Name: うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。SCID マウス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ肝切除後の脾内肝細胞移植法。NOD.SCIDマウスを用いて部分肝切除と細胞移植の手技を解説し、急性肝不全治療における細胞治療の応用可能性を示します。

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この作品は、インド政府ニューデリー国立免疫学研究所生物資源科学部から受領したコアによって支えられました。博士バッタチャルジー現住所は消化器科、肝臓と栄養、子供のロサンゼルスの病院です。

このプロトコルで説明されている手順は、ニューデリー国立免疫学研究所の機関の動物倫理委員会によって承認されています。承認のシリアル番号は IAEC #319/13.
注: 一般的な手術手順20と齧歯動物の外科21のための特定のプロトコルに優秀な資源があります。初めて動物の外科手術を行うため、勧め広範囲の練習にダミーに手術動物で動作する前に。
1. 準備
<ol><li>実験前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) または生理食塩水の準備をしてください。</li>
	<li>はさみ、鋸歯鉗子、組織鉗子、コットン、綿棒、ナイロン スレッド、および異なるマイクロ ニードル ホルダーを含む手術キットを組み立てます。オートクレーブ手術キット。NOD は、免疫の低下した場合に、特別な注意が必要があります。SCID マウスは、プロトコルに含まれます。</li>
	<li>手術の最後に準備から実験手順を実行、バイオ安全クラス I 内閣。</li>
	<li>うなずきの重量を量る。6-8 週間手術前に古いの SCID マウス。14 18 g の間の重量を量るマウスは本研究で使用されます。</li>
	<li>髪トリマーにマウスの上部中央と肋腹部領域を剃る。髪のトリミングした毛を完全に削除にヘラで地域全体に均等にクリームを削除するを適用します。2-5 分後濡れた滅菌綿の部分のヘルプで軽く毛を削除します。</li>
	<li>イソフルラン チャンバーにマウスを置き、酸素ボンベのバルブのロックを解除します。4 L/分の速度で酸素の流れとイソフルラン気化麻酔を誘導するために 4% を維持します。<ol>
<li>マウスは、穏やかなつま先をつまんで適切に麻酔されていることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>キャビネット バイオセイフティ内手術ボードを配置します。マウスの腹側を向いているし、マウスの前方部分はイソフルランと酸素の供給に接続されている鼻の円錐形内に配置するように、動物を手術基板に配置します。</li>
	<li>イソフルラン気化の 2% を削減し、手術を通してそれを維持します。</li>
	<li>マウスの皮膚を消毒して、70% エタノールに浸した滅菌綿で拭くことによってそれを殺菌.</li>
</ol>2. 手術
<ol><li>
肝部分切除
	<ol>
<li>剣状突起と直線動作はさみの助けを借りて、胸部に平行に垂直、胸骨のすぐ下に皮膚の約 1 cm の横切開を加えます。</li>
		<li>鉗子や皮膚や腹部の筋肉の層を区別する湿らせた滅菌綿棒付け切開領域近傍の腹部の筋肉層で皮膚を優しきます。乾燥を避けるために滅菌綿棒を使用して PBS の皮地域を浸します。</li>
		<li>左葉の領域を剣のすぐ下に腹膜の層を介して横切開することによってスムーズに公開します。肝臓の左葉を持ち上げてを公開する 2 つの湿らせた綿棒を使用します。</li>
		<li>カットの腹部側に綿のヒントの一つに、ダイヤフラムの側面の別の綿のヒントを置きます。優しく、横隔膜に向かって配置ヒントを押すし、肝臓の左葉を持ち上げることによる他の先端スライド プッシュを与えます。</li>
		<li>リフトの左葉をループのナイロン糸を滑り、マイクロ鉗子または綿のヒントの助けを借りて、肺門の近くに左葉の底部に向けてループをスライドさせます。左の葉のベースにナイロン糸ループの下を軽く押します。</li>
		<li>マイクロサージャリー針ホルダーとマイクロ鉗子を使用して左の葉の上にナイロン糸の両端を結ぶ。反対側に 2 つの追加の結び目を作る。</li>
		<li>はさみの助けを借りて、結ばれた葉を分析します。スレッドに近い非常にカットしようとしないでください。場合に手順は、5 分以上続く、潤いを保つ腹腔内や臓器体液の損失のための乾燥を避けるために滅菌 PBS の。</li>
		<li>連続 4-0 腸線縫合糸を使用して縫合、腹膜を縫います。その後、できるだけ早く不連続縫合で皮膚を閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
細胞移植 注: GFP 発現肝細胞が GFP トランスジェニック マウスから分離された (C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30 Scha/J)、李らによって記述された手順に従って。22と沈ら。23 24単球から分化したひと由来の肝細胞様細胞 (NeoHep) は、移植にも使用されました。ただし、他のソースから派生したセルは、プロトコルに使用もことがあります。<ol>
<li>20 万約 50 μ L Iscove の変更ダルベッコ媒体 (IMDM) の細胞を中断し、30 G 針でキャップ 1 mL インスリン注射器で吸引します。氷の上に置くことで、シリンジの寒さを維持します。</li>
		<li>手術を行う人に向かって左の外側部分が上を向くようにマウスを配置します。脾の領域を識別するそして横脾臓を公開する腹膜の層を介して短い切開に続けて、肋領域付近の皮膚を解剖します。</li>
		<li>優しく、脾臓を持ち上げて、2 つ PBS の助けを借りて共振器外には綿棒を湿らせた。</li>
		<li>片手で 2 つ綿棒で慎重に脾臓を押し、注射器の針を脾臓に正確に垂直に配置します。優しく脾臓に穴を開けるし、針を押して内部で非常にゆっくりと。針は、2 mm よりも深い取得しないでください。</li>
		<li>注射器のピストンをゆっくりと脾臓に細胞を注入するプッシュします。移植後注射器の針を安定に保つため、出血を避けるために脾臓または細胞の損失からゆっくりと取り外します。</li>
		<li>綿のヒントと腹腔内に脾臓を配置した後 4-0 腸線縫合糸で連続縫合により腹膜の層を閉じます。不連続同じ縫合と皮膚を縫います。皮膚を閉じるため傷クリップを使用しないでください。代わりに、4-0 縫合して閉じます。傷クリップがマウスの自然な動きを制限して多くの場合クリップが緩むし、すぐに出てくる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 手術後のケア
<ol><li>皮膚を閉じると後に、、ヨード溶液 (betadine) 滅菌綿棒を使用して縫合サイトの両方の周りを拭いてください。</li>
	<li>600 mg/kg 本体重量 (通常は、100 μ L の生理食塩水/マウスで 12 mg セフォタキシム) 腹腔内と抗生物質セフォタキシムの線量を注入 1 mL の注射器を使用しています。</li>
	<li>鎮痛剤メロキシカムの毎日の用量として与える 1 mg/kg 体重 (通常 12 μ g メロキシカム生理食塩水/マウスの 100 μ L の) 動物に腹腔内、手術後は、3 日間。</li>
	<li>手術の終了後、イソフルラン麻酔ガスの流れを止めるし、個別換気ケージに戻ってマウス カーソルを置きます。</li>
</ol>4. euthanization とキャラクタリゼーション
<ol><li>実験的エンドポイント (1 日、手術後 10 日) 後に、、動物倫理ガイドラインに従ってマウスを安楽死させます。</li>
	<li>末期眼ターミナル神経叢を穿刺、動物の出血によって血を収集します。</li>
	<li>血液から血清を分離します。</li>
</ol>

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</ol>

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肝部分切除は調査の肝再生に確立された技術と過剰な切除は AHF モデルを模倣に報告されました。AHF の動物モデルは、齧歯動物、特にマウスは最も研究のモデルがあります。70% 肝切除までのマウス肝障害モデルを取得するには、良い生存率25,26で報告されています。しかし裸や他の免疫不全マウスは、70% 肝切除を致命的なものとして報告された、24 時間27以内に動物が死亡しました。
ミッチェル ・ Willenbring28は、再現性と忍容性マウスの 2/3 切除法を示した。合図。SCID マウス肝切除された肝総量の 30% 近くが左の肝葉切除までは制限時 100% 生存率を得た。ヌードマウス27の観察、に沿っていずれかのうなずきで肝切除の割合の拡大を見ました。SCID マウスは生存率の劇的な低下につながります。また、増殖残りの...

現在、重度の肝障害を有する患者の治療のための全体の臓器移植に代わるものとして肝細胞移植を提案する.それが全臓器移植1患者を埋めることができるといわれています。同種肝2、に加えてまた異種肝3と4幹細胞由来肝細胞を動物モデルで検討されています。このコンテキスト、ホーミングと生着受信者に移植細胞の潜在性は急性肝不全 (AHF) で基づく細胞療法の重要な基準です。
肝細胞の肝細胞様細胞5移植を調査、AHF が手術6か細胞移植薬理7手続、動物モデルで作成されます。薬理学的試薬、コンカナバリン A12、リポ多糖13, チオアセトアミド11四塩化炭素10アセトアミノフェン9d-ガラクトサミン8など多くの hepatotoxins によって AHF 動物モデルを作成するには、等.、使用されています。このリストからすべての試薬、AHF のユニークな一連の機能を生成しますが、単一試薬を人間 AHF 模倣ない残念なことに。また、hepatotoxins による AHF 慢性的なストレス下での動物を置く、長い時間がかかる、再現性のある結果が得にくい。
その一方で、肝部分切除 (PHx) の手術はスキル依存と再現性のある結果が必要なスキルを開発したら、入手しやすい。単独で外科的介入によって AHF を誘導して、肝臓の 70% 以上の切除が必要です。ただし、70% 肝切除は生着、増殖研究にまだ利用することができます未満は肝臓障害14中治療能力の分析の肝細胞を移植しました。肝細胞の移植は、腹膜15、16尾静脈、肝静脈17、または脾臓18を介して実行されるポスト肝切除をされています。現在、肝静脈注入と脾内移植肝細胞の最寄りの手順では、簡単に再現しています。
本稿でうなずきで 30% 部分肝切除のための手順を説明しました。SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス肝臓の左葉が切除されます。それは、人間の起源は、脾臓で NeoHep19と同様、20 万の GFP 発現マウス (C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30Scha/J) 肝細胞の移植が続きます。この手順は、肝臓移植細胞の生着につながります。この手順は、少なくとも侵襲的な少なくとも痛みを伴う方法です。

<table><tbody><tr><td>ガス麻酔システム</td><td>Ugo Basile;イタリア</td><td>211000</td><td></td></tr><tr><td>計量機Goldtech</td><td>;インド</td><td></td><td>現地調達</td></tr><tr><td>生物学的安全キャビネット(クラスI)</td><td>Kartosインターナショナル;&nbsp;インド</td><td></td><td>現地調達</td></tr><tr><td>ヘアトリマーパナソニック</td><td>;&nbsp;日本&nbsp;</td><td>ER-GY10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シャープ/シャープブレードメジャーサージカルズを備えたストレート操作ハサミ</td><td>。鋸</td>歯状の主要な外科用鋸歯を持つインドの<td></td><td>現地調達</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>。インド</td><td></td><td>現地調達</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー&nbsp;ストレート&カーブ&nbsp;</td><td>メルシャン;&nbsp;イングランド&nbsp;</td><td>BS-13-8</td><td></td></tr><tr><td>1mlインスリン注射器(30G付き) *5/16針&nbsp;</td><td>ディスポバン;インド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mlシリンジ、26G * 1/2針</td><td>BD;IT (英語)</td><td>参照番号 303060</td><td></td></tr><tr><td>ナイロン糸&nbsp;&nbsp;</td><td>強大;インド</td><td></td><td>(1-0) 現地調達</td></tr><tr><td>MERSUTURES 4-0 滅菌外科用針縫合</td><td>Ethicon, Johnson &ジョンソン、インド</td><td>NW 5047</td><td></td></tr><tr><td>TRUGUT 76 cm 4-0 吸収性外科用縫合</td>糸 <td>インド Pvt. Ltd;インド</td><td>SN 5048</td>滅菌<td>外科用針縫合糸Catgutクロミック</td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ピュアスワブPvt Ltd;&nbsp;インド</td><td></td><td>現地調達</td></tr><tr><td>外科用テープ3M</td><td>インド;インド</td><td>1530-1</td><td>Micropore Surgical Tape</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Histo-Line Laboratories, Italy</td><td>MRS3500</td><td></td></tr><tr><td>Shandon Cryotome E Cryostat</td><td>Thermo Electron Corporation ;米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>カールツァイス;ドイツ&nbsp;</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>明視野顕微鏡</td><td>オリンパス、日本</td><td>LX51</td><td></td></tr><tr><td>自動分析装置</td><td>チューリップ、アルト・サンタクルス、インド</td><td>スクリーンマースター 3000</td><td>肝臓機能検査用生化学分析装置</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD ;IT (英語)</td><td>BD FACSverse</td><td>移植後の細胞の存在の評価</td></tr><tr><td>Veet脱毛クリーム&nbsp;</td><td>レキットベンキーザー、インド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FORANE</td><td>アボット;米国</td><td></td><td>イソフルランUSP 99.9%&nbsp;</td></tr><tr><td>タクシー</td><td>アルケム;インド</td><td></td><td>セフォタキシムナトリウム注射</td></tr><tr><td>ポビドン-ヨウ素溶液&nbsp;</td><td>メディケアを勝ち取ります。&nbsp;インド</td><td></td><td>ベタジン</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Himedia;インド</td><td>GRM 3660</td><td></td></tr><tr><td>Iscoveの修正ダルベッコのミディアム(IMDM)</td><td>Life技術、サーモフィッシャー科学;US</td><td>12200-036</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>シグマ;US</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテック</td><td>サクラ;US</td><td>25608-930</td><td>OCTコンパウンドDAPI</td></tr><tr><td></td><td>ハイメディア;インド</td><td>MB 097</td><td></td></tr><tr><td>抗アルブミンヤギポリクローナル</td><td>サーモサイエンティフィック、ピアス、米国</td><td>PA126081</td><td></td></tr><tr><td>抗コネキシン32 / GJB1ポリクローナル</td><td>abcam、英国</td><td>ab64609-500</td><td></td></tr><tr><td>抗GFPウサギポリクローナル&nbsp;</td><td>サンタクルスのバイオテクノロジー;US</td><td>SC 8334</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594ロバ対ヤギ</td><td>&nbsp;分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック;&nbsp;US</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488ロバアンチシープ</td><td>&nbsp;分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック;&nbsp;米国</td><td>A11015</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルーア594チキンアンチウサギ</td><td>&nbsp;分子プローブ、サーモフィッシャーサイエンティフィック;&nbsp;US</td><td>A21442</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG HRP</td><td>Invitrogen、サーモフィッシャーサイエンティフィック;IT (英語)</td><td>65-6120</td><td></td></tr><tr><td>抗 Ki67 抗体</td><td>abcam、英国</td><td>ab15580</td><td></td></tr><tr><td>抗原アンマスキング ソリューション、クエン酸塩基</td><td>ベクター研究所、US</td><td>H-3300</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 退色防止封入剤</td><td>Life 技術、サーモフィッシャー科学;US</td><td>P36966</td><td></td></tr><tr><td>SGOT (ASAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SGPT (ALAT) KIT</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Phosphatase Kit (DEA)</td><td>Coral Clinical System, India</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin Solution, Mayer's</td><td>Sigma ;US</td><td>MHS16</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y溶液、アルコール</td><td>シグマ;米国</td><td>HT110132</td><td></td></tr><tr><td>DPXマウンタント&nbsp;</td><td>シグマ;US</td><td>6522</td><td></td></tr><tr><td>メロネックス(鎮痛剤)</td><td>Intas Pharmaceuticals Ltd;インド</td><td></td><td>メロキシカム注射&nbsp;</td></tr><tr><td>DAB強化液体基質システム四塩酸塩</td><td>シグマ;米国</td><td>D3939</td><td></td></tr></tbody></table>

うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。scid マウス

Intrasplenic Transplantation of Hepatocytes After Partial Hepatectomy in NOD.SCID Mice

肝切除は、肝再生と各種病態における細胞による治療の効果を研究する汎用性と再現性のある方法です。肝部分切除は加速新生血管と肝臓への細胞移行によってまた増加移植と移植細胞の増殖を促進します。ここでは、免疫不全のうなずきを組み合わせた非肥満糖尿病/重度の脾臓で 30% 肝切除や細胞移植を実行するための単純なプロトコルについて述べる.SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス。
この手順では、2 つの小さな切開が作られています。最初の切開を公開し, 肝左葉を切除、脾内移植細胞の脾臓を公開するもう一つの小さな切開を行った。この手順は、すべての専門的な手術のスキルを必要はありません、少ないストレスと痛み、高速回復、生存率と 5-7 分で完了することができます。マウス (トランスジェニック C57BL/6-Tg (UBC GFP) 30Scha/J)、として部分的肝切除会釈で人間の起源 (NeoHep) の細胞のような肝細胞を表現する緑色蛍光タンパク質 (GFP) から分離された肝細胞の移植を行った。SCID マウス。

30% 肝部分切除後の肝細胞増殖:細胞増殖マーカー、Ki 67 の染色 (IHC) を免疫組織化学によって 30% 肝切除後肝残りの肝細胞の増殖を調べた。1 日ポスト肝マウスを安楽死させ、残りの肝葉摘出、およびパラフィン切片が得られました。西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 共役二次抗体とラベリングに続いて、Ki 67 抗体染色しました。・ ディ ・ アミノ ベンジジン (軽打) は、染色の細胞を識別するために茶色の色の開発の HRP の基板として使用されました。核はヘマトキシリンで染色され、20 X 客観的顕微鏡下でカウンターだった肝部代表 IHC イメージを図 1に示します。約細胞 (13.66 ± 0.317、N = 3) の 13% が Ki 67 正、30% 肝切除マウスの肝臓で肝細胞の増殖が容易になることを確認します。
解剖学的研究:うなずくの肝臓の代表的なイメージ。SCID マウス、10 日ポスト肝切除は<strong class="xf...

ノドの部分肝切除 (PHx) と脾臓を介して細胞移植を実行するためのプロトコルを説明しました。SCID (うなずく。CB17-Prkdcscid/J) マウス。このプロトコルを公開し、脾細胞移植のための別の切開に続いて肝臓の左葉を切除する切開します。

うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。SCID マウス

Partial hepatectomy is a versatile and reproducible method to study liver regeneration and the effect of cell based therapeutics in various pathological ...

急性肝不全の患者の治療において、肝細胞移植は全肝移植に代わる選択肢となります。急性肝不全（AHF）のモデル作成の手法として、部分肝切除が用いられます。また、この手法は細胞ベースの治療における細胞の生着および増殖を調査するためにも利用されます。マウスは、こうした目的で肝切除術を行うための最も研究されているモデルの一つです。このビデオでは、部分肝切除術に続いて、NOD.SCIDマウスの脾臓に肝細胞を移植する手順を解説します。実験を開始する前に、適切な動物倫理委員会から実験実施に必要な承認を得ていることを確認してください。本手順では、2か所の小さな切開を行います。最初の切開は部分肝切除のためのもので、肝臓を露出させるため、剣状突起の直下に約1cmの切開を加えます。細胞を移植するために、動物の脾臓を露出させる目的で、左側腹部にさらに小さな切開を加えます。この手法の利点は、動物への外傷と痛みが軽減され、回復が早まり、生存率がほぼ100%になることです。さらに、この手順には専門的な外科的技術は必要なく、5分から7分という短時間で完了させることができます。このビデオでは、NeoHepと呼ばれる肝細胞様細胞およびトランスジェニックGFPマウスから単離した肝細胞を、部分肝切除を施したNOD.SCIDマウスに移植する方法を実演します。この手順は、移植する細胞の種類を限定しません。すべての手術器具およびPBSは、適切にオートクレーブ滅菌し、手術前に準備しておく。マウスの体重を測定する。本手順では、体重14〜18gの6〜8週齢のNOD.SCIDマウスを用いる。マウス腹部の中央、上部、および左側の部位を剃毛します。刈り取った毛を取り除くため、剃毛した領域に除毛クリームを塗布します。4〜5分間待機した後、優しく毛を取り除きます。酸素シリンダーのバルブを開きます。マウスをイソフルランチャンバーに入れます。酸素流量を4 L/minに調整します。麻酔導入のため、イソフルランの気化濃度を4%に調整します。足指を軽くつまみ、マウスが適切に麻酔状態にあることを確認してください。バイオセーフティキャビネット内に手術ボードを設置します。マウスの腹側が上になり、頭部の前方部分がイソフルランおよび酸素供給源に接続されたノーズコーン内に入るように、動物を手術ボード上に配置します。麻酔を維持するため、イソフルランの気化量を2%まで下げます。70%エタノールに浸した滅菌綿で拭き、皮膚を消毒します。胸骨の下、剣状突起に対して垂直かつ肋骨に平行な位置の皮膚に、約1cmの横切開を加えます。切開部の皮膚と腹膜を慎重に分離します。剣状突起の直下で腹膜層を横方向に切開し、肝臓の左葉を露出させます。湿らせた綿棒を2本用意します。1本の綿棒を切開部の腹側に、もう1本の綿棒を横隔膜側に配置します。次に、横隔膜側に配置した綿棒の先端を軽く押し、もう一方の綿棒で滑らせるように押して、肝臓の左葉を持ち上げます。マイクロ解剖用ピンセットを用いて、肝門に近い左外葉の基部に絹糸のループをかけます。結び目を軽く締めた後、絹糸を肝葉の基部まで可能な限りスライドさせます。結び目をしっかりと締め、反対側にさらに2つの結び目を作ります。マイクロサージェリー用剪刀を用いて、結紮した葉を切除します。この画像は、切除後の左葉の残存部を示しています。4-0 Catgut吸収性縫合糸を用いて、腹膜を連続縫合で縫い合わせます。同様の4-0キャットガット吸収性縫合糸を用い、断続縫合または結節縫合で皮膚を閉鎖します。縫合部位の周辺にベタジンを塗布します。肝細胞またはNeoHepを50 µLのIMDMに懸濁させ、29G針を装着した1 mLインスリン用注射器に準備した状態で保持します。マウスの左側面が上を向くように配置します。脾臓領域を確認し、皮膚を横方向に切開します。腹膜層を2〜3 mm切開し、脾臓を露出させます。脾臓を2本の湿らせた綿棒で挟み、そっと持ち上げます。針を脾臓皮質にゆっくりと刺し、細胞懸濁液を脾臓内に注入します。4-0縫合糸を用いて腹膜を連続縫合で閉鎖し、皮膚を結節縫合で閉鎖します。縫合部にベタディンを塗布します。12 mgの抗生物質Cefotaximeを含む100 µLの生理食塩水を腹腔内に注射します。12 µgの鎮痛剤Meloxicamを含む100 µLの生理食塩水を腹腔内に注射します。これを術後3日間にわたり毎日投与します。イソフルラン気化器を閉じ、マウスをケージに入れます。動物は数秒以内に意識を取り戻します。30%肝切除術から24時間後の肝臓における肝細胞の増殖を、細胞増殖マーカーであるKi-67を用いた肝切片の免疫組織化学染色により検討した。これらの切片を染色した後、検出のために抗Ki-67ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体を使用し、基質としてジアミノベンジジンを用いて褐色に発色させた。核はヘマトキシリンで対比染色した。この画像において、茶色く染まった細胞はKi-67陽性の増殖性肝細胞です。移植から10日後にマウスを安楽死させ、肝臓を検査しました。ここでは代表的な画像を示しています。再生肝から右側葉、右内葉、および左内葉を摘出し、5 µmの切片を作製した。これらの切片を、一次抗体としてウサギ抗GFPポリクローナル抗体を、二次抗体として抗ウサギAlexa Fluor 594抗体を用いて染色した。核はDAPIで対比染色した。この画像は、赤色で可視化された緑色蛍光タンパク質を発現する肝細胞のホーミングを示しています。NeoHepと呼ばれるヒト由来の肝細胞様細胞を移植したところ、肝切除を行ったレシピエントマウスの肝切片において、ヒトAlbuminおよびヒトConnexin 32の発現が観察されました。術後10日目の血清中肝分泌酵素の生化学的分析により、aspartate aminotransferase、alanine amintransferase、およびalkaline phosphataseのレベルが正常に回復したことが確認されました。同様に、ヘマトキシリン・エオジン染色による肝切片の組織学的検査では、術後10日目に異常は認められず、肝臓が適切に回復していることが示されました。いくつかの注意点を守ることが重要です。ナイロン糸の結び目は、肝葉の基部に配置するようにしてください。反対側にもさらに2つのきつい結び目を作ることを忘れず、糸の極めて近くを切ろうとしないでください。脾臓への細胞移植の際は、針を完全に垂直に刺し、深さが2 mmを超えないようにしてください。皮膚の閉鎖には、皮膚ステープラーの使用を避けてください。代わりに、4-0縫合糸で閉鎖します。創傷クリップはマウスの自然な動きを制限し、また、すぐに緩んで脱落することが多いためです。動物をケージに戻した後、滅菌したコーンフレークを数片ケージに入れ、5%グルコースを含む滅菌水を与えます。動物手術の経験がない場合は、まず正常な免疫能を有するマウスを用いて、部分肝切除術と移植術を個別に練習し、その後、1匹の動物で両方の処置を行ってください。免疫不全のNOD.SCIDマウスでの処置は、免疫能を有するマウスで生存率100%を達成した後にのみ実施してください。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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確立された脱髄とマウスの脊髄にマウス神経幹細胞（NSC）の移植が詳述されます。...

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免疫不全マウスにおけるヒト腫瘍の異種移植は、癌の生物学を研究するための貴重なツールです。ヒト肝細胞癌細胞または腫瘍断片の皮下および肝臓内異種移植片を生成するための特定のプロトコルが記載されている。レシピエントマウスにおいて、部分肝切除により誘発される肝臓再生は、肝移植を容易にするための戦略として提示される。...

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マウスにおける肝部分切除後の再生肝細胞の単離

このプロトコルでは、マウスにおける同所性肝移植(OLT)の成功モデルの実装について説明します。さらに、マウスでOLTが成功した後の同種移植片の開存性をさらに分析するためのアジュバントについても、特にマイクロコンピューター断層撮影(microCT)スキャンを利用して説明します。...

マイクロコンピュータ断層撮影血管造影を用いたマウスの同所性肝移植の成功

部分的な2/3(66%)肝切除術のマウスモデルは文献でよく説明されていますが、肝移植後のスモールフォーサイズ症候群を模倣したより広範な肝切除術はほとんど使用されていません。マウスモデルにおける拡張78%肝切除術手順について説明し、健康なマウスで術後致死率が約50%になります。...

マウス手術モデルにおける拡張78%肝切除術

学ぶ肝切除後の脾内肝細胞移植法。NOD.SCIDマウスを用いて部分肝切除と細胞移植の手技を解説し、急性肝不全治療における細胞治療の応用可能性を示します。

うなずくにおける肝切除後肝脾内移植。SCID マウス

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