Name: 主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学ぶエピソームリプログラミング法による羊水・膜由来胎児幹細胞からのiPSC誘導。化学的定義培地でゲノム統合リスクなく多能性幹細胞を樹立し、組織工学や疾患モデリング、小児治療応用への貴重な細胞源を提供する革新的手法です。

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この作品は、チューリッヒ大学、チューリッヒ大学、奨学金 10.216 と 12.176、スイス社会循環器科、スイス科学の下、サイエックス NMSChの Forschungskredit フォンこの上海虹橋によって支えられました。財団助成金 [320030 122273] の下と [310030 143992]、第 7 フレームワーク プログラム、生活バルブ、グラント [242008]、オルガ Mayenfisch 財団、EMDO 財団、大学病院チューリッヒの創業助成金 2012 の下欧州委員会と内部は、ミッチェルのがん研究所の資金調達。

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<li>Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+living+cardiac+and+venous+valve+replacements%3A+current+status+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects.</a> Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).</li>
<li>Slamecka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-integrating+episomal+plasmid-based+reprogramming+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).</li>
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<li>Pipino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trisomy+21+mid-trimester+amniotic+fluid+induced+pluripotent+stem+cells+maintain+genetic+signatures+during+reprogramming%3A+implications+for+disease+modeling+and+cryobanking%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking.</a> Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).</li>
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<li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Amniotic+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+May+Generate+a+Universal+Source+of+Cardiac+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).</li>
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<li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).</li>
<li>Müller, F. -J., Goldmann, J., Löser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).</li>
<li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

胎児幹細胞から iPSC 生成の最初のフェーズは、胎児の組織、彼らの文化、拡張、および episomal リプログラミング プラスミドの導入からソース セルの抽出を伴います。このフェーズの後に、最初の完全にプログラムし直された植民地を拡大することができます前に約 14-18 日間の培養期間が続きます。最終段階は、iPSC クローンの成熟です。羊膜幹細胞の最初の抽出は、羊膜の組合せ機械と酵素消化によって達成されます。インキュベーション時間 30 分最高最高の生存率で抽出した細胞数の結果がわかった。消化手順は、組織・細胞の塊の小さな断片を作り出すことができます。単一のセルを基準にしてこれらの割合が高い場合は、付着細胞の増殖に貢献することができますので、1 つの容器にすべての塊と単一細胞をめっきすることをお勧めします。セルのみ培養培地と混合し、付着細胞のコロニーが十分なサイズに到達するまでインキュベートした羊水幹細胞をめっきは簡単です。通常の組織培養処理容器に最適です、にもかかわらず、彼らは改良された一次電池文化低目と、継との難しさはこれらに観察したので、専門の表面、お勧めしませんプロセス。
<p class="jove_conten...

潜在的なセル置換療法、疾患と発達モデルと薬物毒性スクリーニング1,2,3の誘導多能性幹細胞 (iPSC) の技術をもたらします。細胞の注入により、補充療法が概念的には可能、体外 (心筋パッチ) などの組織移植を区別またはティッシュ エンジニア リングによる再生を誘導します。羊水 (AFSC) と膜幹細胞 (AMSC) いずれかこれらの介入のための細胞の優れた供給源は、直接4,5,6、7リプログラミングの開始セル人口多能性8,9,10、11,12。
初期のアプローチに使用される未定義の文化システムや9,10、11,12の構成要素を伴うゲノムの統合を必要とするメソッドをプログラムし直します。最近の研究より少なく定義された基底膜添付ファイル マトリックス (BMM) は、羊膜上皮細胞から iPSC を生成に使用されたにもかかわらず xeno 自由な媒体を採用しました。しかし、奇形腫形成アッセイは in vitro 及び分子データの富と共に研究に含まれません。新生児線維芽細胞13と比較して約 8 高いリプログラミング効率を持っている羊水上皮細胞が見つかりました。別の研究で、羊水から間葉系幹細胞は多く高効率12iPSC に再プログラムするも発見されました。
多能性幹細胞はすべての 3 胚葉組織代表に区別でき、このように広範な可能性があります。小児患者が恩恵を収穫、リプログラミングとその自家羊水幹細胞の組織工学胎児と羊膜幹細胞周産期。さらに、(成体幹細胞14,15より低い) 胎児の幹細胞の分化の低レベルは、iPSC16でソース セルからエピジェネティックなバイアスの観測の保持に対処に役立つ可能性が理論的に。
羊水をプログラムし直すためのプロトコルの紹介し、膜幹細胞の多能性を化学的に組換えビトロネクチン17 (VTN) episomal プラスミド18を使用して xeno E8 培を定義します。流体と膜羊膜の細胞リプログラミングのソースとしての主な利点は、利用前とこのアプローチは主に小児組織工学に研究の利益周産期そしてこうして。

<table><tbody><tr><td>腫瘍解離キット、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td>組織解離システム、試薬キット、組織解離チューブおよび組織解離酵素</td></tr><tr><td>gentleMACS Dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>組織解離システム、解離者</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&trade;シャンドン&トレード;使い捨てメス No. 10, 滅菌済み, 個別包装, 5.75 (14.6cm)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>3120032</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;Mセルストレーナー</td><td>Corning</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Thermo-Fisher</td><td>32404014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ロッキングプラットフォーム</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>サーモフィッシャー</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>サーモフィッシャー</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 基礎培地</td><td>ロンザ</td><td>CC-3156</td><td>AFMC 培地用基礎培地</td></tr><tr><td>FGF 2 ヒト (大腸菌で発現、非グリコシル化)</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-218</td><td>bFGF、AFMC培地</td></tr><tr><td>EGFヒト用サプリメント、Pichia</td><td>Prospec Bio</td><td>CYT-332&nbsp;</td><td>EGF、AFMC培地用サプリメント</td></tr><tr><td>LR3インスリン様成長因子-1ヒト組換えProspec</td><td>Bio</td><td>CYT-022</td><td>IGF、AFMC培地</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清用サプリメント、胚性幹細胞適格</td>サー<td>モフィッシャー</td><td>10439024</td><td>FBS</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬(100X)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15240062&nbsp;</td><td>一次AFSC / AMSCの場合、ルーチンAFSC / AMSCの場合、それは必要なく、トランスフェクションされた細胞の培地では使用しないでください!</td></tr><tr><td>Accutase細胞剥離溶液</td><td>StemCell Technologies</td><td>07920</td><td>細胞剥離酵素</td></tr><tr><td>CryoStor&trade;CS10</td><td>StemCell Technologies</td><td>07930</td><td>完全凍結培地</td></tr><tr><td>PBS、pH 7.4</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>10010023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree プラスミド マキシ キット (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>プラスミド単離</td></tr>用 <tr><td>pEP4 E02S EN2K</td><td>Addgene</td><td>20925</td><td>EN2K、リプログラミング因子 Oct4+Sox2、Nanog+Klf4</td></tr><tr><td>pEP4 E02S ET2K</td><td>Addgene</td><td>20927</td><td>ET2K、リプログラミング因子 Oct4+Sox2、SV40LT+Klf4</td></tr><tr><td>pCEP4-M2L</td><td>Addgene</td><td>20926</td><td>M2L、リプログラミング因子 c-Myc+LIN28</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c UV-Vis分光光度計</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000C</td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>Neon&reg;トランスフェクションシステム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MPK5000</td><td>トランスフェクションシステム、コンポーネント: ネオンピペット - トランスフェクションピペット ネオン装置 - トランスフェクション装置</td></tr><tr><td>ネオン&reg;トランスフェクションシステム10 &micro;Lキット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MPK1025</td><td>ネオントランスフェクションシステム用の消耗品キットには、次のものが含まれます: ネオンチップ-トランスフェクションチップ ネオンチューブ-トランスフェクションチューブ バッファーR-再懸濁バッファー バッファーE-電解</td></tr><tr><td>バッファーStemolecule&trade;酪酸ナトリウム</td><td>StemGent</td><td>04-0005</td><td>リプログラミングの小分子エンハンサー</td></tr><tr><td>TeSR-E8</td><td>StemCell Technologies</td><td>05940</td><td>E8 中</td></tr><tr><td>ビトロネクチン XF&trade;</td><td>StemCell Technologies</td><td>07180</td><td>VTN、在庫濃度250 & マイクロ;g / ml、1&microでのコーティングに使用されます。g/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer</td></tr><tr><td>CellAdhere&trade;希釈バッファー</td><td>StemCell Technologies</td><td>07183</td><td>ビトロネクチン希釈バッファー</td></tr><tr><td>UltraPure&trade; 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15575020</td><td>使用前にPBSで0.5 mMに希釈</td></tr>してください <tr><td>EVOS&reg;FLのイメージ投射システム</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>AMF4300</td><td>LCDのイメージ投射顕微鏡システム</td></tr><tr><td>CKX53 倒立顕微鏡</td><td>オリンパスの</td><td></td><td>相対照細胞培養の顕微鏡</td></tr><tr><td>Pierce&trade; 16%のホルムアルデヒド(w / v)、メタノールフリー</td>の<td>サーモフィッシャー28908</td><td></td>は<td>、使用前にPBSと4%に希釈し、希釈して2-8 >C 1週間</td></tr>の<tr><td>パーマバッファーIII</td><td>BD Biosciences</td><td>558050</td><td>透過化バッファー、-20°Cまで冷却。</td></tr><tr><td>マウスIgG1を使用する前のC、&κ;アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;488</td><td>BD Biosciences</td><td>557782</td><td>Oct3/4A、Nanog</td></tr><tr><td>Mouse IgG1、&kappaのアイソタイプコントロール。アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;647</td><td>BD Biosciences</td><td>557783</td><td>Sox2</td></tr><tr><td>Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>561628</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>560791</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>562139</td><td></td></tr><tr><td>マウスIgGM、&kappa;アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;488</td><td>BD Biosciences</td><td>401617</td><td>TRA-1-60マウスIgGMのアイソタイプコントロール</td></tr><tr><td>、&κ;アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;647</td><td>BD Biosciences</td><td>401618</td><td>isotype control for TRA-1-81</td></tr><tr><td>Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330705</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IgG1, &kappa;アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;488</td><td>BD Biosciences</td><td>400129</td><td>SSEA-1</td></tr><tr><td>Mouse IgG3のアイソタイプコントロール、&kappa;アイソタイプコントロール、Alexa Fluor&reg;647</td><td>BD Biosciences</td><td>401321</td><td>アイソタイプコントロール for SSEA-4</td></tr><tr><td>Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>BD Biosciences</td><td>323010</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor&reg; 647</td><td>BD Biosciences</td><td>330407</td><td></td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-606-068</td><td>1:600の希釈で使用するか、またはさらに最適化</td></tr><tr><td>Affinipure F(ab')2フラグメントヤギ抗マウスIgG + IgM、Alexa Fluor&reg; 647</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-546-068</td><td>1:600の希釈で使用または</td></tr>さらに<tr><td>最適化 DAPI</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>D21490</td><td>ストック溶液10 mM、さらに1:12.000に希釈して作業溶液</td></tr><tr><td>Corning&reg;マトリゲル&reg;成長因子の低減、フェノールレッドフリー</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td>基底膜マトリックス(BMM)</td></tr><tr><td>scid-beigeマウス、雌</td><td>のTaconic</td><td>CBSCBG-F</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plusミニキット (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>RNA分離キット</td></tr><tr><td>T-25フラスコ、組織培養処理</td><td>サーモフィッシャー</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>T-75フラスコ、組織培養処理</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td>156499</tr><tr><td>Nunc&trade; 組織培養皿</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12-567-650&nbsp;</td><td>10cmティッシュカルチャーディッシュ</td></tr><tr><td>6ウェルプレート、組織培養処理</td><td>サーモフィッシャー</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー計数室(血球計算計)</td><td>VWR</td><td>15170-173</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty&trade;冷凍コンテナ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>5100-0001&nbsp;</td><td>冷凍コンテナ</td></tr><tr><td>FACSチューブ、丸底ポリスチレン試験管、5ml</td><td>コーニング</td><td>352058</td><td>5mlポリスチレンチューブ</td></tr><tr><td>Eppendorfチューブ、1.5ml</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー05-402-96</td><td>1.5ml微量遠心チューブ</td></tr><tr><td>PCRチューブ、200&micro;l</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-222-262</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、100 から 1250 & マイクロ;l</td><td>サーモフィッシャー</td><td>02-707-407</td><td>ナローボア 1 mL チップ</td></tr><tr><td>ピペットチップ、5 〜 300 & マイクロ;l</td><td>サーモフィッシャー</td><td>02-707-410</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ、0.1 から 10 & マイクロ;l</td><td>サーモフィッシャー</td><td>02-707-437</td><td></td></tr><tr><td>ワイドボアピペットチップ、1000 & マイクロ;l</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td>広口径 1 mL チップ</td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>サーモフィッシャー</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200 プルーフ</td><td>サーモフィッシャー</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス ミキサー</td><td>VWR</td><td>10153-842</td><td></td></tr><tr><td>チャンバー カバーガラス、8 ウェル、1.5mm ホウケイ酸ガラス</td><td>サーモフィッシャー</td><td>155409</td><td>ガラス底共焦点グレードの培養器</td></tr><tr><td>22G ニードル</td><td>VWR</td><td>82002-366</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器</td><td>サーモフィッシャー</td><td>22-253-260</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン溶液、中性緩衝、10%</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>HT501128-4L</td><td>外植奇形腫の固定</td></tr><tr><td>イルミナ HT-12 v4 エクスプレッション ビーチチップ</td><td>イルミナ</td><td>BD-103-0204</td><td>エクスプレッション マイクロアレイ、PluriTest がサポート、メーカーにより販売終了</td></tr><tr><td>PrimeView Human Genome U219 Array Plate</td><td>Thermo-Fisher</td><td>901605</td><td>発現マイクロアレイ(旧Affymetrixブランド)、まもなくPluriTest</td></tr><tr><td>GeneChip&tradeによってサポートされます。Human Genome U133 Plus 2.0 Array</td><td>Thermo-Fisher</td><td>902482</td><td>発現マイクロアレイ(旧Affymetrixブランド)、CellNetがサポート、まもなくPluriTest</td></tr><tr><td>PluriTest&regが</td>サポートします。<td>Coriell Institute</td><td></td><td>www.pluritest.org、多能性のバイオインフォマティクス評価のための無料サービス、マイクロアレイデータを受け入れます - HT-12 v4プラットフォームからの*.idatファイル、まもなくU133、U219マイクロアレイ、およびRNAシーケンシングデータをサポートします</td></tr><tr><td>CellNet</td><td>ジョンズホプキンス大学</td><td></td><td>cellnet.hms.harvard.edu、U133マイクロアレイデータに基づく、多能性幹細胞を含む細胞タイプのバイオインフォマティクス同定のための無料サービス - *.celファイル、まもなくRNAをサポートシーケンシングデータ</td></tr></tbody></table>

主な羊水および膜 xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

自家細胞を用いた治療法は、誘導多能性幹細胞の導入により現実に近い方のステップを得た。羊水など膜幹細胞、胎児の幹細胞は、組織工学、将来小児の介入と幹細胞のバンキングの iPSC にプログラムし直す約束の未分化細胞のユニークな型を表します。ここで提示されたプロトコルを抽出するための最適化手順をについて説明し、プライマリ羊水液と膜間葉系幹細胞を培養させ、episomal 誘導これら完全に化学的に定義された培養細胞からの多能性幹細胞人間の組換えビトロネクチンおよび E8 媒体利用の条件。-フローサイトメトリー、共焦点レーザー顕微鏡、奇形腫形成と転写プロファイリング-厳格な方法を適用することによって新しい行の評価についても述べる.新しく生成された行は、SSEA 1 のマーカーが陰性でありながら胚性幹細胞-Oct3/4 a、Nanog、Sox2、トラ-1-60、トラ-1-81-SSEA 4 のマーカーを表現します。幹細胞は、6-8 週間でベージュ scid マウスにおける奇形を形成し、奇形を含むすべての 3 つの細菌層の代表的な組織。Bioinformatic 多能性評価アルゴリズムをグローバル発現マイクロ アレイ データを提出することにより、行の転写プロファイリングすべて行多能性としたがって、このアプローチは、動物実験に代わる。IPSC の新しい行は、分化とティッシュ エンジニア リングの最適化を含む下流の実験で容易に使用できます。

通知の書面による同意は、遺伝テストの目的と研究のための流体の小さい因数を捧げての羊水を採取する前に患者から得られました。胎盤は医療廃棄物を表し、同意は羊膜の研究の使用のため必要ありません。羊水の流体と膜幹細胞は典型的な間葉系プロパティを表示、形態学的、細胞は紡錘形と相明るい。リプログラミング、セル間葉系上皮性 (MET) 遷移に入るし、石畳のような形態と上皮プロパティを示すコロニーの空間組織を取得します。このプロセスは、早ければ 48 72 h episomal プラスミドをリプログラミングの導入開始します。リプログラミングの 5 日目でこれらのコロニーの不在は、実験の失敗を示します。MET の植民地の細胞が増殖、その結果、植民地なるコンパクト 5 と 14 日間。コンパクトな MET のコロニーは個別に簡単に目に見える (図 1 a) は細胞から成り立っています。14 日の周り完全にプログラムし直された植民地表示されます顕著、運ぶ、単分子膜の配置のセルで簡単に識別できる核と核小体。彼らは機械的に分離し、植民地の...

このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal アプローチを用いた誘導多能性幹細胞にプライマリ羊水液と膜間葉系幹細胞のリプログラミングをについて説明します。抽出、文化、リプログラミング、および厳格な方法で結果の誘導多能性幹細胞の特性の手順に。

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

本手順の全体的な目的は、2種類の異なる胎児幹細胞から、エピソーマルリプログラミングを用いて人工多能性幹細胞（iPS細胞）を効率的に誘導することです。この手法は、組織工学、疾患モデリング、基礎研究、または縦断的研究のための多能性幹細胞の供給源を確保するのに役立ちます。本技術の主な利点は、iPS細胞のリプログラミングと成熟が化学的に定義された条件下で行われ、さらに潜在的な小児向け細胞治療に早期に利用可能であることです。本手順の実演は、責任研究者のSteven McClellanと私が行います。出産後、できるだけ速やかに胎盤を回収してください。羊膜を9平方センチメートルの大きさに切り取り、抗生物質・抗真菌剤溶液を添加したPBS 30 mLを入れた50 mm遠心チューブ内で洗浄します。膜から血凝塊を取り除き、次に精密メスを用いて、滅菌済みの10センチメートルの組織培養ディッシュ内で膜を細かく刻みます。メスで刻んだ膜組織の塊を、4.7 millilitersのRPMI-1640培地を含む組織解離チューブに転移させます。解離酵素を加えて混ぜ合わせます。チューブを組織解離器に装着し、プログラムh_tumor_01を実行します。次に、チューブをロッキングプラットフォーム上で37 °Cで30分間インキュベートします。さらに、懸濁液を35 mLのRPMI-1640で希釈し、50 mL遠心チューブの上に配置した70 µmストレーナーに通します。室温で200 ×gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを5 mLのRPMI-1640で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。抗生物質および抗真菌剤溶液を添加し、新たに調製したAFMC培地が入った組織培養フラスコに、細胞クラスターを1 cm²あたり約10,000個の密度で播種します。T75フラスコ1本から、リプログラミング用の低継代数の羊水および羊膜幹細胞を回収するため、細胞シートに2 mLの細胞遊離酵素を添加します。37 °Cで5〜8分間インキュベートします。200 ×gで45分間遠心分離した後、ペレットを1 mLのPBSに再懸濁し、よく混ぜて血清成分を洗浄します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。次に、細胞密度をPBS 1 mLあたり100,000 cellsに調整し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。通常のスイングバケットローターで遠心分離できるよう、マイクロ遠心チューブを5 mLポリスチレンチューブに入れ、室温で200 ×gにて4分間遠心分離します。遠心後、チューブを反転させて上清を廃棄容器に捨て、その後、200 ×gで3分間の追加遠心ステップを行います。遠心後、200 µLピペットを使用して、チューブ内の残液を注意深く吸引します。トランスフェクション用チップ、チューブ、再懸濁バッファー、および電解バッファーを細胞培養キャビネット内に配置します。トランスフェクション装置を近づけ、チューブステーションをキャビネット内に直接配置できるようにします。トランスフェクションチューブ1本に3 mLの電解質バッファーを満たし、チューブをスロットの奥まで押し込んでステーションに取り付けます。あらかじめ調製しておいたリプログラミングプラスミド溶液のアリコートを-80 °Cの保存庫から取り出し、培養キャビネット内で室温で解凍させます。デバイスのトランスフェクションパラメータを、950 Vで40 msの単一パルスを印加するように設定します。100,000個の細胞を含むペレットを10 µLの再懸濁バッファーで再懸濁します。迅速に、再懸濁した細胞にリプログラミングプラスミド溶液の1/10量を加えます。トランスフェクション用チップをトランスフェクションピペットに取り付けます。次に、気泡が形成されないように注意しながら、細胞懸濁液をトランスフェクション用チップに吸引します。トランスフェクションピペットをトランスフェクションチューブに挿入します。次に、トランスフェクション装置の画面にあるスタートボタンを押します。画面にトランスフェクションが完了した旨のメッセージが表示されるまで待ちます。その後、直ちにチューブからピペットを取り出してください。懸濁液を、目的の6ウェルプレートの1つのウェルに分注します。隣接するウェルの培地と混ぜ合わせ、懸濁液を2つのウェルに均等に分配します。細胞が入った各マイクロ遠心チューブについて、同様にトランスフェクションを行います。まず、5本のPCRチューブに0.5 mM EDTAとPBSを30 µLずつ加えます。次に、2 µLに設定した10 µLピペットにチップを装着します。ピペットチップをコロニーの端に角度をつけて保持し、コロニー全体を表面から慎重かつ徐々に掻き取ります。コロニー全体をすぐにピペットチップで吸引し、EDTAを入れた準備済みのPCRチューブの1つに転移させます。他の4つのコロニーでも同様の操作を繰り返した後、室温で4～6分間インキュベートします。より大きなピペットチップを用いて、各細胞懸濁液をゆっくりとピペッティングし、コロニーをより小さな塊に分散させます。単細胞懸濁液を作成しないでください。その後、懸濁液をリコンビナントビトロネクチンでコートした24ウェルプレートの目的のウェルに直接播種します。残りのコロニーに対してもこの操作を繰り返し、3〜6日間インキュベートします。4〜6日後、コロニーが成長し凝集したところで、細胞シートを300 µLの0.5 mM EDTAで洗浄し、直ちに吸引します。その後、さらに300 µLを添加し、室温で5分間インキュベートします。EDTAを吸引した後、1 mLピペットを最大容量に設定し、1 mLワイドボアチップを装着して、ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートの標的ウェルからE8培地を吸引します。ソースプレートの1ウェルに培地を勢いよく注入し、iPSC培養物を洗い流します。次に、その懸濁液をターゲットウェルに移し、ピペッティングを数回繰り返して、コロニーを20～40細胞のクランプ状にバラバラにします。すべての細胞を播種した後、プレートを静かに揺らし、クランプが均一に分散するようにします。その後、クランプの接着とコロニーの増殖のため、プレートをインキュベーターに戻します。リプログラミングのソース細胞となる羊水および羊膜幹細胞は、伸長した位相明な典型的な間葉系形態を示します。細胞は間葉系-上皮系移行（MET）を経て上皮的特性を獲得し、これにより石畳状の細胞からなるコロニーが形成されます。これらのコロニーは増殖し、MET細胞による不規則な細胞塊を形成します。リプログラミングの後期段階になると、完全にリプログラミングされた細胞のコロニーが出現し、境界が明確で個々に識別可能な細胞となります。これらの完全にリプログラミングされた細胞は、より数多く存在するMETコロニーと共に存在しています。完全にリプログラミングされた単離成熟クローンをここに示します。iPSCの誘導と成熟後、詳細な特性解析を行い、さまざまな細胞種への分化を誘導させることができます。病原体の有無が確認されていないヒト組織を取り扱うことは非常に危険であるため、本手順の実施に際しては、個人用保護具の着用やバイオセーフティーキャビネット内での作業など、常に適切な予防措置を講じてください。このビデオを視聴することで、胎児幹細胞における多能性誘導の方法、使用する試薬と装置、および多能性幹細胞の日常的な培養方法について深く理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この研究は、奇形腫を生成せずに、生体内での体細胞の多能性に向けた再プログラミングを示しています。ヤマンカ因子をコードするプラスミドDNAの流体力学的尾静脈注入を使用して、成体肝細胞の多能性が強化された細胞へのin...

山中因子の過剰発現によって多能性の成体体細胞のin vivoでの再プログラミング中

マウス胚性線維芽細胞は、転写因子Oct-4、Sox-2、Klf-4、c-Mycの強制発現により、低効率で人工多能性幹細胞に再プログラムすることができます。リプログラミング反応のまれな中間体は、細胞表面メーカーであるThy-1.2、Ssea-1、およびEpcamに対する抗体による標識により単離されたFACSです。...

リプログラマブルマウスモデルからのiPS細胞の中間体の精製を媒介細胞表面マーカー

Xenopusの胚では、胚盤胞の屋根からの細胞は多能性であり、さまざまな組織を生成するようにプログラムすることができます。ここでは、両生類の胚盤胞の屋根外植片をアッセイシステムとして使用するプロトコルについて説明し、初期の神経発達の主要なin vivoおよびin...

幹細胞様<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚外植片を早期神経発達の特徴を研究するために<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

この研究では、非ウイルスベースのトランスポゾンシステムを使用して、マウスの羊水細胞から人工多能性幹細胞を生成します。...

トランスポゾンのシステムを用いたマウスの羊水細胞から多能性幹細胞の作製

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60...

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

ここでは、化学的エピジェネティック消去と機械化関連の手がかりを組み合わせて、遺伝子トランスフェクションやレトロウイルスベクターを必要とせずに哺乳類の多能性細胞を効率的に生成する方法を紹介します。したがって、この戦略はトランスレーショナル医療にとって有望であり、幹細胞オルガノイド技術の顕著な進歩を表しています。...

エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

学ぶエピソームリプログラミング法による羊水・膜由来胎児幹細胞からのiPSC誘導。化学的定義培地でゲノム統合リスクなく多能性幹細胞を樹立し、組織工学や疾患モデリング、小児治療応用への貴重な細胞源を提供する革新的手法です。

主な羊水および膜 Xeno 無料条件で多能性細胞をリプログラミング

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