Name: 植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: 学ぶ、mRNAインターアクチベント捕獲法を用いてArabidopsis thalianaの葉肉プロトプラストからmRNA結合タンパク質を分離・同定する手法。この方法は植物の転写後制御機構の理解に貢献します。

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我々は、従来のUVランプを備えたUV架橋装置を提供したJoris Winderickx教授の研究室を認めている。 KGはKUルーベン研究基金の支援を受けており、FWOグラントG065713Nの支援を受けています。

著者は何も開示することはない。

我々は、酵母およびヒト細胞のために開発されたmRNA相互作用捕獲を植物葉の葉の葉のプロトプラストに首尾よく適用した。リーフ葉肉細胞は、植物の葉における地上組織の主要なタイプである。この方法の主な利点は、生理学的環境からタンパク質を発見するためにインビボ架橋を使用することである。 このプロトコルでは、我々は、主に最適化された実験条件（ 例えば、出発材料として使用するプロトプラストの数及びUV照射の期間）50の数を提示します。最小10 7個のプロトプラスト（中規模）を使用する場合（ステップ1.5.5）、CLサンプル中の捕捉タンパク質は、SDS-PAGEおよび銀染色によってのみ検出することができる。より低い濃度は、SDS-PAGE上で観察可能なmRBPパターンを生じさせず、プロテオミクスによるさらなる分析にはおそらく使用すべきではない。実際に、10 7を超える細胞（ 例えば、 10 9 in大規模実験も可...

真核生物は、細胞の生物学的プロセスを維持するために複数のRNA生合成調節経路を使用する。 RNAの既知のタイプのうち、mRNAが非常に多様であり、タンパク質のコード容量を運び、それらのアイソフォーム1つの選択図PTGR経路は、プレmRNA 2,3の運命を指示します。異なる遺伝子ファミリーからのRBPがRNAの調節を制御し、PTGRにおいて、特定のmRBPは機能的なmRNPを形成する直接的な物理的相互作用を介してmRNAを誘導する。したがって、mRBPsおよびそれらmRNPsを同定および特徴づけることは過去30年間.Over細胞mRNA代謝2の調節を理解するために重要であり、種々のインビトロ法- RNA電気泳動移動度シフト（REMSA）アッセイ、指数関数的濃縮アッセイによるリガンドの系統的進化含みますライブラリー由来の構築物、RNA Bind-n-Seq（RBNS）、放射性標識または定量的標識蛍光RNA結合アッセイ、X線結晶学、及びNMR分光法は、4、5、6、7、8、9 -広く主に哺乳動物細胞から、RBPsの研究に適用されています。哺乳動物RBPのこれらの研究の結果は、公開された観察を収集するRNA結合タンパク質データベース（RBPDB）を介して検索することができる10 。 これらのインビトロアプローチは強力なツールであるが、所定のRNAプールからの結合RNAモチーフを決定するため、新しい標的RNAを発見する能力には限界がある。タンパク質配列および構造の保存に基づくゲノム全体のRBPを予測するための計算戦略についても同様である15 。これを克服するために、新しい実験方法ha目的のRBPが相互作用するRNAモチーフの同定を可能にし、結合の正確な位置の決定を可能にする。 「架橋および免疫沈降」（CLIP）と呼ばれるこの方法は、インビボ UV架橋およびその後の免疫沈降11からなる 。初期の研究では、DNAおよびRNAヌクレオチドの光活性化は、245nmを超える励起UV波長で起こり得ることが示されている。チミジンを介した反応が好ましいと思われる（光反応性の減少の順にランク：dT≧dC&gt; rU&gt; rC、dA、dG） 12 。波長254nm（UV-C）のUV光を用いて、数オングストローム（Å）の範囲でRNAヌクレオチドとタンパク質残基との間の共有結合が形成されることが観察された。したがって、この現象は、RNAおよびRBPの「ゼロ長」架橋と呼ばれている。これに続いて、厳格な精製手順<html>少し背景13、14とdure。 CLIPに相補的な戦略は、インビボ UV架橋とタンパク質同定とを組み合わせて RBPの景観を記述することである。そのようなゲノムワイドなmRNAの結合プロテオームの数は、「のmRNAインタラクトームキャプチャ」18と呼ばれるこの新規な実験的アプローチを用いて、酵母細胞、胚性幹細胞（ESC）、およびヒト細胞株（ 例えば、HEK293及びHeLa細胞）から単離されています19、20、21。この方法は、インビボ UV架橋、続いてmRNP精製およびMSに基づくプロテオミクスからなる。この戦略を適用することによって、非カノニカルRBDを含む多くの新規の「月明かり」RBPが発見されており、以前よりも多くのタンパク質がRNA結合能力を有することが明らかになった「&gt; 15、16、17は 、この方法を使用することは、新しいアプリケーションやRBPsを調査する際、新たな生物学的な質問に答える能力が可能になります。例えば、最近の研究では、mRNA結合プロテオーム（コアRBPの保全を検討していますプロテオーム） 22 。 プラントRBPsはすでに成長と開発に関与することが見出されている（ 例えば 、ミトコンドリアと葉緑体における開花時期の転写後調節、概日時計、および遺伝子発現に）24、25、26、27、28、29 。さらに、それらは、非生物的ストレス（ 例えば、寒さ、干ばつ、sa）に応答する細胞プロセスにおいて機能を果たすと考えられているlinity、およびアブシジン酸（ABA））31、32、33、34。 RNA認識モチーフ（RRM）およびKホモロジー（KH）ドメイン配列モチーフに基づいて、 シロイヌナズナゲノム中に200を超える予測されたRBP遺伝子が存在する。イネにおいて、約250 35、36を注目されています。多くの予測されたRBPが、植物に独特であるようである（ 例えば、 RRMドメインを含む予測シロイヌナズナ RBPの約50％に対するメタアゾーンオーソログはない） 35 、これは多くが新しい機能を果たし得ることを示唆している。最も予測されたRBPの機能は特徴付けされていない23 。 シロイヌナズナ由来のmRNA結合プロテオームの単離は、苗木、葉組織、培養根細胞、および葉の葉肉プロトプラストを、mRNAインタラクトームキャプチャは最近、38、39に報告されています。これらの研究は、近い将来植物における機能的RBPを体系的に分類する強力な可能性を実証している。ここで、我々は、植物プロトプラスト（ すなわち、細胞壁を有さない細胞）からのmRNA相互作用の捕獲のためのプロトコールを提示する。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストは、葉の細胞の主要なタイプである。単離されたプロトプラストは、細胞へのUV光の最適なアクセスを可能にする。この細胞型は一過機能的特徴40、41タンパク質を発現アッセイにおいて使用され得ます。また、プロトプラストは、いくつかの他の植物細胞型および種42、43、44に印加されている（ 例えば、ピーターソンら 、2009; Bargmannとバーンバウム2010;および香港ら 、2012）。 &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt;このメソッドには合計11のステップが含まれています（ 図1A ）。 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストを最初に単離し（ステップ1）、次にUV照射して架橋したmRNPを形成する（ステップ2）。プロトプラストを変性条件下で溶解すると（ステップ3）、架橋されたmRNPは溶解/結合緩衝液中に放出され、オリゴd（T） 25ビーズによって引き下げられる（ステップ4）。数回のストリンジェントな洗浄の後、mRNPを精製し、さらに分析する。 mRBPの変性ペプチドをプロテイナーゼKで消化してから、架橋したmRNAを精製し、RNA品質をqRT-PCR（ステップ5および6）によって確認する。 RNase処理およびタンパク質濃度（ステップ7）の後、タンパク質の品質はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および銀染色（ステップ8）によって制御される。タンパク質バンドパターンの違いは、架橋サンプル（CL）と非架橋サンプル（非CL;非架橋サンプル）との間で容易に視覚化することができる。UV照射を受けていないプロトプラストからの陰性対照試料）。タンパク質の同定は、MSに基づくプロテオミクスによって達成される。可能性のあるバックグラウンド汚染を除去するために、1次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（1D-PAGE）によってCLサンプルからのタンパク質を分離し、トリプシンを用いて短いペプチドに「ゲル内消化」し、精製する（工程9）。質量分析（ナノLC-MS）に結合されたナノ逆相液体クロマトグラフィーは、mRNA結合プロテオームにおける決定的なタンパク質の量の決定を可能にする（工程10）。最後に、同定されたmRBPを特徴付け、バイオインフォマティクス分析を用いてカタログ化する（ステップ11）。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.8 M Mannitol</td><td>Sigma</td><td>M1902-500G</td><td>一次等張酵素溶液 & MMg solution</td></tr><tr><td>2 M KCl</td><td>MERCK</td><td>Art. 4935</td><td>一次等張酵素溶液 & W5 バッファー</td></tr><tr><td>0.2 M MES (pH 5.7) (4-モルホリンエタンスルホン酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M2933</td><td>一次等張酵素溶液, W5 バッファー & MMg溶液, ろ過滅菌</td></tr><tr><td>セルラーゼR10</td><td>ヤクルト製薬工業株式会社</td><td>セルラーゼ "オノヅカ」 R-10 最終</td><td>等張酵素液</td></tr><tr><td>10 g マセロザイム R10</td><td>ヤクルト製薬工業株式会社</td><td>マセロザイム R-10、10g</td><td>最終等張酵素溶液</td></tr><tr><td>10% (w/v) BSA (ウシ血清アルブミン)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906-100G</td><td>最終等張酵素溶液 & ろ過滅菌</td></tr><tr><td>1 M CaCl2</td><td>Chem-Lab NV</td><td>CL00.0317.1000</td><td>最終等張酵素溶液, W5 バッファー & 消化緩衝液</td></tr><tr><td>1 M NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/3160/60</td><td>W5 緩衝液</td></tr><tr><td>2 M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td>MMg 溶液</td></tr><tr><td>1 M LiCl (塩化リチウム)</td><td>Acros</td><td>199885000</td><td>Lysis/binding buffer, Wash buffer 1, Wash buffer 2 & 低塩緩衝液</td></tr><tr><td>5% (w/v) LiDS (硫酸ドデシルリチウム)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>L4632-25G</td><td>溶解/結合緩衝液, 洗浄緩衝液 1 & ろ過滅菌</td></tr><tr><td>1 M DTT (ジチオスレイトール)</td><td>Thermo Fisher Scientific Wash buffer 1 & 洗浄バッファー 2</td><td>307866</td><td>溶解/結合バッファー、</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td><td>Acros & フィッシャーケミカル</td><td>167620010 & H/1200/PB15</td><td>溶解/結合バッファー, 洗浄バッファー 1, 洗浄バッファー 2, 低塩バッファー & 溶出バッファー</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (エチレンジアミン四酢酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>ED-500G</td><td>溶解/結合バッファー, 洗浄バッファー 1, 洗浄バッファー 2, 低塩バッファー & 溶出緩衝液</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>MERCK</td><td>8.22184.0500</td><td>オリゴ-d(T)25ビーズの再生</td></tr><tr><td>0.1 M NaOH</td><td>VWR PROLABO CHEMICALS</td><td>28244.295</td><td>オリゴ-d(T)25ビーズの再生</td></tr><tr><td>1x PBS (pH 7.4) (リン酸緩衝生理食塩水) containing (NaCl;KCl;Na2HPO4;KH2PO4)</td><td>Fisher Chemical, MERCK, Sigma-aldrich &SAFC</td><td>S / 3160 / 60、 アート4935、 71640-250G& 60230</td><td>Regeneration of oligo-d(T)25 ビーズ</td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K 溶液 (2 &mu;g/&mu;L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11789020</td><td>タンパク質消化</td></tr><tr><td>ローディング色素</td><td>Invitrogen</td><td>LC5925</td><td>SDS-PAGE</td></tr><tr><td>qPCR マスターミックス</td><td>Promega</td><td>A6001</td><td>qRT-PCR assay</td></tr><tr><td>RNase カクテル</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM2286</td><td>RNA消化</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-aldrich</td><td>322415</td><td>ゲル固定およびゲル脱染色</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>537020</td><td>ゲル固定およびゲル脱染</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20278</td><td>ゲル染色</td></tr><tr><td>1 M NH4HCO3 (重炭酸アンモニウム) &nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>09830-500G</td><td>ジェルハイドレーション & 消化バッファー</td></tr><tr><td>CH3CN (アセトニトリル)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>34851-100ML</td><td>ゲル脱水 & ペプチド溶解液</td></tr><tr><td>IAA (ヨード酢酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>I4386-10G</td><td>アルキル化剤</td></tr><tr><td>TFA (トリフルオロ酢酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>302031-10X1ML</td><td>ペプチド溶解液</td></tr><tr><td>FA (ギ酸)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>06554-5G</td><td>ペプチド抽出</td></tr><tr><td>トリプシン溶液 (6 ng/&mu;L)</td><td>Promega</td><td>V5280</td><td>消化バッファー</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soil</td><td>Peltracom</td><td>LP2D</td><td>植物成長</td></tr><tr><td>バーミキュライト 3</td><td>SibliAS</td><td>05VERMICULIET</td><td>植物成長</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (150 x 20 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1184.500</td><td>プロトプラスト懸濁液用キャリア</td></tr><tr><td>0.22 &mu;mフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SE2M229104</td><td>最終的な等張酵素溶液の均質化</td></tr><tr><td>Razorblade</td><td>寒天培地</td><td>T585</td><td>ロゼットリーフストリップ</td></tr><tr><td>35-75 &mu;m ナイロンメッシュ</td><td>SEFAR NITEX</td><td>74010</td><td>プロトプラスト懸濁液ろ過</td></tr><tr><td>50 mL 丸底チューブ</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1918-10EA</td><td>プロトプラスト懸濁液用キャリア</td></tr><tr><td>血球計算盤 (B&uuml;</td><td>MARIENFELD</td><td>650030</td><td>プロトプラスト細胞計数</td></tr><tr><td>紫外線架橋装置 (HL-2000 HybriLinker)</td><td>UVP, LLC</td><td>UVP95003101</td><td>in vivo UV架橋</td></tr><tr><td>紫外線ランプ (三共電機 G8T5)</td><td>SANKYO 電</td><td>機SD G8T5</td><td>in vivo UV架橋</td></tr><tr><td>50mLガラスシリンジ</td><td>FORTUNA Optima</td><td>Z314560</td><td>Homogenization of protoplast lysate</td></tr><tr><td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td><td>Becton Dickinson microlance 3</td><td>2021-04</td><td>Homogenization of protoplast lysate</td></tr><tr><td>Rotator Model L26</td><td>Labinco BV</td><td>26110912</td><td></td></tr><tr><td>Oligo-d(T)25 magnetic beads (5 mg/mL)</td><td>New England BioLabs</td><td>S1419S</td><td>mRNPs and mRNRs binding andプルダウン</td></tr><tr><td>マグネティックラック</td><td>Invitrogen</td><td>CS15000</td><td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td></tr><tr><td>遠心フィルターユニット (Amicon Ultra-4 遠心フィルターユニット)</td><td>EMD ミリポア</td><td>UFC800308</td><td>mRBP 濃度</td></tr><tr><td>Pierce Silver Stain Kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>24612</td><td>銀染色アッセイ</td></tr><tr><td>RNA 精製キット (InviTrap Spin Plant RNAMini Kit)</td><td>STRATEC Molecular</td><td>1064100300</td><td>RNA 精製</td></tr><tr><td>分光光度計装置 (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-1000</td><td>RNA quality and quantity</td></tr><tr><td>Real-Time PCR cycler (StepOne Real-Time PCR cycler)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4376600</td><td>cDNA quantification</td></tr><tr><td>&micro;-C18 columns (Millipore Zip Tip &micro);-C18 カラム)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>720046-960EA</td><td>ペプチド精製</td></tr><tr><td>質量分析計 (Q Exactive Hybrid 四重極-Orbitrap 質量分析計)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>質量分析ベースのプロテオミクス</td></tr><tr><td>液体クロマトグラフィー装置 (Ultimate 3000 超高速液体クロマトグラフィー (UHPLC) 装置)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td>Mass spectrometry-based proteomics</td></tr><tr><td>C18 column (Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ES800</td><td>Mass spectrometry-based proteomics</td></tr><tr><td>C18 precolumn (Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>160321</td><td>Mass spectrometry-based proteomics</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Primers for qRT-PCR assay</td><td>Sequences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UBQ10 mRNA (Li et al., 2014)</td><td>Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18S rRNA (Durut et al., 2014)</td><td>Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

植物のプロトプラストからのmrnaインターアクチベント捕獲

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA結合タンパク質（RBP）はRNAの運命を決定する。それらはすべてのRNA生合成経路に関与し、特にメッセンジャーRNA（mRNA）の転写後遺伝子調節（PTGR）に寄与する。ここ数年、酵母および哺乳動物細胞株由来の多数のmRNA結合プロテオームが、mRNA結合タンパク質（mRBP）の同定を可能にする「mRNAインタラクトーム捕捉」と呼ばれる新規な方法の使用によって首尾よく単離された。生理学的環境から直接的に得ることができる。この方法は、オリゴ（dT）ビーズによるメッセンジャーリボ核タンパク質複合体（mRNP）のin vivo紫外線（UV）架橋、プルダウンおよび精製、およびその後の質量分析（MS）による架橋タンパク質の同定からなる。非常に最近、同じ方法を適用することによって、いくつかの植物のmRNA結合プロテオームが異なるシロイヌナズナ組織源から同時に報告されている：幼植物、葉組織、葉の葉肉プロトプラスト、および培養された根細胞を含む。ここでは、 シロイヌナズナ葉の葉の葉の葉のプロトプラストの最適化されたmRNAインタラクトムキャプチャー法を紹介します。このプロトプラストは、様々な細胞アッセイを含む実験の汎用ツールとして機能する細胞タイプです。最適タンパク質収量の条件は、出発組織の量およびUV照射の持続時間を含む。中規模実験（10 7細胞）から得られたmRNA結合プロテオームにおいて、RNA結合能を有することが示されたRBPが過剰発現され、多くの新規なRBPが同定された。実験はスケールアップ（10 9細胞）することができ、最適化された方法は、植物のmRNA結合プロテオームを広く単離し、カタログ化し、比較するために、他の植物細胞型および種に適用することができる。

我々は、洗浄緩衝液2（ 図1B ）を用いた洗浄工程4.3において、CL試料中のビーズペレットを囲む特徴的なハローを観察した。それは調査されていないが、この現象は、磁気捕獲中に架橋したmRNP複合体がビーズ凝集と干渉し、より拡散した凝集体を形成することによって、おそらく説明できる。これは、オリゴ-d（T） 25ビーズ捕捉が有効であることを示している14 。 非CLコントロールおよびCLサンプルの両方における18S rRNAよりも有意に高いUBQ10参照mRNAレベルを図1Cに示す。これは、poly（A）-tailed mRNAにのみ結合できるoligo-d（T） 25ビーズによる捕捉のために、溶出液にmRNAが濃縮されていること...

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

この最適化されたmRNAインタラクトームキャプチャーの全般的目的は、植物細胞からmRNA結合プロテオームを単離し、同定することです。本手法は、様々な細胞アッセイにおいて汎用的なツールとして用いられる細胞型であるシロイヌナズナ（arabidopsis thaliana）の葉肉細胞プロトプラストに適用されます。この手法は、植物のメッセンジャーRNA結合タンパク質の発見やその役割の解明など、転写後遺伝子調節の分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生理的環境から直接、結合プロテオーム上の植物メッセンジャーを単離および同定できることです。したがって、この方法は Arabidopsis の葉肉細胞プロトプラストから、メッセンジャーRNA結合タンパク質に関する知見を提供することができます。また、他の植物のプロトプラストや組織など、他の系にも適用可能です。この手法のアイデアは、酵母および哺乳類細胞株への適用が成功していることに気づいたときに得られました。テキストプロトコルに従い、2つの異なるサンプルについてシロイヌナズナの葉肉細胞プロトプラストを単離します。UV架橋を行わないコントロールサンプル（非架橋サンプル）は氷上で保持してください。架橋を行うプロトプラスト懸濁液（CLサンプル）を大きなペトリ皿に移します。皿に氷冷したMMG溶液を30 milliliters加え、表面を覆い、緩やかなピペッティングで細胞を分散させます。UV架橋装置へ運ぶ際は、ペトリ皿をアルミホイルで覆ってください。開いたペトリ皿を直ちにUVクロスリンク装置に設置します。皿とUVランプの距離が8 cmであることを確認し、サンプルに1分間照射します。その後、ペトリ皿からプロトプラスト懸濁液を速やかに2本の新しい50 mLラウンドボトムチューブに分注します。ディッシュの底部を氷冷したMMG溶液5 mLでさらに洗浄し、残りのプロトプラストを回収します。懸濁液を2本のチューブに等分します。次に、non-CLおよび2本のCLサンプルチューブを、4 °C、100 ×gで5分間遠心分離します。上清を廃棄した後、non-CLペレットが入ったチューブを再び氷上に置きます。各CLサンプルチューブに氷冷したMMG溶液を10 milliliters加え、チューブを静かに振ってペレットを再懸濁させます。2つのサンプルを1つの50 milliliterラウンドボトムチューブに合わせた後、4 degrees celsiusで100 times gにて5分間遠心分離します。上清を捨てた後、ペレットを氷上に保持します。次に、各サンプルの細胞ペレットに、氷冷した溶解結合バッファーを9 mL加えます。ピペッティングで約20回吸い上げと吐き出しを繰り返し、溶液が均一な薄緑色になるまでプロトプラストを溶解させます。均質化のため、プロトプラスト溶解液を細い針の付いた50 milliliterガラスシリンジに2回通し、その後、溶解液を氷上で10分間インキュベートします。サンプルを液体窒素で凍結させ、-80 °Cで最大3週間保存します。凍結したプロトプラスト溶解液の入ったチューブを室温で融解させた後、チューブを氷上に保持します。氷上に置いた6本の新しい2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに、oligo-d(T)磁気ビーズを1.8 mLずつ分注します。各チューブのビーズ懸濁液を600 µLの溶解結合バッファーで洗浄するため、ピペッティングで軽く混ぜ合わせ、ローテーターを用いてビーズを2分間緩やかに回転させます。ビーズは氷上に保持してください。次に、ビーズを含む6本のチューブすべてをマグネットラックに置き、完全に磁気回収されるまで少なくとも3分間待ちます。ビーズが完全に回収されると、懸濁液は透明になります。その後、6本すべてのチューブから上清を捨て、直ちにプロトプラスト溶解液 9 mLを分注します。ピペッティングにより、懸濁液が褐色で均一になるまでビーズとライセートを混合します。チューブを4 °Cで1時間、緩やかに回転させながらインキュベートします。インキュベーション後、チューブを再びマグネットラックに3分間置きます。すべてのビーズがチューブの側面に回収されたら、プロトプラスト溶解液を含む上清を6本の新しい2 mLラウンドボトムマイクロ遠心チューブに回収します。次に、ビーズが入った各チューブに氷冷した1.5 mLの洗浄バッファー1を加え、ピペッティングによりビーズを再懸濁させます。1分間緩やかに回転させた後、チューブを再びマグネットラックに3分間置きます。上清を捨て、この洗浄ステップをもう一度繰り返します。氷冷した洗浄バッファー2を1.5 milliliters使用し、同様の洗浄手順を2回繰り返します。プロトプラスト溶解液からmRNPが効率的に単離されていれば、CLサンプルのビーズペレットの周囲にハローが観察されるはずです。最後に、氷冷した低塩バッファー1.5 millilitersで洗浄手順をもう一度繰り返します。洗浄後、各チューブに溶出バッファー500 microlitersを加え、ピペッティングによってビーズを穏やかに再懸濁させます。50 degrees celsiusで3分間インキュベートし、poly-A tailed RNAを溶出させます。ピペッティングを1回行い、ビーズを穏やかに再懸濁させ、チューブを磁気ラックに戻して4 °Cで5分間静置します。全6本のチューブから溶出液を回収し、氷上に置いた15 mLコニカルチューブにまとめます。これにより、約3 mmの溶出液が得られます。RNAの質と量は、分光光度計を用いて直ちに測定できます。再利用するoligo-d(T)ビーズは、氷冷した溶出バッファー1 mLで2回洗浄して準備します。その後、氷冷したライシス結合バッファー1 mLで洗浄し、塩濃度を500 mMに戻します。洗浄済みのoligo-d(T)ビーズを用いて、結合、洗浄、および溶出の手順をさらに2ラウンド繰り返します。これにより、プロトプラスト溶解液からpoly-Aテールを持つRNAが除去され、各サンプルにつき合計9 mLの溶出液が得られます。ビーズは保存し、最大3回まで別の実験に使用することが可能です。RNAの品質を試験するため、テキストプロトコルに従って、UV架橋されたタンパク質をプロテイナーゼK溶液で消化します。次に、RNA精製キットを用いてRNAを精製し、残留した不純物を除去します。精製後、サンプルはqRT-PCRを用いたRNA品質試験に使用可能な状態になります。まず、各サンプルの 8 mL に、RNAse A および RNAse T1 を含む 100 units の RNAse カクテルを加えて処理します。短時間ボルテックスした後、サンプルを 37 °C で 1 時間インキュベートします。mRNA 結合タンパク質（mRBP）を濃縮するため、遠心ろ過ユニットを用いてサンプルをろ過します。これにより、各サンプルから 2 µg のタンパク質を含む 75 µL が得られます。長期保存する場合は、サンプルを-80°Cで冷凍してください。SDS-PAGEを実施するには、各濃縮サンプル25 µLに2Xローディングダイ15 µLを混合し、サンプルを95°Cで5分間加熱します。5%のスタッキングゲルと12%のセパレーションゲルを用いたSDS-PAGEゲルに、サンプルとタンパク質マーカーをロードしてください。次に、超純水を用いてゲルを2回洗浄します（1回につき5分間）。市販の銀染色キットを用いてゲルを染色します。十分な数の開始プロトプラストを使用していれば、5分以内にタンパク質のバンドが現れます。mRBPをさらに検証するため、テキストプロトコルに従って2枚目の1Dページゲルからペプチドを精製します。これらの精製されたペプチドは、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、質量分析、および定性的・定量的プロテオミクスによって解析することが可能です。oligo-d(T)ビーズによるキャプチャ後、qRT-PCRにより、18S rRNAと比較してpoly ubiquitin 10リファレンスmRNAのレベルが有意に高いことが示されました。oligo-d(T)ビーズはpoly-Aテールを持つRNAにのみ結合するため、溶出液にはmRNAが濃縮されていることが示唆されます。oligo-d(T)ビーズによるmRBPのキャプチャは、銀染色SDS-PAGEゲルを用いてさらに評価します。ゲルでは、非架橋のnon-CLサンプルと比較して、UV架橋したCLサンプルにおいてタンパク質量が有意に高いことが示されています。UV照射時間は架橋効率に影響を与える可能性があります。この銀染色SDS-PAGEゲルにより、1分または3分のUV照射が最も強いバンド強度を示し、最適条件であることが確認されました。定量プロテオミクス解析により、合計325個のタンパク質が同定されました。これらのタンパク質のうち225種類は、各タンパク質に存在するペプチドの量が少なく、ペプチド強度の変動が大きかったため、有意水準を下回っていました。しかし、これらすべてが定性的にCLサンプルのみで検出されたため、すべて陽性結果とみなしました。これら325種類のタンパク質は、さらにリボソームタンパク質、主要なRBP、および候補RBPの3つのカテゴリーに分類されました。候補となるRBPは従来のRNA結合ドメインを欠いており、その役割のほとんどが検証されていないため、RNA調節における新たな機能を持つ可能性が示唆されています。この手法を習得すれば、適切に実施することで1週間で完了させることができます。本手法の開発後、植物の分子調節経路分野の研究者は、双子葉植物および単子葉植物の細胞や組織におけるゲノムワイドなメッセンジャーRNA結合プロテオームの探索が可能となりました。

mrna-interactome-capture-from-plant-protoplasts

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

タンパク質のメンブレンオーバーレイアッセイ：可溶性および不溶性タンパク質間の相互作用をテストするためのプロトコル in vitroで</em

我々は、植物におけるタンパク質間相互作用をテストする手法を開発した。黄色蛍光タンパク質（YFP）がつの非オーバーラップフラグメントに分割されます。各断片は融合タンパク質の発現を可能にする、ゲートウェイのシステムを経由して目的の遺伝子にインフレームでクローニングされる。検死のタンパク質が相互作用するときにYFPシグナルの再構成にのみ発生します。...

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

ここでは植物性タンパク質複合体の精製および特性評価のためのプロトコルを記述します。私たちは、複雑な内部に単一のタンパク質を免疫沈降によって、私たちはその翻訳後修飾とその相互作用パートナーを識別できることを実証している。...

植物タンパク質複合体の翻訳後修飾の同定

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

タンパク質とタンパク質代謝の相互作用は携帯電話のすべての機能のために重要です。ここで、選択の蛋白質のこれらの相互作用の平行分析を可能にするプロトコルについて述べる。私達のプロトコルは、植物細胞培養用に最適化されたし、質量分析を用いたタンパク質と代謝物の検出と親和性の浄化を結合します。...

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ここで説明する近接標識法は、ニコチアナベンタミアナ葉組織におけるNLR免疫受容体のTIRドメインの相互作用パートナーの同定のための方法である。また、ニコティアナおよび他の植物種におけるこの技術を用いて、関心のある他のタンパク質間の相互作用を同定するための詳細なプロトコルも提供される。...

タンパク質相互作用ネットワークのインプランタ同定のためのTurboIDベースの近接標識

リボソームアフィニティー精製(TRAP)を翻訳すると、臓器や組織の最小限の処理で開発プログラムを解剖する可能性があります。このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質(GFP)標識リボソームサブユニットを標的とした細胞から高品質のRNAを生成します。qRT-PCR や RNA-seq...

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

ハイスループットscRNA-seqメソッドの実現可能性と有効性は、植物研究におけるシングルセル時代の到来を告げるものです。ここでは、シ ロイヌナズ ナの根の特定の細胞タイプを単離し、その後のトランスクリプトームライブラリの構築と解析を行うための堅牢で完全な手順を紹介します。...

植物細胞タイプの単離とトランスクリプトーム解析

学ぶ、mRNAインターアクチベント捕獲法を用いてArabidopsis thalianaの葉肉プロトプラストからmRNA結合タンパク質を分離・同定する手法。この方法は植物の転写後制御機構の理解に貢献します。

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

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