Name: 人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学ぶ マントル細胞リンパ腫の異種移植マウスモデル構築法。患者由来細胞を用いてヒトリンパ腫細胞の薬剤効果をin vivoで評価し、血液腫瘍学における治療戦略開発に貢献します。

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この作品はリーグ Genevoise contre le 癌によって支えられた財団博士デュボワ Ferriere ディヌ ・ リパッティ、OCS-02260-08-2008、2914-02-2012 KPS OCS Oncosuisse スイス国立科学財団・ グラント 31003A_156760 および 310030 153456。

ヒトの血液サンプルは、ローカル倫理とジュネーブ大学病院の人体実験委員会によって承認された手続きに従って使用されました。
動物の手術は、機関倫理委員会動物ケアのジュネーブ、スイス連邦共和国のカントンの獣医のオフィスに従って (承認番号: GE/26/15)。
1. 主な末梢血単核球 (PBMCs) 密度勾配分離の準備
注: 3-5 mL 末梢血は白血病段階で MCL を呈する患者から得られました。診断は、染色体転座 t(11;14) の存在とサイクリン D1 の発現によってその後確認およびフローサイトメトリー (CD5 +、CD23−、CD200 +、単クローン性 B 細胞人口) の標準的な診断基準によると設立されました。すべてのケースで単クローン性 B 細胞を構成する > 合計 B 細胞の人口の 90%。残りのセルは、単球および T 細胞に主にいた。
<ol><li>ロズウェル パーク記念研究所メディア 1640 (RPMI) (図 1 a) の 5 mL と MCL 血液サンプルの (1:1) 5 mL を希釈します。</li>
	<li>徹底的な混合を使用する前に数回の密度勾配メディア (資材表) を反転します。</li>
	<li>ピペット吸引を使用して 15 mL 遠心管に 5 mL の密度勾配のメディアを追加します。</li>
	<li>軽くアスピレーター (血液密度勾配メディア比を 2:1、例えば、10 mL を密度勾配メディアの 5 mL の血液のはず) を使用して 15 mL 遠心管の密度勾配メディアの希釈血液サンプルをレイヤーします。(図 1 b、C) 2 つのレイヤーを混在させるに注意をすべき。</li>
	<li>室温で 40 分間 400 x g でサンプルを遠心分離機、遠心ブレーキがオフになっています。</li>
	<li>中間層 (白っぽい、薄いリング (図 1, E) の矢印でマーク) を優しく吸引滅菌パスツール ピペットを使用して単核細胞を含む、クリーン チューブにそれらを転送します。</li>
	<li>単核細胞の洗浄<ol>
<li>転送細胞懸濁液の容積を推定し、それに追加 1% ウシ血清アルブミン (BSA) とリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 滅菌 1 の 3 つの容積。</li>
		<li>上下に数回ピペッティングによる懸濁液を混ぜます。</li>
		<li>室温で 10-15 分のための 400-500 × g の懸濁液を遠心します。</li>
		<li>細胞ペレットを取得、洗浄ステップを繰り返しますして上澄みを廃棄します。</li>
		<li>上澄みを除去し、希望の音量、例えば、1 または 2 mL の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>自動化された細胞カウンターまたは検定 (商工会議所 · ノイバウアー) を使用して手動でセルの数をカウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. B 細胞の負の淘汰による B 細胞の濃縮
<ol><li>最終濃度 50 x 106セル/mL の PBS のセルを希釈します。</li>
	<li>セルを下部ポリスチレン チューブ ラウンド 5 mL に転送します。細胞懸濁液 2 mL に B 細胞濃縮キットから抗体カクテルの 100 μ L を追加し、(図 2-1) 上下ピペットで穏やかに混合します。</li>
	<li>10 分間室温でセルを孵化させなさい。</li>
	<li>簡単に渦磁性粒子を提供 B 細胞濃縮キット 30 s (図 2-2)。サンプル 2 mL に磁性粒子の 150 μ L を追加します。</li>
	<li>室温で 5 分間別サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>1x PBS 2% 牛胎児血清 (FCS) と 1 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を含むと、2.5 mL にサンプル ボリュームをもたらします。磁石でチューブを置き、別の 3-5 分 (図 2-3) のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>管場所で、1 つの連続的な動きとマグネット ピックアップ、チューブをデカントした新鮮な管 (図 2-4) で濃縮細胞懸濁液を収集します。自動化された細胞カウンターまたは B 細胞の総収率を取得する診断を使用して手動でのセルをカウントします。 注: 通常、利回りは通常 B 細胞と MCL の 10 の6セル/mL x 5-50 〜 105 B 細胞/ml です。</li>
	<li>豊かな B 細胞の純度を確認します。<ol>
<li>取る ~ 50,000 細胞 CD19/抗 CD20 抗体で細胞をインキュベートし、(1:20 希釈) 異なる蛍光色素と結合した抗 CD45 抗体と (1:10 希釈) 15-30 分の室温で。</li>
		<li>1 × PBS + 1 %bsa の 1 mL で洗い、400-500 × g で 5 分で細胞を遠心し、〜 200 μ L の PBS で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>フローサイトメトリーによる細胞サンプルを取得し、B 細胞の純度の分析します。純度はほとんど > 90% このメソッド (図 3)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 異種移植腫瘍モデルマウスの開発
<ol><li>1 × PBS (マウスあたりを注入するために必要なボリューム) の 150-200 μ L の 10 の6セル × 40 〜 60 を中断します。</li>
	<li>細胞懸濁液の 150 μ L を静脈内注射 (静注) 6-7 週齢 (図 4 a) 性別に関わらずうなずいて scid ガンマ (NSG) マウスのそれぞれの尾静脈に。</li>
	<li>〜 10 週間の人間のリンパ腫を開発するマウスを許可します。 注: プライマリ ヒトリンパ腫細胞人間のリンパ腫細胞株 (~ 3 週間) と比較して腫瘍を開発する時間がかかります。</li>
	<li>動物は、減量のような致命的な病気の症状を表示する開始、波立たせられた髪、活性低下、後肢麻痺、等、犠牲によって CO2窒息心臓心臓穿刺血を取得に続いてにマウス。</li>
	<li>収集さまざまな器官マウスの解剖によって骨髄、脾臓と肝臓のように、腫瘍生着分析のための犠牲の時に心臓から血液を描画することによって末梢血を収集 (図 4 b -F)。</li>
</ol>4. 腫瘍細胞がさまざまな臓器の中にしみ込んでキメリズム解析
<ol><li>さまざまな器官を収集した後、次の赤血球 (RBC) 換散血、骨髄、脾臓の 500 μ L と肝臓の 2 mL の塩化アンモニウム カリウム バッファー x 1 の 200 μ L を使用して単一細胞懸濁液を生成する機械の破壊によってそれらを処理します。.</li>
	<li>カウントし、ヒト B 細胞抗体すなわち抗 CD19、抗 CD20、抗 CD45 の細胞を染色します。 注: NSG マウスの B 細胞を欠いている、したがって分析のため細胞はヒトの特定の B 細胞マーカーとステンド グラスします。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる各器官由来 B 細胞 (cd19、cd20、CD45 +) のゲートによって細胞を分析します。</li>
	<li>4.3 (図 4) の手順で示されているように、ゲートのセルに基づいて MCL 注入マウスから派生したさまざまな器官に明らかな移植腫瘍細胞を定量化します。 注: 詳細については材料の表を参照してください。</li>
</ol>

<ol><li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chemokines%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li>
<li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+and+leukocyte+traffic%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li>
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<li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mantle+cell+lymphoma%3A+diagnostic+criteria%2C+clinical+aspects+and+therapeutic+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li>
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<li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li>
<li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans%3A+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li>
<li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li>
<li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li>
<li>Doñate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27256571">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

臨床試験、医薬品開発の先進的な段階で、創には使用できません。初期段階の薬をテストするためにひと細胞の異種移植の受信者を動物を開発する努力を追求されている長い間。人間拒絶反応を回避し、MCL など、人間の病気のためのモデルを確立することができます動物のモデルをご紹介します。これは現時点ではひと腫瘍生着と腫瘍成長のメカニズムを研究する最先端の異種移植モデルです。ここで我々 は NSG マウス リンパ腫の移植のより大きい成功を達成するためにこれまで最も免疫欠損マウス モデルの 1 つを使用します。NSG のマウスは、成熟 T 細胞、B 細胞、NK 細胞に欠けています。また、サイトカイン シグナル伝達に障害がある、先天性免疫不全であります。
密度勾配によってプライマリ MCL サンプルからのリンパ球の準備は、赤色の血液細胞と血小板のような他の細胞型を削除する重要なステップです。伝統的に、密度勾配遠心法では、リンパ球の分離を成功させることができます。これらリンパ球 B 細胞集団を豊かにするためのさらなる処理は、本稿に記載されているプロトコルに従う B 細胞濃縮キットの使用によって達成されます...

自然にリンパ球が免疫監視に大きな役割を果たすし、抗原特異免疫1,2をマウントの重要なステップは、リンパ球が人身売買します。このプロセスには、血流に胸腺から、二次リンパ器官、リンパ節、パイエル板、脾臓など同種抗原を満たす彼らそこからナイーブ T リンパ球の移行が含まれます。B リンパ球は骨髄で分化し、二次リンパ器官3包にナイーブ細胞として移行します。これらの B 細胞の一部は受容器の抗原をバインドし、特定の T 細胞によってアクティブ化されます。これらの B 細胞の増殖と分化は、卵胞のマントル層に非活性化、ナイーブ B 細胞をプッシュします。活性化細胞が、パトロール、体や免疫グロブリン分泌形質細胞骨髄4に移行するに成熟細胞のメモリ B に分化します。
MCL は、マントル層でナイーブ B リンパ球が腫瘍に変換するときに発生します。これらのリンパ腫細胞は、リンパ器官の微小環境に存在し、特定の T リンパ球のコントロールとは独立して増殖します。ただし、密度のある特定の段階で彼らはこのニッチから脱出し、他の臓器でのニッチを求めて血流に循環させます。接着分子の複雑さとケモカインとその受容体の混乱を考えるこの細胞人身売買体内のメカニズムはよくわかっていない、したがって治療を妨げます。新しい微小に達することからリンパ腫 B 細胞を防ぐためには、この移行プロセスを効果的にブロックする手法が必要です。
MCL は、B 細胞の悪性腫瘍を治療するために最も困難の一つです。MCL の腫瘍の表現型の開発は、ユニークな生物学的特性の獲得によって特徴付けられる多段カスケードの結果です。診断時に、ほとんどの患者 (70%) 既に存在脾臓、骨髄、および/または消化管5,6舌癌の関与を示す場合の大半の播種性疾患。にもかかわらず、従来の化学療法短期7,8で高い寛解率を誘導する治療を受けた患者の耐性腫瘍によって数年以内の再発は、一般的です。MCL の普及とその基盤となる生物学の理解を助けることができる新しい疾患モデルの紹介: 我々 は患者の腫瘍細胞に由来するひと MCL 異種移植マウス モデルを確立します。我々 は、このモデルは MCL 普及に対する治療戦略を開発し、おそらく再発患者の最適な診断と治療の新しい臨床的視点を提供を助けることを望みます。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-paque 培地</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>単核細胞の分離用</td></tr><tr><td>RPMI 培地 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>血液サンプルの希釈用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>細胞の洗浄</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>単離中の細胞洗浄に使用される1% BSAを含むPBSの調製用</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>ベックマン・コールター</td><td>B49212</td><td>ヒトpan-B細胞マーカー</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A21693</td><td>ヒトpan-B細胞マーカー</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>ベックマン・コールター</td><td>IM3607</td><td>ヒトpan-B細胞マーカー</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>ベックマン・コールターPN</td><td>A70203</td><td>ヒトT細胞マーカー</td></tr><tr><td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>細胞表面タンパク質 MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>汎白血球マーカー</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>細胞表面タンパク質 MCL</td></tr><tr><td>NOD scid γ (NSG) マウス</td>には典型的には存在しない <td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>この研究では</td></tr> <tr><td>MCL 異種移植片の開発に使用Easy sep ヒトB細胞濃縮キット</td><td>幹細胞技術</td><td>19054</td><td>B細胞を濃縮し、マウスに注入するための純粋な細胞を得る</td></tr><tr><td>FACS</td><td>ベックマン・コールター</td><td>・ナビオス</td><td>MCLサンプルの特性評価とMCL生着のための臓器の研究に使用</td></tr><tr><td>1X塩化アンモニウムカリウム緩衝液</td><td></td><td></td><td>赤血球溶解緩衝液(NH4Cl 8,024 mg/l;KHCO3 1,001 mg/l;EDTAです。Na2&middot;2H2O 3.722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウス モデルにおける腫瘍生着

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

B リンパ球は主に家に免疫細胞の循環と彼らのキー ・ プレイヤー、リンパ器官に存在します。正常 B 細胞は、T リンパ球が刺激されるときのみ増殖、発癌性 B 細胞生き残るため、未定義のオルガンのニッチの自律的展開します。マントル細胞リンパ腫 (MCL) はそのような 1 つの B 細胞障害患者の生存率が 4-5 年。これは効果的なメカニズムが、ホーミングとこれらの細胞の生着は生存率を高めるためにブロックの必要性と患者の長寿のために呼び出します。したがって、体内ホーミング機構ブロックによる MCL 治療の有効性を検討する異種移植マウス モデルを開発するための努力は非常に重要です。ひと細胞の異種移植の初期段階の薬をテストするための受信者動物の開発は長い間、関連するマウスの前臨床モデルに欠かせない画面の新しい治療薬として追求されています。この動物モデルの開発人間の移植片拒絶反応を回避し、ひと疾患モデルの確立し、の候補薬の臨床テストを実行する別のリンパ腫型の病気の進行を研究する非常に便利なツールがあります。造血器腫瘍、MCL のよう。私たちは研究し、MCL の新規治療法を開発するための優秀な資源となる異種移植マウス モデルを確立しました。

原稿では、MCL 細胞の生着の異種移植腫瘍モデルマウスの開発に成功のための最適化されたプロトコルについて説明します。(このケース MCL 細胞で)、純粋な細胞集団の準備は成功した MCL 異種移植片を開発する非常に重要です。図 1は、密度勾配分離法による MCL 患者の血液から単核のセル隔離のため分取の手順を表します。単核細胞は、さらに否定的な B 細胞濃縮キットを使用して、マウスへの異種移植注入のために純粋なセル人口を取得する純粋な B 細胞を取得する処理します。成功した MCL 生着するために最大純度を取得するには、注意が必要です。このメソッドを使用して得られる純度は通常 > 90%。残りのセルは、単球および T 細胞 (データは示されていない) に多かった。
図 2は、メソッドのセクションで説明したように B 細胞の浄化のプロト...

マントル細胞リンパ腫 (MCL) は B 細胞の障害を治療することは困難と同様に研究および治療法を開発するプライマリ MCL の異種移植マウス モデルを確立することは困難です。ここでは、その基盤となる生物学を理解するためにマウスの MCL を異種移植片の成功確立について述べる。

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

この手法の全体的な目的は、マントル細胞リンパ腫のゼノグラフトマウスモデルを構築し、この疾患の治療戦略を開発することです。本手法は、さまざまな治療戦略の治療成績など、血液腫瘍学分野における重要な課題の解決に寄与します。この技術の主な利点は、ヒトリンパ腫細胞に対する薬物の効果をin vivoで検討できる点にあります。この手法の意義は、マントル細胞リンパ腫の治療へと広がります。なぜなら、このモデルを用いることで、患者由来細胞に対する治療の効果を研究することが可能であるだけでなく、簡便に行えるためです。この方法はマントル細胞リンパ腫の治療的側面に洞察を与えるだけでなく、他の種類のリンパ腫の研究にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな者は、患者由来異種移植片（PDX）の入手が困難であるため、苦労することになります。私たちは、生体内におけるB細胞の遊走、および一部の治療法がこのプロセスに及ぼす影響を研究したいと考え、本手法を考案しました。マントル細胞リンパ腫の血液サンプル12 mLを、同 volumes のRPMI 1640 Mediumで希釈します。次に、密度勾配用培地を使用する前に、数回反転混和させます。50 mL遠心チューブに密度勾配培地を15 mL分注します。アスピレーターを用いて、希釈した血液サンプルを密度勾配培地の上に、2つの層が混ざらないように注意深くゆっくりと添加します。次に、ブレーキをオフにし、室温で400g、40分間、血液サンプルを遠心分離します。滅菌パステールピペットを使用して、中間層から単核血液細胞を吸引し、清潔なチューブに移します。単核細胞を洗浄するため、細胞懸濁液の推定量に対して3倍量の1%ウシ胎児血清含有滅菌1倍濃度リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を加えます。適切に混合するため、細胞懸濁液を数回ピペッティングします。次に、サンプルを室温で400-500g、10-15分間遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、1%牛血清アルブミンを含む1倍濃度のリン酸緩衝生理食塩水で細胞ペレットを洗浄します。その後、サンプルを遠心分離します。次に、上清を捨て、1または2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate Buffered Saline）で細胞を再懸濁します。その後、自動細胞カウンターを用いて細胞数を計測します。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で希釈し、5 mLポリスチレンチューブに分注して、細胞懸濁液に100 µLの抗体カクテルを加えます。適切に混合するため、細胞懸濁液をピペッティングで数回穏やかに混ぜ合わせます。その後、ラミナーフローフード内で細胞を室温で10分間インキュベートします。その間に、B細胞濃縮キットに含まれる磁気粒子を30秒間ボルテックスします。次に、2 mLの細胞懸濁液に150 µLの磁性粒子を加えます。細胞と磁性粒子の混合物を室温で5分間インキュベートします。サンプル量を2.5 mLに調整し、チューブをマグネットに設置して、さらに3〜5分間インキュベートします。インキュベーション後、磁石に取り付けられたチューブから新しいチューブへ、一度の連続した動作で細胞懸濁液をデカントします。次に、自動細胞カウンターを使用して、懸濁液中のB細胞の総収量をカウントします。濃縮したB細胞の純度を確認するために、約50,000個の細胞を、異なる蛍光色素が結合したanti-CD19、CD20、およびanti-CD45抗体とともに、室温で15～30分間インキュベートします。次に、1xのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）および1%ウシ血清アルブミンで細胞を1 mL洗浄します。室温で400-500g、5分間、細胞を遠心分離します。遠心分離後、上清を捨て、ペレットを200 µLのリン酸緩衝生理食塩水で再懸濁します。フローサイトメトリーを用いてB細胞の純度を分析します。この方法を用いると、通常は90%以上の純度が得られます。細胞を150 µLの1倍濃度リン酸緩衝生理食塩水に懸濁させます。その後、性別を問わず、生後6〜7週齢のマウスの尾静脈に細胞懸濁液を静脈内注射します。成功した生着を確実にするためには、患者由来の血液から単離したリンパ腫細胞をマウスの尾静脈に静脈内投与することが極めて重要です。二酸化炭素チャンバー内でマウスを安楽死させた後、各臓器を採取します。次に、シリンジプランジャーの背面を用いて70 µmフィルター上で臓器を機械的に破砕し、単一細胞懸濁液を作成します。血液以外のすべてのサンプルを400から500gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。血液、骨髄、脾臓、および肝細胞の溶解には、1倍濃度の塩化アンモニウム-カリウム緩衝液を使用してください。フローサイトメーターにかける前に、マウスから単離した臓器由来の細胞をろ過して単一細胞懸濁液にすることは、装置の詰まりを防ぐために重要です。抗CD19、CD20、およびCD45などのB細胞特異的抗体を用いて細胞を染色します。フローサイトメトリーによる解析の結果、各臓器由来のB細胞はCD19陽性、CD20陽性、およびCD45陽性であることが示されました。ゲート内細胞に基づき、マントル細胞リンパ腫を注入したマウスから得られた臓器特異的な腫瘍細胞および移植腫瘍細胞を定量します。本研究では、マントル細胞リンパ腫における濃縮前後のB細胞の純度を調べるために、フローサイトメトリーを実施します。単核マントル細胞リンパ腫を特性解析するため、CD45、CD19、CD5、CD200、CD20、KappaおよびLambdaなどのB細胞特異的マーカーを使用します。フローサイトメトリー分析により、CD45、CD19、CD20、およびCD5に陽性反応を示す細胞が確認されます。そして、これらがキャラクタリゼーションのために選択されます。CD23およびCD200で染色されなかった細胞も同様に選択されます。臓器特異的な生着度は、臓器をさらにフローサイトメトリーで処理し、B細胞を分析することで検討します。ここでは、脾臓、骨髄、肝臓などの臓器を用いた2名の患者から得られた生着パターンの比較図を示しています。この手法を習得すれば、3週間以内に実施することが可能です。この処置を行う際は、異種移植に使用するPBMCを濃縮させること、また、毛並みの乱れ、背中の丸まり、後肢麻痺、体重減少などの疾患の重要な兆候がないか、マウスを定期的に観察することが重要です。本手順に従うことで、異種移植を他の種類のリンパ腫に適用でき、例えば個別化医療の実現に寄与することが可能です。本手法の開発により、血液腫瘍学分野の他の研究者が、免疫不全NOD/SCIDマウスにおいて患者由来のマントル細胞リンパ腫を確立する方法を模索する道が開かれると考えられます。本ビデオを視聴することで、患者由来のPBMCを精製し、それを免疫不全マウスに異種移植して治療戦略を理解するための手法を十分に習得できるはずです。ヒトの一次血液サンプルを扱う作業は極めて危険である可能性があるため、これらの手順を行う際は、常に手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

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ヒト末梢血単核細胞(PBMC)移植型ヒト型異物移植モデル翻訳免疫腫瘍学(I-O)研究

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胃癌患者由来異種移植片モデルおよび原発細胞株の確立

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免疫不全マウスにおける肝直交細胞性ヒトうveal黒色腫異種移植プラットフォームの生成

ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。...

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

本プロトコルは、非肥満糖尿病(NOD)-scidインターロイキン-2ガンマ鎖受容体(NSG)マウスにヒト皮膚を移植する方法を記載している。移植のためのヒト皮膚の準備、移植のためのマウスの準備、分割厚さのヒト皮膚の移植、および移植後の回復手順の詳細な説明がレポートに含まれています。...

in vivoでヒト免疫応答を操作するための異種移植片皮膚モデル

学ぶ マントル細胞リンパ腫の異種移植マウスモデル構築法。患者由来細胞を用いてヒトリンパ腫細胞の薬剤効果をin vivoで評価し、血液腫瘍学における治療戦略開発に貢献します。

人間マントル細胞リンパ腫の異種移植マウスモデルにおける腫瘍生着

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