Name: マウス モデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶマウスモデルにおける心肺バイパス新手法。心臓損傷の分子メカニズムを詳細に研究し、長時間心肺バイパスや心停止液の影響を解明。微小外科技術を用いた非生存急性モデルで、心臓外科の研究に貢献します。

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著者の謝辞があります。

すべての動物実験と動物愛護委員会 (低いザクセン州オフィス プロトコル食の安全と消費者保護のための承認されたドイツ動物保護法 (TierSchG) に準拠して行ったTSA 14/1556)。このモデルに適したマウスの最小限の重量が 25 g.
 1 術前準備 注: すべての手続は、きれいな、非無菌条件下でオートクレーブ楽器。。
<ol><li>場所 50 60 8 cm 長いプロピレン中空管の並行ファイバー両側 T-アダプターを接続してください。接着剤と中空繊維と T-アダプターの外部のブランチの間のスペースを埋める。
	<ol><li>許可少なくとも 24 h 硬化する接着剤。標準ミクロトームを使用して T-アダプターから広がっている中空繊維をカットし、シリコン チューブを接続サイトにプルします</li>。
	</ol></li> <li>(26 G branule) から 27 G の金属針を 2 Fr ポリウレタン カニューレに挿入します。外科ブレードを使用し、マイクロ剪刀、約 0.15 cm 各確保するためカニューレの遠位 3 分の 1 以内の 3 ~ 4 ピンホール最適な静脈を顕微鏡 (8-12 倍の倍率) で元に戻る流量。
	<ol><li>削除完了時のワイヤ。鈍的切離と構造の撤回に綿棒を使用します。組織の脱水を防ぐために余分な水分を吸収するガーゼ綿棒 (5 × 5 cm 2) を使用します</li>。
	</ol></li> <li>プライミング ボリュームを準備します。完了すると、30 mL ソリューション 2.5% v v/バッファリング NaHCO 3 の 8.4% 溶液をプライミングあたりヘパリン IU を追加します。4 ° C まで使用でこのソリューションを保存します</li>。
	<li>を埋める CPB 回路 (すなわち、ポンプ、空気のわな猟師、チューブ、両方カニューレ) 静脈カニューレを介して 850 μ L プライミング溶液で。一度いっぱい、動物穿刺の準備が整うまで、体外循環の循環を維持します</li>。
</ol> 2。動物の麻酔、麻酔を管理する誘導商工会議所 2.5% 未満に動物を配置する <ol><li>v/イソフルラン/酸素混合物。ペダル逃避反射、尾ピンチ反射、目の瞬目反射を評価することによって、適切な麻酔を確認します。目の乾燥を避けるために獣医の目軟膏を適用します</li>。
	<li>は、温度調節機能を持つ地球温暖化パッドに動物を配置します。プローブを直腸に挿入し、データ集録システムに接続されている体温を測定します</li>。
	<li>による麻酔が達成された後は、動物 orotracheally 20 G プラスチック製 braunule を使用して、口頭でそれを挿入してビジュアル制御の下で気管にプッシュを挿管します。マウスの人工呼吸器に接続されているイソフルラン気化器を使用して換気を開始します。動物の重量に応じて 250 350 μ L の一回換気量を達成、換気を調整する。</li>。
	完全無痛を保証するために <li>5 mg/kg の動物体重カルプロフェンを皮下注入します。イソフルラン麻酔濃度を酸素では 1.3 2.5% の間維持することをお勧めします。イソフルラン濃度は、手続の段階に応じて手動で調整すること</li>。
</ol> 3。手術 <ol><li>における麻酔・気管挿管が達成された後シャープ罰金ハサミ首に正中皮膚切開を実行、ぶっきらぼうな方法で筋肉を分離、右の内頚静脈と左頚動脈を公開します。準備中、最小限の失血を確保するためバイポーラ鉗子に接続されている獣医凝固装置を用いた血管を凝固します</li>。
	<li>頚静脈血管の準備の後 8-0 絹糸を使用してその分岐する左総頚動脈の遠位のセグメントを縛る頭側</li>。
	<li>シリコン コネクタ (ID 0.5 mm、1 mm 外径)、場所 8-0 絹糸スリップを使用して動脈流入管に 27 G カニューレの先端節動脈と内頚動脈にカニューレの先端を挿入の近位のセグメントに接続します</li>。
	<li>カニューレ先端部の適切な配置後、カニューレ先端が事前に、それは 3-4 mm 近位大動脈弓を産みます。8-0 絹の結び目を確保することでカニューレ先端を修正します</li>。
	<li>による顕微鏡下鉗子、はさみ、鈍とシャープな郭清を実行、胸鎖乳突筋の鎖骨の近くに、横に組織の鈍的準備によって右の内頚静脈を公開、遠位端で 8 0 8-0 絹結び目を配置近位端でループします</li>。
	<li>頚静脈の遠位端の血管を結紮後右頚静脈と右心房方向への進行状況に静脈カニューレの先端を置き、絹の結び目を使用してセキュリティで保護します。最適な静脈還流には右心室に入る静脈のヒントを事前に必要がある場合があります</li>。
	<li>正しいカニューレの位置を達成すると後で 2.5 頚静脈に直接静脈注射を介して動物の体重の 1 グラムあたりヘパリン IU を追加することによって全身パリン投与群を実行します</li>。
	<li>リアルタイム侵襲的圧監視、左大腿動脈を cannulate。鼠径部を公開し、25 倍の倍率の下で大腿神経大腿静脈から総大腿動脈でそっと分ける。
	<ol><li>Ligate 大腿動脈の遠位部。一時的にスリップ ノットの近位部分を閉塞し、マイクロ鉗子を用いた前壁に小切開を作る</li>。
		<li>はその後、大腿動脈に 1 Fr ポリウレタン カニューレを挿入、シルク 10-0 縫合糸で固定します。このカニューレは血液ガス分析血液サンプルを抽出するために使用します</li>。
	</ol></li> <li>動脈と静脈カニューレの成功後、ポンプを回して人工心肺を開始。挿管から体外循環の開始までの時間は約 45 分ポンプの速度を増やすことによって全身の圧力測定とは完全に流れ (4-6 mL/分) 2 分以内の増加血流によって、0.5 mL/分の流量を使用して起動します</li>。
	<li>完全監視下胸骨から始まって、尾側方向に 5 mm の鋭いはさみを使用して上部胸骨を実行します。出血を避けるためにすぐに胸骨端を凝固します。右頚動脈を頭蓋の方向に引いて大動脈弓を公開します</li>。
	<li>最適制御のため無料胸腺とクランプを容易にする周囲の組織から大動脈弓の円周。上行大動脈の周りに 8-0 シルク ループを配置します。心術のクロスのクランプを配置するプルより良い公開する頭蓋方向にシルクのループ上行大動脈</li>。
</ol> 4。人工心肺や血液ガス分析 <ol><li>血液ガス分析 (BGA)、大腿動脈カテーテル経由で 60-90 μ L 動脈血を収集するガラス毛細管を使用します。
	<ol><li>は、シリコーン チューブに小さなクランプを使用して、カテーテルからチューブを切り離します。キャピラリー チューブの制御充填できるようにクランプのゆっくりと圧力を解放します</li>。
		<li>では、カテーテルにシリコン チューブを接続し直します。キャピラリー チューブを挿入次の時点で測定用血液ガス分析器: (BGA1) の換気と体外循環の開始後 10 分 体外循環と呼吸の阻止 (BGA2) 15 分 25 分後 40 分の体外循環、呼吸の阻止 (BGA3) の 30 分後 CPB の 55 分、呼吸器、45 分、心不全 (BGA4) の 20 分後</li></ol></li> <li>安定した消保院流、コスモスイニシアテ ・換気を停止することによって呼吸停止します</li>。
	<li>換気が終了した後地球温暖化パッドを 28 ° C に設定して、冷たい生理食塩水に浸したガーゼを使用して呼吸停止の最初の 20 分以内の 28 ° C の体温に動物を局所的に冷却を開始します</li>。
	<li>28 ° C の体温が達成されれば、呼吸停止の 30 分の合計後、心術を開始する体外循環回路に 7.45 %kcl 溶液 0.3 mL を管理します</li>。
	<li>の大動脈のクランプをクロスより露出するため頭蓋方向に引いて、以前に配置したシルク ループ (ステップ 3.10)、大動脈の上行する部分にマイクロ serrefine クランプを配置します</li>。
	<li>は、合計 60 分の呼吸停止と心停止の 30 分を実行します。心の再灌流を開始する上行大動脈からマイクロ serrefine クランプを削除します。同時に再換気温かく、動物を 37 ° C</li>
	<li>再灌流が完了し、動物に常温療法、達した後ポンプをオフにする体外循環を終了して 20 分における生理的な測定 (例えば 体温、心電図、観血的血圧) の監視を継続</li>
	<li>実験の終わりには、exsanguinate 完全麻酔 (5% イソフルラン) 動物と血と 14 のさらなる分析のための器官を収集します</li>。
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

完全に機能している臨床的に関連するモデル CPB のマウスを開発しました。心血管疾患を持つマウスの以上 30 系統は、私たちモデルは CPB に関連する新しい将来のプロトコルの開発の開始点を使用できます。また、マウス固有試薬およびノックアウト マウスの茄多、ためこのモデルは CPB の現在のラットのモデルを置き換えることはできません、体外循環関連臓器の損傷に関与する分子メカニズムの解剖を容易に。までに、CPB がマウスのカニュレーション法で顕微鏡下の課題としてマイクロ人工の十分に小さいプライミング容積の開発など技術的な課題に適用されていません。約 90 のコース、経験豊富な微小血管の勤勉な仕事が安定したモデルを達成するために必要でした。異なるローラー ポンプ、チューブ、および多様な貯水池を有する CPB マシンの以上 15 プロトタイプおよびテストされたが、常に改善します。以上 10 のバージョンの異なる人工肺は構築され、現在の結果を達成するためにテストします。私たちの新しいモデルは体外循環の既存のラットのモデル設定の完全な再設計を必要です。まず、我々 は最小の可能なマイクロ人工の可能なプライミング ボリュームを構築 &#60; 0.3...

心肺のバイパス (CPB) のクリニックへの導入、以来それは心臓手術1で重要な役割を果たしてきました。現代の心臓外科で長時間の体外循環時間豊富な大動脈再建と結合された手順を実行することが欠かせません。技術の進歩は、途方もないされていますが、体外循環の使用が関連付けられている術中と術後全身と地方機関損傷2,3。
大動物モデルは生理的過程4,5CPB の役割を調査するために開発されています。ただし、これらのモデルは、合併症、CPB のいくつかの洞察を提供している、彼らは非常に高価と分子ツール (抗体など) は非常に限られます。小動物でコスト効率的な代替物を開発しました。その開発以来複数の研究はラットおよびウサギ5,6,7,8,9で体外循環モデルを最適化するために行われています。これらのモデルは、疾患の病態生理学的プロセスの測定の良い基盤を提供します。しかし、彼らは関連抗体・試薬の不足のため携帯電話や体液の免疫学を調査するためにまだ十分ではありません。これは、研究のこの分野での役割を損ないます。
最近 CPB のマウス ・ モデルを開発しました。さまざまなマウス固有試薬、遺伝子組み換えマウスによるマウス モデルは一般的には生理学的、分子、および免疫学的研究10,11の選択のモデル.したがって、我々 のモデルは臨床的に関連する疾患12,13で利用できる多くのマウス系統があるので、さまざまな合併症に関連して体外循環の研究を促進します。したがって、本稿で、具体的には、マウスで体外循環を実行する方法。酸素と血行動態的パラメーターは、深い呼吸・循環の逮捕後密接に監視されます。

<table><tbody><tr><td>Sterofundin</td><td>B.Braun Petzold GmbH</td><td>PZN:8609189</td><td>プライミング量、1:1 with Tetraspan</td></tr><tr><td>Tetraspan 6% HES Solution</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>PZN:</td><td>05565416プライミング量、1:1 with Sterofundin</td></tr><tr><td>Heparin Natrium 25.000</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td>PZN: 3029843</td><td>2.5 IU/mL のプライミング溶液</td></tr><tr><td>NaHCO3 8,4% Solution</td><td>B. Braun MelsungenAG</td><td>PZN:</td><td>プライミング溶液</td></tr><tr><td>KCL 7.45%溶液</td>中に1579775 3% 溶液<td>B.ブラウンメルサンゲンAG</td><td>PZN:</td><td>心臓麻痺のための2418577 0.1 mL</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Zoetis Inc.、米国</td><td>PZN:00289615 08859153</td><td>5 mg / kg / BW</td></tr><tr><td>1 Fr PUカテーテル</td><td>Instechlabs INC.、米国</td><td>C10PU-MCA1301</td><td>頸動脈</td></tr><tr><td>2 Fr PUカテーテル</td><td>Instechlabs INC.、米国</td><td>C20PU-MJV1302</td><td>頸静脈</td></tr><tr><td>Vasofix安全カテーテル20G</td><td>B.Braun Medical</td><td>4268113S-01</td><td>口腔気管挿管</td></tr><tr><td>8-0シルク縫合編組</td><td>アシャウェイライン&Twine Mfg. Co., USA</td><td>75290</td><td>結紮糸</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Piramal Critical Care Deutschland GmbH</td><td>PZN:9714675</td><td>narcosis</td></tr><tr><td>CLINITUBES 血液毛細血管</td><td>Radiomed GmbH</td><td>51750132</td><td>採血 60 - 95 マイクロリットル</td></tr><tr><td>スプリングハサミ - 6mm ブレード</td><td>ファイン サイエンス ツール GmbH</td><td>15020-15</td><td>機器</td></tr><tr><td>スプリング ハサミ - 2mm ブレード</td><td>ファイン サイエンス ツールGmbH</td><td>15000-03</td><td>instruments</td></tr><tr><td>Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>13009-12</td><td>instruments</td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>11295-51</td><td>instruments</td></tr><tr><td>Castroviejo Micro Needle Holder - 9cm</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>12060-02</td><td>instruments</td></tr><tr><td>Micro Serrefines</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>18555-01</td><td>楽器</td></tr><tr><td>Bulldog Serrefine</td><td>Fine Science Tools GmbH</td><td>18050-28</td><td>instruments</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator for Mice (Model 845)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0044</td><td>mechanical ventilation</td></tr><tr><td>Isoflurane Vaporizer Drager 19.1</td><td>Dr&auml;ガーヴェルクAG &Co. KGaA</td><td></td><td>麻酔 1.3 - 2.5%</td></tr><tr><td>PowerLab データ収集装置 4/35</td><td>ADInstruments Ltd, New Zealand</td><td>PL3504</td><td>侵襲的圧力、ECG、温度</td></tr><tr><td>ABL 800 Flex</td><td>Radiometer GmbH</td><td></td><td>血液ガス分析</td></tr><tr><td>NMRIマウス</td><td>チャールズリバー研究所</td><td>Crl:NMRI(漢)</td><td>オス、30 - 35 g、12週齢、実験の少なくとも1週間前に収容</td></tr></tbody></table>

マウス モデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ

Cardiopulmonary Bypass in a Mouse Model: A Novel Approach

心臓介入中に長時間心肺がますます不可欠になると手順の最適化のため、長時間体外循環に起因する臓器障害を最小限に抑えるため臨床需要の増加が発生します。このホワイト ペーパーの目的は、マウスで人工心肺の完全に機能と臨床的に関連するモデルを実証することでした。デバイス設計、灌流回路の最適化、および顕微鏡技術について報告する.このモデルは、複数の血の図面の必要性のための生存と互換性がない急性モデルです。マウス (例えばマーカー、ノックアウトのなど) に利用できるツールの範囲のための器官の損傷との関係において人工心肺の影響の分子機構に調査容易になりますこのモデル併存疾患。

このプロトコルを記述する灌流回路、外科的処置、およびマウスの CPB 中の生理的パラメーターの監視します。十分に熟練した微小血管によって実行されるとき、一貫性と再現性をもって結果が。
適切な組織灌流を維持するために平均動脈圧は常に体外循環血流を調整し、余分なボリュームを追加することによって 40 と 60 の mmHg の間保持されます。動物、そのボリュームのステータスと体温の重量に応じて 2.3 6.5 mL/分回路へのプライミング溶液 0.1 mL の添加による実験中にボリュームの損失の補正を達成間体外血流は維持されます。CPB 中。全身 pH 安定化は NaHCO28.4 ミリ モル/L を追加することによって実現されます。すべての流体は、空気塞栓のリスクを軽減する空気トラッピング貯留層を介して管理されます。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

本稿では、マウスで人工心肺を実行する方法について説明します。この小説のモデルは臓器の損傷に関与する分子メカニズムの調査を促進します。

As prolonged cardiopulmonary bypass becomes more essential during cardiac interventions, an increasing clinical demand arises for procedure optimization ...

本手順の全体的な目的は、心損傷の根底にある分子メカニズムの研究を向上させるため、マウスにおける心肺バイパスの新規アプローチを提供することです。この手法は、心臓外科における重要な疑問、特に長期の心肺バイパスや長時間にわたる心停止液投与に関連する疑問を解決するのに役立ちます。この新規な非生存急性モデルの主な利点は、心臓外科における分子メカニズムと、他の併存疾患との関係についての研究を容易にすることです。まず、手術に使用する2 Frenchのポリウレタンカニューレを準備します。カニューレに27ゲージの金属針を挿入し、顕微鏡下で外科用メスとマイクロシザーを用いて、カニューレの遠位3分の1の範囲に3〜4か所の窓（フェネストレーション）を作成します。これにより、最適な静脈還流が確保されます。CPB回路用のプライミング溶液を調製します。まず、チューブにSterofundinを加え、次にTetraspanを加えます。仕上げにヘパリンを加え、緩衝剤として炭酸水素ナトリウムを加えます。溶液は使用時まで4°Cで保存します。CPB回路をプライミングするには、静脈カニューレからプライミング溶液を850 µL加えます。プライミング完了後、動物のカニュレーションの準備が整うまで溶液を循環させ続けます。血液分析のため、左大腿動脈にカニューレを挿入します。まず、鼠径部を露出し、総大腿動脈を大腿静脈および大腿神経から慎重に分離します。全身麻酔と気管挿管が完了した後、鋭利な微細剪刀を用いて、頸部の正中線に皮膚切開を加えます。次に、鈍的に筋肉を剥離して、右頸静脈と左総頸動脈を露出させます。必要に応じて、バイポーラピンセットに接続した動物用凝固器を用いて小血管を凝固させます。頸部の血管を準備した後、8-0シルクサチャーを用いて、左総頸動脈の分岐部から末梢側のセグメントを頭側で結紮します。次に、マイクロサージカル鉗子と鋏を用いて、胸鎖乳突筋の側方で組織を鈍的に剥離し、鎖骨付近の右頸静脈を露出させます。その後、8-0シルクを用いて頸静脈の遠位端と近位端を結紮します。結紮後、静脈カニュラの先端を右頸静脈に挿入し、右心房まで進めてから、縫合糸を結んでカニュラを固定します。次に、動脈の近位端に8-0シルク縫合糸でスリップノットを形成し、カニューレの先端を頸動脈に挿入します。最適な静脈還流を得るために、静脈側の先端を右心室まで進める必要がある場合があります。カニューレが正しい位置に配置されたら、頸静脈に直接静脈内注射し、動物の体重1gあたり2.5ユニットのヘパリンを投与して全身ヘパリン化を行います。次に、大腿静脈の遠位端を結紮し、近位端をスリップノットで一時的に遮断します。その後、マイクロ鉗子を用いて前壁に小さな切開を入れ、カニューレを挿入できるようにします。ここで、1 Frenchのポリウレタン製カニューレを挿入し、シルク10-0縫合糸で固定します。CPBを開始するには、ポンプを約0.5 milliliters per minuteで始動させます。2分以内に、流量を46 milliliters per minuteまで上げます。次に、完全なモニタリング下で上部正中胸骨切開を行います。鋭い鋏を使用し、胸骨柄から尾側方向に5 mmまで切開します。直ちに胸骨縁を凝固させ、右総頸動脈を頭側方向に牽引して大動脈弓を露出させます。適切にコントロールするため、クランプ操作を容易にするよう、大動脈弓を胸腺および周囲組織から周方向に剥離します。次に、上行大動脈に8-0シルクループをかけ、シルクループを頭側方向に引きます。心停止液投与のためのクロスクランプを設置できるよう、上行大動脈を十分に露出させる必要があります。BGAサンプルの採取には、ガラス毛細管を用いて、大腿動脈カテーテルから60～90 µLの動脈血を採取します。チューブを満たすために、シリコンチューブのクランプをゆっくりと緩め、シリンジからキャピラリーへ血液を移します。安定したCPB血流下で、人工呼吸を停止させて呼吸停止を誘発します。呼吸停止後の最初の20分以内に、冷生理食塩水に浸したガーゼを用いて動物を局所冷却します。体温が28°Cに達し、呼吸停止から30分経過後、心停止を誘導するために7.45%塩化カリウムを0.3 mL、CPB回路内に投与します。大動脈を遮断するため、あらかじめ配置しておいたループを頭側へ引き、上行大動脈にマイクロセリフィンクランプを留置します。合計で60分間の呼吸停止および30分間の心停止を行います。心臓の再灌流を開始するために、クランプを取り除き、同時に動物の再換気を行い、37 °Cまで加温します。再灌流が完了し、動物が正常体温に達した後、ポンプを停止してCPBを終了します。上述のプロトコルを用いることで、再現性のある結果を一貫して得ることができました。生理学的パラメータは、手技の成功中の4つの異なる時点でBGAを用いて評価されました。ヘマトクリット値の測定では、回路へのプライミング液の添加による血液希釈が認められました。しかしながら、実験期間中、ヘモグロビン値は十分なレベルに維持されたため、輸血の必要はありませんでした。BGA（血液ガス分析）により、動物の代謝状態に関する知見も得られた。人工心肺（CPB）の開始および人工呼吸の導入後、動脈血pHは上昇した。予想通り、呼吸停止中は動脈血pHの緩やかな低下が観察された。複雑な手法ではありますが、一度習得すれば、すべての工程を3〜4時間以内に完了させることができます。この手順を実施する際は、カニューレ挿入技術を十分に練習することが非常に重要であり、また実験中は血行動態および酸素化パラメータをモニターすることが極めて重要です。最終的に、この新しいモデルは、人工心肺手術中の急性臓器障害の分子メカニズムの研究に役立ちます。次のステップでは、マウスを用いて人工心肺の臨床生存モデルを構築し、マウスモデルにおける新たな微小外科手技の育成を目指します。

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マウスモデルにおける心肺バイパス: 新しいアプローチ

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