Name: クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 学ぶ ろ過ベースの核分離法により、架橋したマウス骨格筋から高品質な核を調製する方法です。クロマチン免疫沈降研究に適用でき、ミオフィブリル汚染を最小限に抑えます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちはKaryn Esser、Koike Nobuya、Park Noheon Parkに助けになることに感謝します。この研究は、NIH / NIGMS（R01GM114424）がS.-HYに、またRobert A. Welch Foundation（AU-1731）とNIH / NIA（R01AG045828）がZC

動物のケアは、施設の動物のケアおよび使用委員会（IACUC）ガイドラインの下で実施され、手順はヒューストンのテキサス大学健康科学センターによって承認された動物のプロトコルに従って行われた。 1.架橋骨格筋からの核の単離<ol><li>前に詳述したように、氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中、約20週齢のC57BL / 6雄マウスから単離した後肢骨格筋を秤量して切り刻む。 注：我々は通常、1つのマウスから1.0〜1.5 gの骨格筋を得る。 <ol><li>氷上で10mLのPBSを含む50mLコニカルチューブに細かい骨格筋組織を置く。 </li></ol></li><li> 4℃で300xgで5分間遠心分離する。 </li><li>慎重に吸引によりPBS上清を除去する。 </li><li> 1、2、3、および4 mLの水を含む参照チューブを使用して、各50 mLチューブのペレット容量を見積もります。 </li><li> 7巻追加PBS中の氷冷した1％ホルムアルデヒドで洗浄し、プローブ組織ホモジナイザー（ 表を参照）を用いて氷上でサンプルをホモジナイズする。 注：オプション：ホモジナイゼーション手順は、低温室で行うことができます。 </li><li>室温で10分間インキュベートすることによって試料を架橋させる。 </li><li> 1Mグリシンを添加して架橋反応を停止させ、0.125Mの最終濃度とし、室温で5分間インキュベートする。 </li><li>サンプルを3,000 xgで5分間4℃で遠心分離する。吸引により上清を除去する。 </li><li>新たに加えたプロテアーゼインヒビター（0.2mMのフェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF））を含有する10mLの氷冷塩基緩衝液（pH7.3,10mM EDTA、10mM KCl、5mM MgCl 2、0.5mM DTTの10mM HEPES-KOH） 、及び10μg/ mLのロイペプチン）を含む。 3,000 gで5分間4℃で遠心分離し、上清を慎重に吸引除去する。 </li><li>ペレットを6mLの溶解緩衝液（10mM HEPES-KOH、p（0.2mMのPMSF、および10μg/ mLのロイペプチン）を含有する10mMのHEPES緩衝液（pH7.5,10mM EDTA、10mM KCl、5mM MgCl 2、0.5mM DTT、1％Triton X- </li><li>試料を予め冷却した15mL Dounceホモジナイザーに移し、氷上で10分間インキュベートする。ゆるやかな乳棒を用いて15回のゆっくりとしたストロークで各試料を氷上でホモジナイズし、密栓した15ストロークで核を放出させる。 </li><li>ホモジネート（6mL）を細胞ストレーナー（孔径：100μm）で濾過し、4mLの溶解緩衝液ですすぐ。 4℃で1,000 xgで10分間遠心します。 5mLの氷冷した塩基緩衝液に再懸濁し、密な乳棒で10回叩いて核を放出させる。 <ol><li>分光光度計（OD260 / OD280）でDNA濃度を測定するために20μLのアリコートを取り出し、必要に応じてトリパンブルーで顕微鏡で観察します（下図参照）（ 図 1A ）。 </li></ol></li><li>サスペンションをフィルタリングする細胞ストレーナ（細孔サイズ：70μm）を用いて、チューブをすすぎ、上記のように2mLの塩基緩衝液で再度濾過する。 </li><li>徐々に細孔サイズ（40μm、30μm、20μmおよび10μm）が減少した細胞ストレーナーで、ステップ1.13と同様にろ過を繰り返します。 注：合計で、6つの孔サイズのストレーナーがステップ1.12-1.14で使用された。 </li><li> 4℃、1,000gで10分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを500μLの塩基緩衝液に再懸濁する。 </li><li>上記のようにDNA濃度を測定する。 注：約200μgの核酸DNAが1匹の動物からの両方の後肢を組み合わせて得られた。必要に応じて、トリパンブルー染色（ストック濃度0.4％、1：5希釈）による顕微鏡観察のために20μLを保存する。核が青く染色される（ 図 1B ）。 </li><li> 4℃、1000gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。ペレットを-80℃で保存する。 </li></ol> 2.超音波 &lt;ol&gt; <li>サンプルを500μLのSDS溶解バッファーで解凍し、穏やかなピペッティングで再懸濁します。 </li><li>核のDNA懸濁液を氷上のガラスバイアルに移す。 </li><li>皿状のトランスデューサからの超音波音響エネルギーの集中したバーストで超音波処理を実行します。装置の詳細については、 表を参照してください。次の設定を使用します。強度：5;デューティサイクル：20;温度4〜6℃; 30秒オン/オフ。 注：音波処理の有効性を評価するための例を図2に示します 。 </li><li>超音波処理したクロマチンを1.5mLチューブに移す。 12,000 xgで15分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移す。 65℃で一晩逆架橋させるために、超音波処理されたサンプル（〜7-10μg/筋肉サンプル）50μLを新しい1.5mLチューブに移す。残りのサンプルを-80℃で凍結させる。 </li></ol> 3.超音波と定量の評価<ol><li> 1.0を追加保存した50μLの超音波処理されたサンプルに、RNase A（500U / mL RNase A：20,000U / mL RNase T1）を加え、37℃で30分間インキュベートする。 </li><li> 8μLのプロテアーゼK（10mg / mL）を添加し、55℃で30分間インキュベートする。 </li><li> DNA抽出キットを使用してDNAを収穫する。 <ol><li> 5倍量の結合緩衝液を添加し、スピンカラムにかけ、4,000xg、10分間遠心する。 </li><li>パススルーを同じカラムにかけ、再度遠心します。 </li><li>洗浄バッファーで13,000 xg、1分間で2回洗浄する。 </li><li>カラムを乾燥させるために13,000 xgで1分間遠心分離します。 </li><li> 50μLのH 2 Oを加え、13,000×g、1分間遠心分離してDNAを溶出する。 </li><li>パススルーを同じカラムにかけ、再度遠心します。 </li></ol></li><li>分光光度計（OD260 / OD280）でDNAの量を定量する。 0.8％ゲルでサンプルを実行して超音波処理された製品のサイズおよび量（1μg）を評価する（ 図2 ）。 注：平均クロマチン収率は約20％です。 </li></ol> 4.チップ<ol><li>以前保存したクロマチンを-80°Cで解凍し、クロマチンをチューブあたり約100〜120μgに等分します。放射免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM NaF、1mM Na 3 VO 4、1mM PMSF、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル（PIC）、0.1％ w / v）、1％トリトン（Triton）X-100）。 <ol><li>各グループに複数のサンプルがある場合は、同量のクロマチンDNAを最終量約100〜120μg/サンプルに合わせます。入力として10％を保存します。 </li></ol></li><li> BSAプレブロック（〜2時間、4℃）プロテインA / Gアガロース（非鶏抗体）またはIgYビーズ（鶏抗体）の40μL（RIPAバッファー中50％v / vスラリー）を添加し、 4℃で3時間回転させた。 </li><li> 1,000 xgで10分間遠心分離し、上清を注意深く新しいチューブに移す。 </li><li>抗体を1μg/25〜100μgのクロマチンDNA。 </li><li>約15 rpmで一晩4℃で静かに回転させます。 </li><li> 10μLのBSAプレブロック（〜2時間、4℃）プロテインA / Gアガロース（非鶏抗体）またはIgYビーズ（鶏抗体）を加え、冷室で2時間回転させます。 </li><li>ビーズを以下のように洗浄する。 RIPA緩衝液1mLで3分間2回洗浄し、1mLの高塩緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、500mM NaCl、2mM EDTA、1mM PMSF、1％Triton X-100）で3分間2回洗浄する。 1mLのLiCl緩衝液（20mM Tris-HCl（pH7.4）、250mM LiCl、2mM EDTA、1mM PMSF、1％Na-デオキシコール酸塩、0.5％NP40）で3分間2回洗浄する。 <ol><li> 1mLのTris-EDTA（TE）緩衝液（10mM Tris-HCl（pH7.4）、1mM EDTA）で3分間1回洗浄する。次いで、溶出緩衝液（20mM Tris-HCl、5mM EDTAおよび0.5％SDS）でDNAを溶出する。 </li></ol></li><li> 1,000gで1分間遠心分離し、上清を慎重に除去する。 </li><li>溶出バッファー50μLでビーズを再懸濁する。 </li><li> 10日間インキュベートする分で65℃で保存した。 </li><li> 12,000 gで5分間遠心分離する。 </li><li>上清を新しいチューブに移し、さらに50μLを加え、12,000gで5分間遠心分離する。最終溶出量は100μLになります。 </li><li>逆架橋およびDNA溶出。 <ol><li>溶出したクロマチンを一晩65℃でインキュベートする。 </li><li> 1.0μLのRNase Aを添加し、37℃で30分間インキュベートする。 </li><li> 8μLのプロテアーゼK（10mg / mL）を添加し、55℃で30分間インキュベートする。 </li><li>製造者のプロトコールに従って、50μLの溶出容量を有するPCRクリーンアップキットを用いてDNAを収穫する。 </li></ol></li><li>先に説明したようにリアルタイムqPCRによるプロファイルを分析する（ 25,26） 。 注：プライマー配列は図3の 凡例にリストされています 。データは、平均±SEMとして示す （ 図3 ）。 </li></ol>

<ol><li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1%2FAkt2+and+IRS-2%2FAkt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li>
<li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meter+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li>
<li>Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+circadian+signaling+networks+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets.</a> Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).</li>
<li>Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms%2C+the+molecular+clock%2C+and+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle.</a> J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).</li>
<li>Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+the+circadian+and+sleep+cycles+to+protect+against+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35(2015).</li>
<li>Harfmann, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+loss+of+Bmal1+leads+to+disrupted+tissue+glucose+metabolism+and+systemic+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis.</a> Skelet Muscle. 6, 12(2016).</li>
<li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscles%2C+exercise+and+obesity%3A+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li>
<li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking%3A+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li>
<li>Jackson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+histone+organization+in+the+nucleosome+using+formaldehyde+as+a+reversible+cross-linking+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent.</a> Cell. 15 (3), 945-954 (1978).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Takahashi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+RNA-seq+methods+to+study+circadian+control+of+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals.</a> Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).</li>
<li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein%3ADNA+associations+in+a+chromatin+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li>
<li>Chen, Z., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+promoter+elements+and+TAFs+contribute+to+the+diversity+of+transcriptional+activation+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates.</a> Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).</li>
<li>Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+PER+repression+mechanisms+in+the+Drosophila+circadian+clock%3A+from+on-DNA+to+off-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA.</a> Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).</li>
<li>Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+regulates+Period2+expression+and+the+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">p53 regulates Period2 expression and the circadian clock.</a> Nat Commun. 4, 2444(2013).</li>
<li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+and+beyond%3A+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li>
<li>Koike, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+and+chromatin+landscape+of+the+core+circadian+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.</a> Science. 338 (6105), 349-354 (2012).</li>
<li>Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPping+away+at+the+Drosophila+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">ChIPping away at the Drosophila clock.</a> Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).</li>
<li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. , (2016).</li>
<li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).</li>
<li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+skeletal+muscle+satellite+cells+and+myofibers+for+use+in+chromatin+immunoprecipitation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays.</a> Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).</li>
<li>Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nuclei+and+preparation+of+nuclear+envelopes+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle.</a> Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).</li>
<li>Hahn, C. G., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+transcriptionally+active+nuclei+from+striated+muscle+using+Percoll+density+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients.</a> Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).</li>
<li>Jeong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+attenuation+of+proteasomal+and+autophagic+BMAL1+degradation+in+Clock+Delta19%2F%2B+mice+contributes+to+improved+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis.</a> Scientific reports. 5, 12801(2015).</li>
<li>Nohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ammonia-lowering+activities+and+carbamoyl+phosphate+synthetase+1+%28Cps1%29+induction+mechanism+of+a+natural+flavonoid%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+metabolism%22%5BJournal%5D)">Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid.</a> Nutrition & metabolism. 12, 23(2015).</li>
<li>Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+integrates+the+transcriptional+response+of+the+hepatocyte+to+fasting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting.</a> Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).</li>
<li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li>
<li>Kondratov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMAL1-dependent+circadian+oscillation+of+nuclear+CLOCK%3A+posttranslational+events+induced+by+dimerization+of+transcriptional+activators+of+the+mammalian+clock+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system.</a> Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).</li>
<li>Ripperger, J. A., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhythmic+CLOCK-BMAL1+binding+to+multiple+E-box+motifs+drives+circadian+Dbp+transcription+and+chromatin+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions.</a> Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).</li>
<li>Laplante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEPTOR+cell-autonomously+promotes+adipogenesis%2C+and+its+expression+is+associated+with+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity.</a> Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).</li>
<li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ここでは、架橋された骨格筋組織を用いて高品質の核を単離する堅牢な方法について説明します。塵から核を効果的に分離するために逐次濾過を行い、皿状トランスデューサからの超音波エネルギーがChIP分析のためにクロマチンを剪断した。この結果は、標的プロモーターにBMAL1の概日特異的結合を示した。 ChIPは、架橋が起こるときにゲノムDNA上のリアルタイムタンパク質占有を捕捉するために使用することができる。この可能性を利用するために、我々は、組織切開時に骨格筋の架橋を可能にし、勾配超遠心分離を行わずに核分裂を合理化する方法を開発することを目的とした。肝臓のような柔らかい組織と比較して繊維が豊富な骨格筋を均質化することの困難さのために、我々は氷冷PBS中で筋肉組織を細かく刻んだ後、試料をホルムアルデヒド緩衝液中で均質化した。クエンチング後、組織懸濁液WA遠心分離し、氷冷した塩基緩衝液ですすいで残りのホルムアルデヒドをすすいだ。 Dounceホモジナイゼーションによって核を放出させ、ホモジネートを順次ろ過して細胞破片および筋原線維を徐々に除去した。我々は収率に悪影響を及ぼす可能性のあるフィルタ...

骨格筋は生理および行動において重要な役割を果たす。多核筋繊維は、アクチンとミオシンが収縮力を発生させる筋節と呼ばれる機能単位を形成する筋原繊維からなる。骨格筋は体内で最大の代謝臓器でもあり、食後のグルコース摂取量が80％を超え、インスリン応答と代謝ホメオスタシスを調節します1,2 。筋肉の生理および代謝は、内在的な時計である内在的な生物学的タイマー3,4,5,6によって厳密に規制されている。例えば、概日の主要な時計成分の1つであるBmal1の骨格筋特異的欠損は、インスリン抵抗性をもたらし、骨格筋におけるグルコース取り込みを減少させ、動物は2型糖尿病を発症することが判明した7 。私さらに、骨格筋も内分泌臓器8として評価され、全身の代謝および生理機能を調節するためにミオシンを分泌する。骨格筋におけるこれらの調節機能を完全に理解するためには、機構的研究が必要である。 ChIPは、DNA結合タンパク質のプロモーター補充を描写するための強力なアプローチである。 ChIPは、最初にクロマチンDNA 9,10上のヌクレオソーム構成を同定するために開発された。ホルムアルデヒド、硫酸ジメチルまたは紫外線照射（UV） 11,12を使用してタンパク質およびクロマチンDNAを架橋する様々な方法が報告されている。ホルムアルデヒド架橋は、最も一般的に使用され、クロマチン構造およびDNA-タンパク質相互作用を保存している9,13,14。架橋クロマトグラフィーinを音波処理により細断し、目的の特定のDNA結合タンパク質15,16に対する抗体で免疫沈降させる。近年、ChIPとNGSを組み合わせたChIP配列決定法（ChIP-seq）は、ゲノム全体の転写因子結合を調べるために開発されており、場合によっては時間経過に伴う動的変化をモニターするために開発されている18,19,20 。例えば、概日ChIP-seq研究は、24時間の概日周期18にわたって時間的に正確な遺伝子発現を駆動する概日クロック成分およびヒストンマーカーのゲノム結合の高度に調整された配列を明らかにした。 最も入手可能なChIPプロトコルは、軟組織（ 例えば、肝臓、脳など ）用に設計されており、骨格タルマシン。繊維が豊富な骨格筋を均質化し、高品質の核21を分離することは技術的に困難であり、特に架橋を必要とするChIP実験の場合には困難である。最近の筋肉ChIP研究22では、衛星細胞を筋繊維から分離し、核を両方の細胞型から、組織消化を含む長期の手順によって調製した。ホルムアルデヒド架橋が単離された核の上で行われる前に、全工程が完了するまでに約3時間を要した。この手順は、筋肉組織をより効率的な均質化に対して不応性にし、高品質の核を生成することができた筋繊維の架橋を回避したが、組織の収集から核の架橋への有意なタイムラグは、 - タンパク質相互作用。対照的に、ほとんどの研究は、リアルタイムDNA-プロテイムを保存するために、実験的処置または組織回収の直後に架橋を行ったn結合12 。架橋前の核単離の第2の欠点は、典型的には3〜4時間間隔で生じる概日検体採取のような時間依存性の適用を排除することである。核を架橋させることなく、解離の直後に単離を進行させる必要があるのに対し、架橋した試料は時間経過全体が完了した後に一緒に処理することができ、実験の一貫性を保証する。 未架橋骨格筋からの核の単離のための他のプロトコールも報告されている。 2つの研究では、勾配超遠心分離を使用して残りの筋原線維および細胞破片から核を分離することが記載されている23,24 。スクロースまたはコロイド勾配超遠心分離が未架橋筋肉組織に有効である一方で、本発明者らの実験は、架橋後、勾配超遠心分離が細胞dから核を分離することができないことを明らかにしたエブリスはグラデーションに乗っています。 したがって、我々は、架橋マウス骨格筋組織を用いて高品質の核を単離するための手順を開発した。グラジエント超遠心分離ではなく、連続したろ過法を考案し、核を残骸から効果的に分離しました。超音波処理後、クロマチンサンプルは、標的プロモーターに結合するBMAL1タンパク質の概日パターンを示すChIP研究に首尾よく適用された。我々の方法は、筋肉組織の様々な機械的研究に広く適用することができる。

<table><tbody><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue 溶液 (0.4%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10109142001</td><td></td></tr><tr><td>Protease K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115887001</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Anti-BMAL1 抗体</td><td></td><td></td><td>ニワトリ(Cocalico Biologicals)で抗原aa 318 - 579に対して生成され、IgYは同じ抗原を使用してアフィニティー精製されました。&nbsp;</td></tr><tr><td>チキンIgY沈殿樹脂</td><td>GenScript</td><td>L00405</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KINEMATICA&nbsp;Polytron PT2100 ベンチトップ ホモジナイザー</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>08-451-178</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ダウンス ティッシュ グラインダー</td><td>Whearton</td><td>357544</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell Strainers 100 & micro;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-19</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンセルストレーナー 70 & マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンセルストレーナー 40 & マイクロ;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 30 & マイクロ;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50030-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 20 & マイクロ;m</td><td>プルリセレクト</td><td>43-50020-03</td><td></td></tr><tr><td>プルリストレーナー 10 & マイクロ;m</td><td>PluriSelect</td><td>43-50010-03</td><td></td></tr><tr><td>Covaris S2集束超音波装置</td><td>Covaris</td><td>モデルS2</td><td></td></tr><tr><td>Labquake&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>CCD顕微鏡カメラ</td><td>&nbsp;Leica Microsystems</td><td>DFC3000 G</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA extraction kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>すべてのバッファー成分がプロトコルに記載されています。各コンポーネントはSigma Aldrich</td><td></td><td></td><td></td>から購入しました</tr></tbody></table>

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

クロマチン免疫沈降（ChIP）は、クロマチンDNAへのタンパク質結合を決定する強力な方法です。しかしながら、繊維が豊富な骨格筋は、筋原繊維の汚染を最小限に抑えた高品質の核の単離における技術的困難のために、ChIPの課題であった。以前のプロトコールでは、架橋前に核を精製しようと試みたが、これは核形成の延長過程でDNA-タンパク質相互作用の変化のリスクを招く。現在のプロトコールでは、まずマウスから採取した骨格筋組織を架橋し、組織を細かく砕いて超音波処理した。我々は超遠心分離が架橋筋肉組織を用いて筋原線維から核を分離することができないことを発見したので、重要な筋線維汚染のない高品質の核を得るために逐次濾過手順を考案した。その後、超音波装置を用いてクロマチンを調製し、抗BMAL1抗体を用いたChIPアッセイにより、遺伝子プロモーターを標的とするBMAL1のパターン。この濾過プロトコールは、架橋骨格筋組織から高品質核を単離するための簡単に適用可能な方法を構成し、概日および他の時間に敏感な研究のための一貫した試料処理を可能にする。次世代シークエンシング（NGS）と組み合わせて、本発明者らの方法は、骨格筋機能に焦点を当てた様々な機構およびゲノム研究のために配置することができる。

ここでは、リアルタイムDNA-タンパク質相互作用を保存するために、組織回収直後にホルムアルデヒド架橋を行った。しかし、我々は、核分離23,24に一般的に使用されるスクロースまたはコロイド勾配は、筋原線維から核を分離するのに有効でないことを見出した（データ示さず）。その理由は、架橋が核および筋原繊維に同様の重力を与えたためであろう。したがって、我々は、核の画分から大きな筋原線維および他の破片を効果的に除去するための連続濾過プロセスを開発した。 100μmの濾過後、依然として大きな組織破片および筋原繊維が存在した（ 図 1A ）。これと比較して、逐次ろ過の終了時に、大部分の組織破片、インタクトな細胞および大きな筋原線維が首尾よく除去された（ 図 1B ）。 <p clこれらの核は、皿状の超音波処理のために使用されました。 -80℃で保存...

我々は、超遠心分離の必要性を排除した、架橋マウス骨格筋から高品質の核を単離するための濾過ベースのプロトコールを提示し、容易に適用することができる。本発明者らは、核から調製されたクロマチンが、クロマチン免疫沈降およびクロマチン免疫沈降配列決定研究に適していることを示す。

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

この実験手順の全体的な目的は、クロマチン免疫沈降（ChIP）解析に使用可能な、架橋された骨格筋からの高品質な核を調製することです。この手法は、概日リズムやその他の時間感受性のある文脈における筋肉組織および細胞を用いたゲノム研究など、筋肉および概日リズム分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、サンプルの即時架橋が可能であること、およびろ過に基づく手順によって、筋原線維の混入を最小限に抑えつつ、高品質な核を確実に単離できることです。この手法は骨格筋に関する知見を得るために有用ですが、心筋や平滑筋などの他の系にも適用可能です。既報の手法に従い、約20週齢のC57 black six雄マウスから分離した後肢骨格筋を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で重量測定し、細切します。細切した骨格筋組織を、10 mLのPBSが入った50 mLコニカルチューブに入れ、氷上で保持します。次に、サンプルを4°Cで300 ×g、5分間遠心分離します。吸引によりPBS上清を慎重に取り除きます。1、2、3、および4 mLの水を入れたリファレンスチューブを用いて、各50 mLチューブ内のペレットの体積を推定します。氷冷した1% formaldehydeおよびPBSを7容量分加え、プローブ式組織ホモジナイザーを用いて氷上でサンプルをホモジナイズします。次に、室温で10分間インキュベートし、サンプルの架橋を行います。その後、1 molar glycineを最終濃度0.125 molarになるように添加し、室温で5分間インキュベートして架橋反応を停止させます。サンプルを4°Cで3,000 ×gで5分間遠心分離した後、上清を吸引して取り除きます。新たにプロテアーゼ阻害剤を添加した氷冷ベースバッファー10 mLに再懸濁して、ペレットを洗浄します。サンプルを再度遠心分離し、上清を注意深く吸引して取り除きます。次に、新しく添加したプロテアーゼ阻害剤を含むライシスバッファー6 mLでペレットを再懸濁します。サンプルをあらかじめ冷却した15 mLのDounceホモジナイザーに移し、氷上で10分間インキュベートします。核を遊離させるため、ルーズペッスルを用いてゆっくりと15回、続いてタイトペッスルを用いて15回、各サンプルを氷上でDounceホモジナイズします。高品質な核を単離するための鍵となるのが、以下のろ過工程です。ホモジネートをセルストレーナーでろ過し、4 mLの溶解バッファーで洗浄します。その後、サンプルを4 °Cで1,000 ×g、10分間遠心分離します。ペレットを5 mLの氷冷ベースバッファーに再懸濁し、タイトペッスルを用いて10回ダウンス均質化し、核を放出させます。次に、懸濁液をセルストレーナーでろ過し、チューブを2 mLのベースバッファーで洗浄して、再度ろ過します。孔径を段階的に小さくしたセルストレーナーを用いて、ろ過を繰り返します。最後に、4°Cで1,000 ×gにて10分間遠心分離します。上清を除去し、ペレットを500 µLのベースバッファーで再懸濁させた後、再度遠心分離を行います。上清を廃棄し、ペレットを-80°Cで保存します。サンプルを500 µLのSDS溶解バッファーで融解し、緩やかにピペッティングして再懸濁させます。核DNA懸濁液を氷上のガラスバイアルに移します。単離した核からクロマチンを調製する場合、適切な超音波処理プラットフォームと条件を選択することが極めて重要です。テキストプロトコルに記載された設定を用い、ディスク型トランスデューサーから集束させた超音波エネルギーを照射してソニケーションを行います。ソニケーション後のクロマチンを1.5 milliliterチューブに移します。その後、12,000 ×gで15分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移します。次に、超音波処理したサンプルを50 µL取り、新しい1.5 mLチューブに移し、65 °Cで一晩逆架橋を行います。DNAサンプルの回収については次節に記載します。テキストプロトコルに記載されている超音波処理の評価と定量を行った後、融解したクロマチンを1本あたり約100〜120 µgずつ分注します。次に、クロマチンを免疫沈降バッファーで10倍に希釈します。続いて、BSAでプレブロックしたprotein HE agaroseまたはIgYビーズの50%スラリーを40 µL加え、ローテーターを用いて4°Cで3時間インキュベートします。サンプルを1,000 ×gで10分間遠心分離した後、上清を新しいチューブに注意深く移します。次に、クロマチンDNA 25〜100 µgあたり1 µgの抗体を添加します。4 °C、約15 rpmで一晩緩やかに回転混和します。その後、BSAでプレブロックしたProtein HEアガロースまたはIgYビーズを10 µL添加し、混合します。ビーズ懸濁液をコールドルームで2時間回転混和させます。次に、テキストプロトコルに詳述されている通り、RIPAバッファー、高塩濃度バッファー、塩化リチウムバッファー、およびTris EDTAの順でビーズを洗浄します。洗浄後、1,000 ×gで1分間遠心分離し、上清を慎重に除去することで、ビーズからDNAを溶出させます。ビーズを50 µLの溶出バッファーで再懸濁します。その後、65 °Cで10分間インキュベートします。インキュベーション後、12,000 ×gで5分間遠心分離します。上清を除去し、さらに50 µLの溶出バッファーを加えて、12,000 ×gで5分間、再度遠心分離します。最終的な溶出量は100 µLになります。架橋を解除してDNAを溶出させるには、まず溶出したクロマチンを65 °Cで一晩インキュベートします。次にRNase Aを1 µL加え、37 °Cで30分間インキュベートします。続いて、10 mg/mLのプロテアーゼKを8 µL加え、55 °Cで30分間インキュベートします。製造元のプロトコルに従い、溶出液量を50 µLとしたPCR精製キットを用いてDNAを回収します。最後に、既報の方法に従い、リアルタイムQPCRでプロファイルを解析します。連続ろ過により、組織残渣が効果的に除去されました。比較のため、初回ろ過後および連続ろ過後のサンプルの代表的な画像をここに示します。10サイクルの超音波処理によるクロマチンの段階的な断片化が、アガロースゲル電気泳動によって示されています。消化済みクロマチンを10サイクル超音波処理した結果、DNAは約500 bpとなりました。ここでは、ZT6およびZT18に採取したマウス骨格筋サンプルのBオス1例における代表的なqPCR結果を示します。Dbp遺伝子上のDbp結合部位の解析により、以前の結果と一致してZT6付近に結合ピークがあることが明らかになりました。習熟すれば、適切に実施することで核の調製は5〜6時間で完了します。このビデオを視聴することで、ろ過ベースの手法を用いて、架橋された筋肉組織から高品質な核およびクロマチンDNAを精製する方法について十分に理解できるはずです。この手順を実施する際は、サンプルを氷上または低温室で保持すること、およびろ過工程の前後で顕微鏡による確認を行うためにサンプル分注分を保存しておくことが重要です。本手法の開発により、筋肉およびゲノミクスの分野の研究者は、さまざまな筋肉組織におけるクロマチンとタンパク質の相互作用の概日リズムや時間依存的なダイナミクスを探索することが可能になりました。本手順に続き、筋肉組織における転写因子の結合パターンを調べるなど、さらなる問いに答えるためにchIP sequencingなどの他の手法を実施することができます。

a-filtration-based-method-preparing-high-quality-nuclei-from-cross

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ESCの分化は、細胞型特異的構造の変化とクロマチンの構成と一致している。これらの変更の検出はstemcellnessと細胞分化を定義するメカニズムが貴重な洞察を提供します。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、幹細胞の分化の分子メカニズムを解明する貴重な方法を表します。...

ヒト胚性幹細胞からクロマチン免疫沈降

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である...

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

我々は、一次T細胞を用いたクロマチン免疫沈降のための堅牢な方法が記載されている。メソッドは、標準的なアプローチの上に成り立ったが、細胞の数量限定のために効率を改善条件や試薬の特定のセットを使用しています。重要なことは、データ分析段階の詳細な説明が提示される。...

バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

このプロトコルは、野生型と人間INO80クロマチンリモデリング複合体の変異型を生成し、精製するための手順を説明します。エピトープはINO80サブユニットのバージョンが安定してHEK293細胞で発現されタグ付けされ、サブユニットの特定のセットを欠いている完全な複合体と複合体を、免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。...

発生と人間INO80クロマチンリモデリング複合体とSubcomplexesの精製

クロマチン免疫沈降による筋線維の遺伝子の規則の研究に適応した成体マウス骨格筋からクロマチンの準備のための新しいプロトコルが表示されます。...

クロマチン免疫沈降マウス骨格筋からの改善されたプロトコル

クロマチン免疫沈殿(ChIP)は、遺伝子調節の分子機構を理解するための強力なツールです。しかしながら、この方法は、機械的せん断による再現性クロマチン断片化を得ることに困難を伴う。ここでは、酵素消化を用いたChIPアッセイの改良されたプロトコルを提供する。...

哺乳類細胞における微小コッカルヌクレアーゼを用いてクロマチン免疫沈殿アッセイ

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。...

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

筋肉間脂肪組織(IMAT)の生物学は、ヒト組織のアクセス性が限られているため、ほとんど未踏です。ここでは、このユニークな脂肪貯蔵庫の細胞組成を特定するための単一核RNAシーケンシングのための凍結ヒトIMATの核単離とライブラリ調製のための詳細なプロトコルを紹介します。...

ヒト筋肉間脂肪組織からの核の単離と下流の単一核RNAシーケンシング

学ぶ ろ過ベースの核分離法により、架橋したマウス骨格筋から高品質な核を調製する方法です。クロマチン免疫沈降研究に適用でき、ミオフィブリル汚染を最小限に抑えます。

クロマチン免疫沈降のための架橋された骨格筋からの高品質核の調製のためのろ過に基づく方法

さらに動画を探す