これらの細胞の一部は、増殖、分化し、コロニーを形成するように見えます。さまざまな濃度のEPOによる刺激により、鮮明な赤色の赤芽球系コロニーの形成が増加しました。レシピエントおよびドナーDNAに特異的なショートタンデムリピート（STR）のPCR解析により、細胞内のキメラ状態を検出できます。

この手法により、骨髄細胞のセルソーティングにより得られた細胞、およびコロニー形成アッセイにより得られた細胞における、レシピエントDNA量とドナーDNA量の定量に成功しました。習熟すれば、適切に実施することで4時間以内に完了させることができます。本手順を試みる際は、本手法が標準化されている必要があり、適切にトレーニングを受けた担当者が実施する必要があることに留意することが重要です。

本手順に従うことで、残存するドナー由来の赤血球系前駆細胞をさらに解析し、遺伝子矯正された赤血球系幹細胞の選択的優位性などの追加的な疑問に対する答えを得ることができます。本手法の開発により、幹細胞移植分野の研究者が、赤血球系コンパートメントにおける前駆細胞の増殖と分化を探索する道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヘモグロビン症の患者における幹細胞移植後の生着をモニタリングする方法について、十分な理解を得ることができます。