クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

この実験手順の全体的な目的は、クロマチン免疫沈降（ChIP）解析に使用可能な、架橋された骨格筋からの高品質な核を調製することです。この手法は、概日リズムやその他の時間感受性のある文脈における筋肉組織および細胞を用いたゲノム研究など、筋肉および概日リズム分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、サンプルの即時架橋が可能であること、およびろ過に基づく手順によって、筋原線維の混入を最小限に抑えつつ、高品質な核を確実に単離できることです。

この手法は骨格筋に関する知見を得るために有用ですが、心筋や平滑筋などの他の系にも適用可能です。既報の手法に従い、約20週齢のC57 black six雄マウスから分離した後肢骨格筋を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で重量測定し、細切します。細切した骨格筋組織を、10 mLのPBSが入った50 mLコニカルチューブに入れ、氷上で保持します。

次に、サンプルを4°Cで300 ×g、5分間遠心分離します。吸引によりPBS上清を慎重に取り除きます。1、2、3、および4 mLの水を入れたリファレンスチューブを用いて、各50 mLチューブ内のペレットの体積を推定します。

氷冷した1% formaldehydeおよびPBSを7容量分加え、プローブ式組織ホモジナイザーを用いて氷上でサンプルをホモジナイズします。次に、室温で10分間インキュベートし、サンプルの架橋を行います。その後、1 molar glycineを最終濃度0.125 molarになるように添加し、室温で5分間インキュベートして架橋反応を停止させます。

サンプルを4°Cで3,000 ×gで5分間遠心分離した後、上清を吸引して取り除きます。新たにプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷ベースバッファー10 mLに再懸濁して、ペレットを洗浄します。サンプルを再度遠心分離し、上清を注意深く吸引して取り除きます。

次に、新しく添加したプロテアーゼ阻害剤を含むライシスバッファー6 mLでペレットを再懸濁します。サンプルをあらかじめ冷却した15 mLのDounceホモジナイザーに移し、氷上で10分間インキュベートします。核を遊離させるため、ルーズペッスルを用いてゆっくりと15回、続いてタイトペッスルを用いて15回、各サンプルを氷上でDounceホモジナイズします。

高品質な核を単離するための鍵となるのが、以下のろ過工程です。ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、4 mLの溶解バッファーで洗浄します。その後、サンプルを4 °Cで1,000 ×g、10分間遠心分離します。

ペレットを5 mLの氷冷ベースバッファーに再懸濁し、タイトペッスルを用いて10回ダウンス均質化し、核を放出させます。次に、懸濁液をセルストレーナーでろ過し、チューブを2 mLのベースバッファーで洗浄して、再度ろ過します。孔径を段階的に小さくしたセルストレーナーを用いて、ろ過を繰り返します。

最後に、4°Cで1,000 ×gにて10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを500 µLのベースバッファーで再懸濁させた後、再度遠心分離を行います。上清を廃棄し、ペレットを-80°Cで保存します。

サンプルを500 µLのSDS溶解バッファーで融解し、緩やかにピペッティングして再懸濁させます。核DNA懸濁液を氷上のガラスバイアルに移します。単離した核からクロマチンを調製する場合、適切な超音波処理プラットフォームと条件を選択することが極めて重要です。

テキストプロトコルに記載された設定を用い、ディスク型トランスデューサーから集束させた超音波エネルギーを照射してソニケーションを行います。ソニケーション後のクロマチンを1.5 milliliterチューブに移します。その後、12,000 ×gで15分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。

次に、超音波処理したサンプルを50 µL取り、新しい1.5 mLチューブに移し、65 °Cで一晩逆架橋を行います。DNAサンプルの回収については次節に記載します。テキストプロトコルに記載されている超音波処理の評価と定量を行った後、融解したクロマチンを1本あたり約100〜120 µgずつ分注します。

次に、クロマチンを免疫沈降バッファーで10倍に希釈します。続いて、BSAでプレブロックしたprotein HE agaroseまたはIgYビーズの50%スラリーを40 µL加え、ローテーターを用いて4°Cで3時間インキュベートします。サンプルを1,000 ×gで10分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに注意深く移します。

次に、クロマチンDNA 25〜100 µgあたり1 µgの抗体を添加します。4 °C、約15 rpmで一晩緩やかに回転混和します。その後、BSAでプレブロックしたProtein HEアガロースまたはIgYビーズを10 µL添加し、混合します。

ビーズ懸濁液をコールドルームで2時間回転混和させます。次に、テキストプロトコルに詳述されている通り、RIPAバッファー、高塩濃度バッファー、塩化リチウムバッファー、およびTris EDTAの順でビーズを洗浄します。洗浄後、1,000 ×gで1分間遠心分離し、上清を慎重に除去することで、ビーズからDNAを溶出させます。

ビーズを50 µLの溶出バッファーで再懸濁します。その後、65 °Cで10分間インキュベートします。インキュベーション後、12,000 ×gで5分間遠心分離します。

上清を除去し、さらに50 µLの溶出バッファーを加えて、12,000 ×gで5分間、再度遠心分離します。最終的な溶出量は100 µLになります。架橋を解除してDNAを溶出させるには、まず溶出したクロマチンを65 °Cで一晩インキュベートします。

次にRNase Aを1 µL加え、37 °Cで30分間インキュベートします。続いて、10 mg/mLのプロテアーゼKを8 µL加え、55 °Cで30分間インキュベートします。製造元のプロトコルに従い、溶出液量を50 µLとしたPCR精製キットを用いてDNAを回収します。

最後に、既報の方法に従い、リアルタイムQPCRでプロファイルを解析します。連続ろ過により、組織残渣が効果的に除去されました。比較のため、初回ろ過後および連続ろ過後のサンプルの代表的な画像をここに示します。

10サイクルの超音波処理によるクロマチンの段階的な断片化が、アガロースゲル電気泳動によって示されています。消化済みクロマチンを10サイクル超音波処理した結果、DNAは約500 bpとなりました。ここでは、ZT6およびZT18に採取したマウス骨格筋サンプルのBオス1例における代表的なqPCR結果を示します。

Dbp遺伝子上のDbp結合部位の解析により、以前の結果と一致してZT6付近に結合ピークがあることが明らかになりました。習熟すれば、適切に実施することで核の調製は5〜6時間で完了します。このビデオを視聴することで、ろ過ベースの手法を用いて、架橋された筋肉組織から高品質な核およびクロマチンDNAを精製する方法について十分に理解できるはずです。

この手順を実施する際は、サンプルを氷上または低温室で保持すること、およびろ過工程の前後で顕微鏡による確認を行うためにサンプル分注分を保存しておくことが重要です。本手法の開発により、筋肉およびゲノミクスの分野の研究者は、さまざまな筋肉組織におけるクロマチンとタンパク質の相互作用の概日リズムや時間依存的なダイナミクスを探索することが可能になりました。本手順に続き、筋肉組織における転写因子の結合パターンを調べるなど、さらなる問いに答えるためにchIP sequencingなどの他の手法を実施することができます。