患者の膠芽細胞腫切除における細胞微小環境の定量的免疫組織化学

このプロトコルの全体的な目的は、発色免疫組織化学染色とImage Jを用いて、膠芽腫（グリオブラストーマ）患者の切除組織における腫瘍微小環境構成成分を定量的に同定することです。この手法は、患者検体においてこれらの構成成分がどのように見えるか、また、生理学的に意味のある細胞比率をどのように決定できるかなど、腫瘍微小環境分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、患者検体の解析が簡便であることです。この技術の意義は、十分に特性が解明されていない複雑な膠芽腫の腫瘍微小環境の解明へとつながる点にあります。

一般的に、この手法に不慣れな方は、組織の過剰発色や飽和を防ぐために発色時間の厳密な監視が必要となるため、苦労することがあります。付随するテキストプロトコルに記載された洗浄操作からプロトコルを開始してください。Trisベースの高pH抗原賦活化溶液と蒸留水は、製造元の推奨に従って希釈してください。

希釈したアンマスキング溶液を密閉されていない電子レンジ対応容器に加え、熱による抗原賦活化を行います。スライドを容器に入れます。その後、スライドを入れた容器を電子レンジに入れます。

次に、容器を高出力で20分間沸騰させます。液量を確認し、蒸発に応じて必要に応じて蒸留水を補充してください。その後、サンプルを溶液中で室温にて1時間冷却させます。

組織サンプルの周囲を疎水性ペンで囲み、サンプルを覆うために必要な試薬量を最小限に抑えます。次に、組織サンプルが浸るまで、100～200 µLの透過化溶液をピペットで加えます。この溶液を除去して廃棄し、再度組織サンプルを透過化溶液で覆います。

サンプルをブロッキング液とともに室温で1時間インキュベートします。次に、ブロッキング液で希釈した一次抗体とともに、サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。翌日、一次抗体の宿主動物に対応するホースラディッシュペルオキシダーゼポリマー試薬を用いて、一次抗体を検出します。

組織サンプルを覆うのに十分な量の透過化溶液をピペットで加え、サンプルを5分間インキュベートします。溶液を除去して廃棄し、再度透過化溶液で組織サンプルを覆い、5分間インキュベートします。スライドを0.3%過酸化水素およびIX TBS中で15分間インキュベートします。

ペルオキシダーゼジアミノベンジジン（DAB）基質を用いて、目的の色強度が得られるまで2〜10分間、サンプルの発色反応を行います。メーカーのプロトコルに従い、ヘマトキシリンなどで細胞核を同定するための対比染色を行います。100%エタノールとキシレンを用いてサンプルを脱水します。

最後に、封入剤を用いてサンプルを永久封入します。腫瘍切除検体内の2つの関心領域、すなわち原発腫瘍バルク（Bulk）および、主に正常組織からなり癌細胞がびまん性に浸潤している隣接領域（Adjacent）を、共同研究者の神経病理医がヘマトキシリン・エオジン染色を施した患者サンプルに基づき特定しました。発色免疫組織化学染色により、各患者サンプルにおいてアストロサイト、ミクログリア、およびオリゴデンドロサイトの陽性染色が確認されました。

陰性対照として、一次抗体を用いない染色を行いました。anti ALDH 1l1抗体については、細胞体および突起の陽性染色が最適であり、かつバックグラウンドが最小限に抑えられることから、メーカーの推奨に基づきさらに希釈検討を行い、最終的に1:200希釈を採用しました。Image Jを用いて、OSP-1陽性のオリゴデンドロサイト染色の被覆率（percent coverage）を定量化し、最終的に関心領域間の差異を比較しました。

画像に適切な閾値を適用した後、その閾値に基づく被覆率を測定し、複数の患者間で比較することができます。膠芽腫（glioblastoma）またはGBM患者サンプルの隣接する5つの領域およびバルク領域を、正常な脳組織とともに、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質1（OSP1）の被覆率について比較しました。この染色法に習熟すれば、適切に実施した場合、1日目に4時間、2日目に2時間で完了させることができます。

本手順を行う際は、組織の染色強度と水和状態を注意深く監視することが重要です。