補体受容体1長多型のための高分解能Melting PCR Genotyping：アルツハイマー病の遺伝子感受性評価のための革新的なツール

この方法の全体的な目標は、アルツハイマー病などの疾患に対する感受性の評価に使用するための受容体1長多型の補体を遺伝子型決定し、疾患の病因におけるCR1アイソフォームの役割をよりよく理解することです。この方法は、アルツハイマー病の病因など、神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、新鮮な血液サンプルを必要とせず、より簡単で、より安く、より速く、したがってより大きな集団に適用できることです。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、新鮮な血液サンプルの必要な時間と必要性に関して、ウェスタンブロットを実施する際の課題を認識したときでした。20マイクロリットルのプロテイナーゼKを1.5ミリリットルのチューブの底にピペットで入れます。次に、200マイクロリットルのサンプルをチューブに加えます。

200マイクロリットルの溶解バッファーをサンプルに加えます。パルスボルテックスで15秒間混合します。混合後、56°Cで水浴中で10分間インキュベー

1.5ミリリットルのチューブを短時間遠心分離して、蓋の内側から滴を取り除きます。次に、100マイクロリットルのエタノールをサンプルに加えます。パルスボルテックスで15秒間再度混合してから、前と同じようにチューブを短時間遠心分離します。

次に、混合物を2ミリリットルの収集チューブ内のメンブレンカラムに慎重に塗布します。縁を濡らさずに、キャップを閉じ、Gの6,000倍で1分間遠心分離します。メンブレンカラムを清潔な2ミリリットルの収集チューブに入れ、ろ液の入ったチューブを廃棄します。

メンブレンカラムを慎重に開き、縁を濡らさずに500マイクロリットルの洗浄バッファー1を追加します。キャップを閉じ、6, 000倍Gで1分間遠心分離します。次に、メンブレンカラムを清潔な2ミリリットルの収集チューブに入れ、ろ液の入ったチューブを廃棄します。

メンブレンカラムを慎重に開いた後、縁を濡らさずに500マイクロリットルの洗浄バッファー2を追加します。キャップを閉め、Gの20, 000倍で3分間遠心分離します。次に、メンブレンカラムを新しい2ミリリットルの収集チューブに入れ、再度遠心分離します。

遠心分離後、メンブレンカラムを清潔な1.5ミリリットルチューブに入れ、ろ液を含む収集チューブを廃棄します。メンブレンカラムを慎重に開き、200マイクロリットルの蒸留水を加えます。カラムを室温で5分間インキュベートしてから、Gの6,000倍で1分間遠心分離します。

HRM-PCRプロトコルを実行するには、まず、1.5ミリリットルチューブ内のDNAサンプルを水で1マイクロリットルあたり10ナノグラムの濃度に希釈します。次に、解凍したプライマー溶液を1.5ミリリットルのチューブに入れた水で同濃度の6マイクロモルに希釈します。HRM-PCRキット溶液を解凍し、ボルテックスで慎重に混合して、すべての内容物が確実に回収されるようにします。

DNA結合色素、塩化マグネシウム、水を含む酵素混合物を含む3つのバイアルを微量遠心分離機で簡単に回転させてから、開きます。室温で1.5ミリリットルのチューブで、テキストプロトコルに記載されているように、成分を使用して120マイクロリットルの反応用のPCRミックスを調製します。ボルテックスで慎重に混ぜます。

分子生物学の優れた実践に従って、注意を払い、応用して作業することが重要です。19マイクロリットルのPCRミックスを白いマルチウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。濃度調整されたDNAテンプレートを1マイクロリットル加え、次に白いマルチウェルプレートをシーリングホイルで密封します。

白色マルチウェルプレートを1,500倍Gで1分間遠心分離し、適切なアダプターを備えたマルチウェルプレート用のローターを含む標準的なスイングバケット遠心分離機で遠心分離します。白色のマルチウェルプレートをHRM-PCR装置にロードします。テキストプロトコルに記載されているPCR条件でHRM-PCRプログラムを開始します。

HRM-PCR反応に続いて、HRM解析を行い、テキストプロトコルに記載されているCR1長多型を決定します。融合曲線は、異なるCR1アイソフォームを持つ被験者のゲノムDNAからPCR由来アンプリコンを高分解能で融解した後、ソフトウェアを使用して分析しました。結果は、被験者を同種CR1発現表現型に従って識別する曲線です。

2つの表示モード、正規化およびシフト融解曲線、および正規化および温度シフト差プロットで示されるように、曲線プロファイルは、CR1スター3、CR1スター1グループ、CR1スター1グループ、CR1スター2グループ、CR1スター1グループ、CR1スター1グループ、CR1スター2グループ、CR1スター2、 CR1スター4グループ。これらの曲線は、CR1 長多型対立遺伝子に対応します。このビデオを見れば、HRM-PCRによって得られた完全な曲線に従ってCR1長多型を簡単にジェノタイピングする方法を十分に理解できるはずです。

一般に、この方法に不慣れな個人は、すでに知られているCR1長遺伝子型の参照サンプルが必要なため、苦労します。このテクニックをマスターすると、適切に実行すれば4時間で完了します。この手順を試行する際には、各DNAサンプルに同じ濃度を使用することを忘れないでください。

この手順に続いて、コニカルDNAシーケンシングなどの他の方法を実行して、新しい既知のプライベートSNPの発見などの追加の質問に答えることができます。この開発後、この技術は、集団遺伝学の分野における研究がCR1長多型における病原体の選択圧を調査するための道を開きます。この方法は、アルツハイマー病の病因における感受性についての洞察を提供することができますが、全身性エリテマトーデスやマラリアなどの他の疾患の研究にも適用できます。