Name: 患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 学ぶ、クロモジェニック免疫組織化学とImageJを用いて膠芽細胞腫患者切除組織の腫瘍微小環境構成要素を定量的に同定する方法。細胞比率の決定と標的治療開発への貢献が可能です。

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著者らはDrs。 Fahad BafakihとJim Mandellによる患者サンプルの取得と同定、Garrett F. Beeghlyの免疫組織化学補助、Biorepository and Tissue Research Facility、心血管研究センターHistology Core、およびバージニア大学のBiomolecular Analysis Facility試料採取、免疫組織化学、および画像化が含まれる。

このプロトコルは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプル中の細胞成分を同定する。パラフィン包埋により、細胞形態および組織形態の最良の維持が可能になるばかりでなく、切片の長寿命が向上する。この分析に用いたサンプルは、University of Virginia Biorepository and Tissue Research Facilityを介してアクセスしました。患者サンプルは、2010年から2013年の間にバージニア大学で腫瘍切除術を完了したグリア芽細胞腫（星状細胞腫、WHOグレードIV）の確定診断に基づいて神経病理学者によって選択され、この分析の前に同定解除された11 。 FFPEサンプル脱パラフィンおよび再水和注：プロトコルのこの部分は、FFPEサンプルに固有です。パラフィン包埋されたサンプルは、細胞およびtの保存のために、この分析のためにより有用であり得るが形態解析を行う場合、この解析はフリーズしたセクションでも行うことができます。凍結切片を使用する場合は、この部分を省略して、発色免疫組織化学に直接進むことができる。 <ol><li>キシレン、キシレン、100％エタノール、100％エタノール、95％エタノール、95％エタノール、70％エタノール、脱イオン水、脱イオン水</li></ol>抗原検索注：プロトコールのこの部分は、FFPEサンプルのホルマリン固定中に形成されたメチレン架橋を破壊し、抗体が結合する抗原部位を露出させるために必要である。 <ol><li>トリスをベースとする高pH抗原非マスキング溶液を蒸留水中の製造業者推奨で希釈する。 </li><li>マイクロウェーブを用いて熱媒介抗原回収を行う。他の形態の熱媒介回収（圧力鍋、野菜蒸し器、または沸騰水など）でも十分である。 <ol><li>希釈されたマスク除去溶液を密封されていない電子レンジに加える容器。スライドを容器に入れる。スライドを電子レンジに置きます。 </li><li>高出力で20分間沸騰させる。蒸発のための液体レベルをモニターし、必要に応じて蒸留水を補充します。 </li></ol></li><li>試料を室温で1時間溶液中で冷却させる。 </li></ol> 3.発色免疫組織化学<ol><li>サンプルをカバーするために必要な試薬の量を最小限にするために、疎水性ペンで組織サンプルを輪郭を描きます。 注：組織サンプルを水和させた状態に保ち、染色効果に影響するため乾燥させないでください。 </li><li>組織サンプル（典型的には約100〜200μL）を覆うのに十分な透過性溶液（トリス緩衝化生理食塩水（TBS）+ 0.01％Triton-X）をピペットで加える。 </li><li>溶液を除去して廃棄し、ステップ3.2を繰り返す。 </li><li>ブロッキング溶液（2.5％ウマ血清+透過液）で室温でサンプルをインキュベートする。 </li><li>サンプルを4℃で一晩インキュベートし、一次抗体を希釈ブロッキング溶液中でインキュベートする。 注：ここで使用したすべての一次抗体は1：200で希釈しますが、製造業者の推奨事項から始めて連続希釈を使用して最適希釈を決定することができます。このプロトコールで使用される抗体の詳細な情報は、以前に公開された11 。 </li><li>最初の抗体宿主動物に対応する西洋ワサビペルオキシダーゼポリマー試薬を使用して、製造元のプロトコルに従って、一次抗体を検出する。 </li><li>組織試料を覆い、5分間インキュベートするのに十分な透過性溶液をピペットで加える。 </li><li>溶液を除去して廃棄し、ステップ3.7を繰り返す。 </li><li>スライドを1x TBS中の0.3％H 2 O 2中で15分間インキュベートする。 </li><li>所望の染色強度が得られるまで、ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて2〜10分間サンプルを展開する。 </li><li>サンプルを対比染色し、ヘマトキシリンなどの細胞核を、製造業者のプロトコルに従って同定する。 </li><li>サンプルを100％脱水し、エタノールおよびキシレン。 </li><li>サンプルをマウントメディアで恒久的にマウントします。 </li></ol> 4.関心領域<ol><li>高解像度画像が可能な明視野顕微鏡下の画像スライド。 注：イメージングセルラーコンポーネントは、最低20倍の解像度で使用してください。 </li><li>組織サンプル全体の関心領域にカメラを移動します。 </li><li>定量化のために画像をTIFFファイルとして保存します。 </li></ol> 5.画像解析<ol><li>カバレッジ率の定量化のためImageJで画像を開きます。 </li><li>ヘマトキシリン染色された核から紫色を除去するには、Threshold Colorプラグインを使用します。 </li><li>画像を8ビットに変換します。 </li><li>暗い背景なしでしきい値を追加します。 </li><li> 17個の予めロードされたImageJ閾値フィルタ（ すなわち MaxEntropy）の1つを使用して画像を処理し、DAB染色部分のみが閾値に含まれるようにする。 注：minimizの最適な事前ロードされたしきい値フィルタを選択してくださいバックグラウンド染色の包含。これは、抗体の染色性および特異性に依存し得る。各患者サンプル内のすべての技術的複製に同じ閾値を使用する。 </li><li>しきい値を適用します。 </li><li>閾値処理された画像の面積％を測定する。 </li><li>各サンプル内の複数の領域の平均カバレッジ面積。 </li></ol>

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</ol>

ここで提案された我々の方法は、伝統的な発色免疫組織化学を用いて染色された組織学的試料を分析する定量的アプローチである。このタイプの分析のための現在の方法論には、同様の染色プロトコール、続いて独立した病理学者による採点が含まれる。この方法は信頼性がありましたが、多くのアプリケーションでは、腫瘍に関連する異種性のより良い理解やin vitro研究のための腫瘍の正確な再現など、細胞構成のより正確な理解が必要です。 このプロトコルは、脳腫瘍微小環境内のグリア細胞の集団を定量的に分析するための直接的な技術を実証する。この技術は広く適応可能であり、血管、ケモカインなどの微小環境の他の多くの成分、ならびに乳房または膵臓のような他の癌を同定するために拡大することができ、腫瘍切除術ではより大きい実質領域。さらに、この技術は、細胞の形状、さらにより複雑な形態学的結果等方性、クラスター化、方向付けなどを評価するために、細胞のカウントおよび細胞周囲などの他の測定値を取得するために適合させることができる。これらの技術はまた、癌に限定されるものではない、という点で、これらの染色および定量化の方法論は、任意の脳...

神経膠芽腫（GBM）、最も一般的な悪性脳腫瘍は、周囲の健康な脳実質1,2に原発腫瘍塊から高度に拡散侵入によって特徴付けられます。この拡散侵入は完全に切除する腫瘍は特に難しくなり、治療後のまま侵入癌細胞は避けられない再発2、3、4のための最も一般的な理由です。以前、我々は、しかし、少しはGBM浸潤に貢献する複雑なメカニズムについて知られている、5治療上有益であることがびまん性神経膠腫細胞の浸潤を阻害することが分かりました。腫瘍微小環境、または癌を取り囲む組織は、複数の癌6,7における腫瘍の進行に関与しています。グリア芽腫腫瘍の微小環境、p星状細胞、ミクログリアおよび希突起膠細胞などの複数のグリア細胞、ならびに細胞外マトリックス、可溶性因子および生物物理学的因子を構成する、比較的特徴が低く、独特に複雑である。実験的に、アストロサイトおよびミクログリアは10、9、神経膠腫の進行および浸潤8を増加させることが示されているが、天然のヒトの脳の微小環境内のすべてのグリア細胞の組成は不明です。 我々は以前微小環境のコンポーネントが定量的に神経膠芽腫微小環境の細胞成分を分析し、比例ハザードモデル11に、私たちの分析を組み込むことにより、患者の生存を予測することができます示しました。ここでは、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定するための定量分析方法を説明するs。我々は、グリア細胞集団を同定するために発色免疫組織化学を使用し、各グリア集団の染色のカバレッジ率を分析するためにImageJを使用した。カバレッジ率を評価すると、細胞、特にがん細胞との相互作用によって影響を受ける細胞の形態学的相違を決定するための簡単な測定が行われます。組織病理学的染色を定量化するための以前の研究では、抗体ベースの免疫組織化学染色の特異性を利用していないヘマトキシリンおよびエオシン12またはマッソントリクロム13などの標準染色を使用しています。本発明者らの方法は、グリア芽細胞腫患者の腫瘍切除物中のグリア個体群を直接定量化するために開発されたものであり、これは複雑なグリア芽細胞腫の微小環境を解明することを目的とする。

<table><tbody><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>X3P</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高pH抗原アンマスキングソリューション</td><td>ベクターラボ</td><td>H-3301</td><td></td></tr><tr><td>TBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>アムレスコ</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>馬の血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ALDH1L1&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab56777</td><td></td></tr><tr><td>アンチIBA1&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab5076</td><td></td></tr><tr><td>抗オリゴデンドロサイト特異的タンパク質1&nbsp;</td><td>アブカム&nbsp;</td><td>ab53041</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS 反ヤギ</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7405</td><td></td></tr><tr><td>ImmPRESS Universal (anti-mouse/rabbit)</td><td>Vector Labs</td><td>MP-7500</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>ImmPACT DAB 基板</td><td>Vector Labs</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン対比染色</td><td>ThermoScientific</td><td>72404</td><td></td></tr><tr><td>Histochoice 封入剤</td><td>Amresco</td><td>H157-475</td><td></td></tr><tr><td>Aperio Scanscope</td>, <td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Image Scanscope</td>, <td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>Super HT, PAP, Pen</td>, <td>Research Products International</td><td>195506</td><td></td></tr></tbody></table>

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

Quantitative Immunohistochemistry of the Cellular Microenvironment in Patient Glioblastoma Resections

腫瘍の微小環境への関心が高まっているため、致命的で最も侵襲性の脳腫瘍であるグリア芽細胞腫の患者サンプル内の微小環境成分を特異的に決定する方法を開発しました。定量的方法は、病変組織を正確に記述するのに有益であるばかりでなく、より正確な予後、診断、および組織工学システムおよび置換の開発に潜在的に寄与し得る。グリア芽細胞腫では、グリア細胞（例えば、ミクログリアおよび星状細胞）は、病理学者のグレーディングに基づいて予後不良と独立に相関している。しかしながら、これらの細胞および他のグリア細胞成分の状態は、定量的に十分に記載されていない。これは、これらのグリア細胞を標識する大きなプロセスのために困難であり得る。さらに、大部分の組織学的分析は、全体的な組織サンプルに焦点を当てるか、または腫瘍の大部分内のみに焦点を当てるが、領域に基づく定量化を描写するのではなく高度に異種の組織である。ここで、我々は、グリア芽細胞腫患者からの腫瘍切除の腫瘍バルクおよび隣接領域内のグリア細胞の集団を同定し、定量的に分析するための方法を記載する。本発明者らは、染色体免疫組織化学を用いて、患者の腫瘍切除におけるグリア細胞集団を同定し、ImageJは、各グリア集団についての染色のカバレッジ率を分析した。これらの技術を用いて、神経膠腫腫瘍微小環境の領域全体にわたってグリア細胞をよりよく記述することができる。

この分析のために、原発腫瘍バルクおよび拡散した浸潤性癌細胞を有する健康な組織（ 図1A 、 1B ）を主に含む隣接領域の2つの関心領域を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色患者の神経病理学者と共同して同定したサンプル。各患者サンプル内で、発色免疫組織化学によるアストロサイト（ 図1C ）、ミクログリア（ 図1D ）、および希突起膠細胞（ 図1E ）の陽性染色が同定された。これらの集団は、それぞれ一次抗体ALDH1L1、Iba1、および乏突起膠細胞特異的タンパク質（OSP1）を用いて同定された11 。抗体希釈液の最適化と、染色が正確で陽性であるかどうかを確認するための製造業者のプロトコールとの協議が推奨される<html> （ <strong class="xf...

このプロトコールは、発色免疫組織化学およびImageJを用いたグリア芽腫患者切除における腫瘍微小環境成分を定量的に同定するために開発された。

With the growing interest in the tumor microenvironment, we set out to develop a method to specifically determine the microenvironment components within ...

このプロトコルの全体的な目的は、発色免疫組織化学染色とImage Jを用いて、膠芽腫（グリオブラストーマ）患者の切除組織における腫瘍微小環境構成成分を定量的に同定することです。この手法は、患者検体においてこれらの構成成分がどのように見えるか、また、生理学的に意味のある細胞比率をどのように決定できるかなど、腫瘍微小環境分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、患者検体の解析が簡便であることです。この技術の意義は、十分に特性が解明されていない複雑な膠芽腫の腫瘍微小環境の解明へとつながる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、組織の過剰発色や飽和を防ぐために発色時間の厳密な監視が必要となるため、苦労することがあります。付随するテキストプロトコルに記載された洗浄操作からプロトコルを開始してください。Trisベースの高pH抗原賦活化溶液と蒸留水は、製造元の推奨に従って希釈してください。希釈したアンマスキング溶液を密閉されていない電子レンジ対応容器に加え、熱による抗原賦活化を行います。スライドを容器に入れます。その後、スライドを入れた容器を電子レンジに入れます。次に、容器を高出力で20分間沸騰させます。液量を確認し、蒸発に応じて必要に応じて蒸留水を補充してください。その後、サンプルを溶液中で室温にて1時間冷却させます。組織サンプルの周囲を疎水性ペンで囲み、サンプルを覆うために必要な試薬量を最小限に抑えます。次に、組織サンプルが浸るまで、100～200 µLの透過化溶液をピペットで加えます。この溶液を除去して廃棄し、再度組織サンプルを透過化溶液で覆います。サンプルをブロッキング液とともに室温で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング液で希釈した一次抗体とともに、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、一次抗体の宿主動物に対応するホースラディッシュペルオキシダーゼポリマー試薬を用いて、一次抗体を検出します。組織サンプルを覆うのに十分な量の透過化溶液をピペットで加え、サンプルを5分間インキュベートします。溶液を除去して廃棄し、再度透過化溶液で組織サンプルを覆い、5分間インキュベートします。スライドを0.3%過酸化水素およびIX TBS中で15分間インキュベートします。ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて、目的の色強度が得られるまで2〜10分間、サンプルの発色反応を行います。メーカーのプロトコルに従い、ヘマトキシリンなどで細胞核を同定するための対比染色を行います。100%エタノールとキシレンを用いてサンプルを脱水します。最後に、封入剤を用いてサンプルを永久封入します。腫瘍切除検体内の2つの関心領域、すなわち原発腫瘍バルク（Bulk）および、主に正常組織からなり癌細胞がびまん性に浸潤している隣接領域（Adjacent）を、共同研究者の神経病理医がヘマトキシリン・エオジン染色を施した患者サンプルに基づき特定しました。発色免疫組織化学染色により、各患者サンプルにおいてアストロサイト、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトの陽性染色が確認されました。陰性対照として、一次抗体を用いない染色を行いました。anti ALDH 1l1抗体については、細胞体および突起の陽性染色が最適であり、かつバックグラウンドが最小限に抑えられることから、メーカーの推奨に基づきさらに希釈検討を行い、最終的に1:200希釈を採用しました。Image Jを用いて、OSP-1陽性のオリゴデンドロサイト染色の被覆率（percent coverage）を定量化し、最終的に関心領域間の差異を比較しました。画像に適切な閾値を適用した後、その閾値に基づく被覆率を測定し、複数の患者間で比較することができます。膠芽腫（glioblastoma）またはGBM患者サンプルの隣接する5つの領域およびバルク領域を、正常な脳組織とともに、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質1（OSP1）の被覆率について比較しました。この染色法に習熟すれば、適切に実施した場合、1日目に4時間、2日目に2時間で完了させることができます。本手順を行う際は、組織の染色強度と水和状態を注意深く監視することが重要です。

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Medicine

医学

出典:Núñez, F. J., et al. Evaluation of Biomarkers in Gliomas by Immunohistochemistry on Paraffin-Embedded 3D Glioma Neurosphere Cultures. J. Vis. Exp.

脳腫瘍ニューロスフェア切片におけるバイオマーカーの免疫組織化学的染色

無血清神経球培地における解離された高等度神経膠腫外科標本の伝播のためのプロトコルは、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して選択する。神経球として成長できない標本については、代替プロトコルが提案される。免疫細胞化学のための3D神経球アーキテクチャを維持するためのパラフィン埋め込み技術について説明する。...

臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

初期の脳の腫瘍微小環境を入力する免疫細胞の数および活性化状態に対する時間依存の定量的データをもたらす神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析のための簡単​​な方法は、ここに提示しました。...

神経膠腫浸潤末梢血単核細胞の単離およびフローサイトメトリー分析

ここで分離し、確立された皮下腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小環境のコンポーネントを豊かにする方法をについて説明します。この手法は、腫瘍免疫浸潤と非免疫腫瘍腫瘍免疫微小環境の包括的な評価を可能にすることができます独立した分析のためことができます。...

濃縮と確立された皮下マウス腫瘍における腫瘍免疫と免疫のない微小のキャラクタリゼーション

同所性同種人間原発性脳腫瘍を運ぶ免疫不全マウスにおける準備と同種の人間のリンパ球の脳定位固定装置の管理のためのプロトコルを紹介します。本研究は、実現可能性と intrabrain...

同所性同種人間神経膠腫異種移植片のマウスモデルの細胞傷害性免疫細胞の定位の養子転送

3 D 文化として成長した神経幹細胞は神経膠腫の生物学を勉強するための強力なツールを構成します。パラフィン包埋による神経膠腫細胞の 3次元構造を維持しながら免疫を実行するプロトコルをご紹介します。このメソッドは、幹細胞性など神経分化神経膠腫 neurosphere...

パラフィン埋め込まれた 3 D 神経膠腫 Neurosphere 文化に免疫組織化学による神経膠腫におけるバイオ マーカーの評価

レーザーマイクロディション(LMD)は、グリオーマの不均一性と侵入を媒介する経路を明らかにするために使用できる、敏感で再現性の高い技術です。ここでは、レーザーLMDを用いて、トランスクリプトーム解析を用いて、グリオーマ組織から離散領域を分離するための最適化されたプロトコルについて述べている。...

腫瘍性異種性、オンコストリーム、および浸潤の空間・分子特性解析のための神経膠腫部分領域のレーザー捕捉微小切除

プロテオミクス調節不全は、びまん性浸潤性神経膠腫の蔓延に重要な役割を果たしますが、いくつかの関連タンパク質は未同定のままです。デジタル空間処理(DSP)は、浸潤性神経膠腫の浸潤および遊走に寄与する可能性のある候補タンパク質の発現差を特徴付けるための効率的でハイスループットなアプローチを提供します。...

成人型びまん性浸潤神経膠腫における微小環境のキャラクタリゼーションのためのディジタル空間プロファイリング

私たちは、間質液の流れを組み込んだ浸潤前部の神経膠腫腫瘍微小環境を再現する方法を提示します。このモデルは、ヒアルロン酸-コラーゲンI型ハイドロゲルを組織培養インサートに含ませたもので、液圧ヘッドを適用することができる。浸潤を定量化し、細胞を単離または溶解することができます。...

間質流を有する浸潤性神経膠腫微小環境の光重合性ヒアルロン酸コラーゲンモデル

このプロトコルは、レーザーキャプチャーマイクロディセプションを用いて、腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のために、グリオーマサンプルから高品質な新生血管組織を十分に調製することに成功し、従来の主に血管新生因子に焦点を当てた研究の限界を克服し、グリオーマ血管新生の大規模なプロテオミクスプロファイルを提供しました。...

腫瘍血管新生の定量的プロテオミクス解析のためのヒト膠質腫組織からの新生血管組織の調製

学ぶ、クロモジェニック免疫組織化学とImageJを用いて膠芽細胞腫患者切除組織の腫瘍微小環境構成要素を定量的に同定する方法。細胞比率の決定と標的治療開発への貢献が可能です。

患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

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