2017年11月27日
このプロトコルでは、完全に化学的に定義された条件における非統合 episomal アプローチを用いた誘導多能性幹細胞にプライマリ羊水液と膜間葉系幹細胞のリプログラミングをについて説明します。抽出、文化、リプログラミング、および厳格な方法で結果の誘導多能性幹細胞の特性の手順に。
この手順の全体的な目標は、2種類の胎児幹細胞からのエピソームリプログラミングにより、人工多能性幹細胞を効率的に誘導することです。この方法は、組織工学、疾患モデリング、基礎研究、または縦断的研究のための多能性幹細胞の供給源を提供するのに役立ちます。この技術の主な利点は、iPS細胞のリプログラミングと成熟が化学的に定義された条件で進行すると同時に、潜在的な小児細胞ベースの治療に早期に利用できることです。
この手順を実証するのは、主任研究者の Steven McClellan と私です。出生後できるだけ早く胎盤を入手してください。羊膜の9平方センチメートルの部分を切り取り、抗生物質、抗真菌剤溶液を補給した30ミリリットルのPBSを入れた50ミリメートルの遠心分離管で洗浄します。
メンブレンから血栓を取り除き、次に細いメスを使用して、滅菌済みの10センチメートルの組織培養皿でメンブレンを細かく刻みます。メスの刃を使用して、細かく刻んだ膜組織塊を4.7ミリリットルのRPMI-1640培地を含む1本の組織解離チューブに移します。解離酵素を混ぜます。
チューブを組織解離器に取り付け、プログラムh_tumor_01を実行します。次に、チューブを摂氏37度でロッキングプラットフォーム上で30分間インキュベートします。懸濁液を35ミリリットルのRPMI-1640でさらに希釈し、50ミリリットルの遠心分離チューブの上に置いた70ミクロンのストレーナに適用します。
室温で200倍gで5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを5ミリリットルのRPMI-1640に再懸濁し、血球計算盤を用いて細胞をカウントします。細胞クラスター内の細胞を、1平方センチメートルあたり約10,000細胞の密度で、抗生物質、抗真菌溶液を添加した新たに調製したAFMC培地を組織培養フラスコに播種します。
1つのT75フラスコからリプログラミング用の継代数の低い羊水および膜幹細胞を回収し、細胞シートに2ミリリットルの細胞剥離酵素を添加します。摂氏37度で5〜8分間インキュベートします。200倍gで45分間遠心分離した後、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁し、よく混合して血清成分を洗い流します。
血球計算盤を使用して細胞をカウントします。次に、細胞密度をPBSのミリリットルあたり100、000細胞に調整し、1.5ミリリットルの微量遠心チューブにクワッドします。微量遠心チューブを5ミリリットルのポリスチレンチューブに入れて、通常のスイングラダーで遠心分離できるようにし、室温で200gで4分間遠心分離します。
スピン後、チューブを反転させ、上清を廃液容器に捨て、さらに200gで3分間遠心分離を行います。スピン後、200マイクロリットルのピペットを使用して、チューブから残っている液体を慎重に吸引します。トランスフェクションチップ、チューブ、再懸濁バッファー、および電解バッファーを組織培養キャビネットに入れます。
トランスフェクションデバイスを近づけて、チューブステーションをキャビネットに直接配置できるようにします。1本のトランスフェクションチューブに3ミリリットルの電解バッファーを充填し、チューブをスロット内に完全に押し込んでステーションに取り付けます。マイナス80°Cの貯蔵庫から事前に調製したリプログラミングプラスミド溶液のアリコートを取り出し、培養キャビネット内で室温で解凍します。
デバイスのトランスフェクションパラメータを設定して、950ボルトで40ミリ秒の1パルスを送達します。100,000個の細胞を含むペレットを10マイクロリットルの再懸濁緩衝液に再懸濁します。迅速に作業し、再懸濁した細胞にリプログラミングプラスミド溶液の1/10を添加します。
トランスフェクションチップをトランスフェクションピペットに取り付けます。次に、気泡の形成を避けながら、細胞懸濁液をトランスフェクションチップに吸引します。トランスフェクションピペットをトランスフェクションチューブに挿入します。
トランスフェクションデバイスの画面にあるスタートボタンを押します。トランスフェクションの成功に関する画面メッセージを待ちます。その後、すぐにピペットをチューブから取り外します。
懸濁液をターゲットの6ウェルプレートの1つのウェルに排出します。隣接するウェルから培地を混合し、懸濁液を両方のウェルに均等に分配します。細胞が入った各微量遠心チューブについて、トランスフェクションを繰り返します。
まず、30マイクロリットルの0.5ミリモルEDTAとPBSを5本のPCRチューブに加えます。次に、2マイクロリットルに設定された10マイクロリットルのピペットにチップをロードします。ピペットの先端をコロニーの端で斜めに保持し、コロニー全体を表面から慎重に徐々にこすり落とします。
直ちにコロニー全体をピペットチップに吸引し、EDTAで調製したPCRチューブの1つに移します。このプロセスを他の4つのコロニーで繰り返した後、室温で4〜6分間インキュベートします。大きめのピペットチップを使用して、各細胞懸濁液をゆっくりと上下にピペッティングし、コロニーを小さな塊に分解します。
単一細胞懸濁液を作成しないでください。次に、懸濁液を組換えビトロネクチンでコーティングした24ウェルプレートのターゲットウェルに直接プレートします。残りのコロニーについてこのプロセスを繰り返した後、3〜6日間インキュベートします。
4〜6日後、コロニーが成長してコンパクトになったら、細胞シートを300マイクロリットルの0.5ミリモルEDTAで洗浄し、すぐに吸引します。次に、さらに300マイクロリットルを加え、室温で5分間インキュベートします。EDTAを吸引した後、1ミリリットルのピペットを容量にセットし、1ミリリットルのワイドボアチップに取り付け、ビトロネクチンでコーティングした6ウェルプレートのターゲットウェルからE8培地を吸引します。
ソースプレートの1つのウェルで培地の流れを噴出させ、iPSC培養物を洗い流します。次に、懸濁液をターゲットウェルに移し、数回上下にピペットで動かして、コロニーを20〜40個の細胞の塊に分解します。すべての細胞をプレーティングした後、プレートを静かに揺さぶって振とうすることにより、塊が均等に分布していることを確認します。
その後、プレートをインキュベーターに戻して、凝集膜の接着とコロニーの成長を行います。リプログラミングのソース細胞である羊水および膜幹細胞は、細長い位相明度を持つ典型的な間葉系形態を示します。細胞は、間葉系から上皮への移行を経て上皮特性を獲得し、丸石のような細胞を持つコロニーが形成されます。
これらのコロニーは増殖し、MET細胞の不規則な細胞塊を作り出します。リプログラミングの後期には、完全にリプログラミングされた細胞のコロニーが出現し、明確に定義された境界を持つ個別に識別可能な細胞が出現します。これらの完全に再プログラム化された細胞は、より多数のMETコロニーと並んで存在します。
完全に再プログラムされた分離された成熟したクローンがここに表示されます。iPS細胞の誘導と成熟後、詳細な特性評価を行い、さまざまな細胞タイプへの分化を指示することができます。病原体の存在がテストされていない人間の組織を扱うことは非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、個人用保護具やバイオセーフティキャビネットでの作業などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
このビデオを見れば、胎児幹細胞の多能性を誘導する方法、使用する試薬や機器、多能性幹細胞の日常的な培養方法についてよく理解できるはずです。
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このプロトコルは、非統合型エピソームアプローチを用いて胎児幹細胞から誘導多能性幹細胞(iPSC)を効率的に誘導することについて概説しています。このプロセスは完全に化学的に定義された条件下で行われ、研究および治療の様々な応用に適しています。
Reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency under xeno-free, chemically defined conditions advances the reliability and scalability of iPSC generation for biopharma R&D. This approach enables early-stage access to pluripotent lines for tissue engineering, disease modeling, and pediatric cell therapy research, while supporting portfolio strategies that require standardized, animal-free workflows. The method's rigorous characterization pipeline enhances predictive confidence and reduces biological risk at key discovery inflection points.
This xeno-free iPSC derivation method integrates from early discovery through preclinical research, supporting lead identification and translational studies.