植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

この最適化されたmRNAインタラクトームキャプチャの全体的な目標は、植物細胞からmRNA結合プロテオームを単離し、同定することです。この方法は、シロイヌナズナの葉の中葉プロトプラストに適用され、さまざまな細胞アッセイで汎用性の高いツールとして使用される細胞タイプです。この方法は、植物メッセンジャーRNA結合タンパク質の役割の発見と理解など、転写後遺伝子制御インプラントの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、結合したプロテオーム上の植物メッセンジャーを生理学的環境から直接分離して同定できることです。したがって、この方法は、アリズナの葉プロトプラスト由来のメッセンジャーRNA結合タンパク質に関する洞察を得ることができます。また、他の植物のプロトプラストや組織などの他のシステムにも適用できます。

この方法が最初に思いついたのは、酵母や哺乳類の細胞株にうまく適用されていることに気づいたときでした。シロイヌナズナ葉中葉プロトプラストを2つの異なるサンプルで単離します(テキストプロトコルに記載されているように)。UV架橋されていないコントロールサンプル、または非CLサンプルを氷上に保管してください。

架橋するプロトプラスト懸濁液、またはCLサンプルを大きなシャーレに移します。30ミリリットルの氷冷MMG溶液を皿に加えて表面を覆い、穏やかなピペッティングで細胞を広げます。UV架橋装置に輸送するときは、シャーレをアルミホイルで覆います。

開いたシャーレをすぐにUV架橋装置に入れます。ディッシュとUVランプの距離が8センチメートルであることを確認してから、サンプルに1分間照射します。その後、ペトリ皿からのプロトプラスト懸濁液を2本の新しい50ミリリットルの丸底チューブにすばやく分注します。

皿の底をさらに5ミリリットルの氷冷MMG溶液で洗い、残りのプロトプラストを収集します。サスペンションを2つのチューブに分割します。次に、非CLと2本のCLサンプルチューブを100 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、CL以外のペレットを入れたチューブを氷上に戻します。各CLサンプルチューブに10ミリリットルの氷冷MMG溶液を加え、チューブを静かに振ってペレットを再懸濁します。2つのサンプルを1つの50ミリリットルの丸底チューブに結合した後、摂氏4度で100倍のgで5分間遠心分離します。

上清を捨てた後、ペレットを氷の上に置いておきます。次に、9ミリリットルの氷冷溶解結合バッファーを各サンプルの細胞ペレットに加えます。溶液が均質な薄緑色になるまで、約20回ピペッティングしてプロトプラストを溶解します。

均質化のためには、細い針でプロトプラスト溶解物を50ミリリットルのガラスシリンジに2回通過させ、次いで溶解物を氷上で10分間インキュベートする。サンプルを液体窒素で凍結し、摂氏マイナス80度で最大3週間保存します。凍結したプロトプラストライセートでチューブを室温で解凍した後、チューブを氷上に保ちます。

1.8ミリリットルのオリゴd(T)磁気ビーズを、氷の上に置いた6本の新しい2ミリリットル丸底マイクロ遠心チューブに分注します。各チューブ内のビーズ懸濁液を600マイクロリットルの溶解結合緩衝液で短時間ピペッティングして洗浄し、ローテーター上でビーズを2分間静かに回転させます。ビーズを氷の上に置いておきます。

次に、ビーズが入った6本のチューブすべてを磁気ラックに少なくとも3分間入れて、完全な磁気捕捉に十分な時間を確保します。ビーズが完全に捕捉されると、懸濁液が透明になります。次に、6つのチューブすべてから上清を捨て、すぐに9ミリリットルのプロトプラスト溶解物をそれらに分注します。

懸濁液が茶色で均質になるまでピペッティングしてビーズをライセートと混合します。チューブを摂氏4度で1時間、穏やかに回転させてインキュベートします。インキュベーション後、チューブを磁気ラックに3分間戻します。

チューブの側面にすべてのビーズが捕捉されたら、プロトプラスト溶解物を含む上清を6本の新しい2ミリリットル丸底マイクロ遠心チューブに集めます。次に、ビーズが入った各チューブに1.5ミリリットルの氷冷洗浄バッファーを1つずつ加え、ピペッティングでビーズを再懸濁します。1分間穏やかに回転させた後、チューブを磁気ラックに3分間戻します。

上清を捨て、この洗浄手順を一度繰り返します。1.5ミリリットルの氷冷洗浄緩衝液2を使用して、同じ洗浄手順を2回繰り返します。mRNPがプロトプラストライセートから効率的に単離されている場合、CLサンプルのビーズペレットの周囲にハローが見えるはずです。

最後に、1.5ミリリットルの氷冷低塩緩衝液で洗浄手順を一度繰り返します。洗浄後、各チューブに500マイクロリットルの溶出バッファーを添加し、ピペッティングでビーズを穏やかに再懸濁します。摂氏50度で3分間インキュベートし、ポリAテールRNAを放出します。

一度ピペッティングしてビーズを静かに再懸濁し、チューブを摂氏4度の磁気ラックに5分間戻します。6 つのチューブすべてから溶離液を移し、氷上に置かれた 15 ミリリットルの円錐底チューブに溶離液を移し、組み合わせます。これにより、約 3 mm の溶離液が得られます。

RNAの品質と量は、分光光度計を使用してすぐに測定できます。再利用するオリゴd(T)ビーズを1ミリリットルの氷冷溶出緩衝液で2回洗浄して調製します。その後、1ミリリットルの氷冷溶解結合緩衝液で洗浄し、塩分濃度を500ミリモルに戻します。

これらの洗浄したoligo-d(T)ビーズを使用して、結合、洗浄、溶出の手順をさらに2ラウンド繰り返します。これにより、プロトプラスト溶解物からポリAテールRNAが枯渇し、各サンプルに対して合計9mmの溶離液が生成されます。ビーズは保存して、最大3回まで別の実験に使用できます。

RNAの品質をテストするには、テキストプロトコルに従って、UV架橋タンパク質をプロテイナーゼK溶液で消化します。次に、RNA精製キットを使用してRNAを精製し、残留汚染物質を除去します。精製後、サンプルはqRT-PCRを使用したRNA品質試験の準備が整います。

まず、各サンプルの8ミリリットルを、RNAse AおよびRNAse T1を含む100ユニットのRNAseカクテルで処理します。短時間のボルテックス後、サンプルを摂氏37度で1時間インキュベートします。mRNA結合タンパク質(mRBP)を濃縮するには、遠心フィルターユニットを使用してサンプルをろ過します。各サンプルは、2マイクログラムのタンパク質を含む75マイクロリットルを生成します。

長期保存の場合は、サンプルをマイナス80°Cで凍結します。SDSページゲルを泳動するには、各濃縮サンプル25マイクロリットルを15マイクロリットルの2Xローディング色素と混合し、サンプルを摂氏95度で5分間加熱します。サンプルを 5% のスタッキングゲルと 12% の分離ゲルを含む SDS ページゲル上のタンパク質マーカーにロードします。

次に、ゲルを超純水で2回、1回の洗浄につき5分間洗浄します。市販の銀染色キットを使用してゲルを染色します。十分な数の出発プロトプラストが使用されている場合、タンパク質バンドは5分以内に現れます。

mRBPをさらに試験するには、テキストプロトコールで説明されているように、2番目の1Dページゲルからペプチドを精製します。これらの精製ペプチドは、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、質量分析、定性的および定量的プロテオミクスで分析できるようになりました。オリゴd(T)ビーズ捕捉後、qRT-PCRは、18S rRNAと比較して、ポリユビキチン10参照mRNAのレベルが有意に高いことを示しました。

oligo-d(T)ビーズはポリAテールRNAにしか結合しないため、mRNAは溶離液に富んでいることが示唆されます。オリゴ-d(T)ビーズによるmRBPの捕捉は、銀染色されたSDSページゲルによってさらに評価されます。このゲルは、UV架橋CLサンプル中の方が非架橋非CLサンプルに比べて有意に高いタンパク質量を示しています。

UV照射の持続時間は、架橋の効率に影響を与える可能性があります。この銀染色されたSDSページゲルは、1分または3分間のUV照射が最適な条件であり、最も強いバンド強度を有することを確認しています。定量的プロテオミクス分析により、合計325のタンパク質が同定されました。

これらのタンパク質のうち225個は、各タンパク質に存在量が少ないペプチドであり、ペプチド強度のばらつきが大きいため、有意水準を下回っていました。しかし、いずれもCL検体のみで定性的に検出されたため、いずれも陽性結果とされた。これらの325種類のタンパク質は、さらにリボソームタンパク質、メインRBP、候補RBPの3つに分類されました。

候補RBPは従来のRNA結合ドメインを欠いており、その役割のほとんどが検証されていないことから、RNA制御における新しい機能の可能性が示唆されています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば1週間で完了できます。開発後、この技術は、植物の分子制御経路の分野の研究者が、双子葉植物や単子葉植物の細胞や組織におけるゲノムワイドなメッセンジャーRNA結合プロテオームを探索する道を開きました。