Name: 適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いたC. elegansオス頭部ニューロンのカルシウムイメージング法。フェロモン応答における性特異的神経回路の動態をリアルタイムで観察し、神経生物学研究に応用可能です。

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男性; に対応した初期設計ファイルをご提供するマヌエル · ジマーを感謝したいと思います合成と ascr; #3 の供給のためのフランク ・ シュレーダー洞察力とイメージングと分析支援のためロス Lagoyこの原稿のレビューに貢献したクリストファー ・ シュートと一緒に、マスターの作製とローラ Aurilio.この作業に資金は国立衛生研究所の助成金 1R01DC016058-01 (バッハ)、全米科学財団助成金あわせて 1605679 (D.R.A.)、バローズ Wellcome キャリア賞科学的なインターフェイス (D.R.A.) の下で提供されました。

<ol><li>Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Devices+for+Behavioral+Analysis%2C+Microscopy%2C+and+Neuronal+Imaging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Mol Biol. 1327, 159-179 (2015).</li>
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<li>Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worm+chips%3A+Microtools+for+C.+elegans+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Worm chips: Microtools for C. elegans biology.</a> Lab on a Chip. 10 (4), 432-437 (2010).</li>
<li>Lee, H., Crane, M. M., Zhang, Y., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+screening+of+genes+regulating+tryptophan+hydroxylase+transcription+in+Caenorhabditis+elegans+using+microfluidics+and+an+adaptive+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative screening of genes regulating tryptophan hydroxylase transcription in Caenorhabditis elegans using microfluidics and an adaptive algorithm.</a> Integr Biol (Camb). 5 (2), 372-380 (2013).</li>
<li>Lockery, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+whole-animal+drug+screening+using+electrophysiological+measures+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for whole-animal drug screening using electrophysiological measures in the nematode C. elegans.</a> Lab Chip. 12 (12), 2211-2220 (2012).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nat Commun. 7, 13023(2016).</li>
<li>Larsch, J., Ventimiglia, D., Bargmann, C. I., Albrecht, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (45), E4266-E4273 (2013).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neuro%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Front Mol Neuro. 6, 2(2013).</li>
<li>Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+calcium+sensor+proteins+for+monitoring+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Fast calcium sensor proteins for monitoring neural activity.</a> Neurophotonics. 1 (2), 025008(2014).</li>
<li>Tatro, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+imaging+of+neurons+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Brain-wide imaging of neurons in action.</a> Front Neural Circuits. 8, 31(2014).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Greene, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+selection+shapes+density-dependent+foraging+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour.</a> Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).</li>
<li>Greene, J. S., Dobosiewicz, M., Butcher, R. A., McGrath, P. T., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+changes+in+two+chemoreceptor+genes+contribute+to+a+Caenorhabditis+elegans+QTL+for+foraging+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Regulatory changes in two chemoreceptor genes contribute to a Caenorhabditis elegans QTL for foraging behavior.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+Chemoreceptors+Mediate+Developmental+Effects+of+Dauer+Pheromone+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two Chemoreceptors Mediate Developmental Effects of Dauer Pheromone in C. elegans.</a> Science. 326 (5955), 994-998 (2009).</li>
<li>McGrath, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+evolution+of+domesticated+Caenorhabditis+species+targets+pheromone+receptor+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel evolution of domesticated Caenorhabditis species targets pheromone receptor genes.</a> Nature. 477 (7364), 321-325 (2011).</li>
<li>Schmitt, C., Schultheis, C., Husson, S. J., Liewald, J. F., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+Expression+of+Channelrhodopsin-2+in+Single+Neurons+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Specific Expression of Channelrhodopsin-2 in Single Neurons of Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. 7 (8), e43164(2012).</li>
<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Structure+of+the+Nervous+System+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+of+the+Royal+Soc+of+Lon%22%5BJournal%5D)">The Structure of the Nervous System of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Phil Trans of the Royal Soc of Lon. 314 (1165), 1(1986).</li>
<li>White, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+circuitry+for+sexual+attraction+in+C.+elegans+males%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The sensory circuitry for sexual attraction in C. elegans males.</a> Curr Biol. 17 (21), 1847-1857 (2007).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Meth. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Chute, C. D., Srinivasan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+mating+cues+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical mating cues in C. elegans.</a> Semin Cell Dev Biol. 33, 18-24 (2014).</li>
<li>Izrayelit, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+metabolomics+reveals+a+male+pheromone+and+sex-specific+ascaroside+biosynthesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted metabolomics reveals a male pheromone and sex-specific ascaroside biosynthesis in Caenorhabditis elegans.</a> ACS Chem Biol. 7 (8), 1321-1325 (2012).</li>
<li>Ludewig, A. H., Schroeder, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascaroside+signaling+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Ascaroside signaling in C. elegans.</a> WormBook. , 1-22 (2013).</li>
<li>Narayan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrasting+responses+within+a+single+neuron+class+enable+sex-specific+attraction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Contrasting responses within a single neuron class enable sex-specific attraction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (10), E1392-E1401 (2016).</li>
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<li>García, L. R., Portman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+circuits+for+sexually+dimorphic+and+sexually+divergent+behaviors+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neural circuits for sexually dimorphic and sexually divergent behaviors in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Opin Neurobiol. 38, 46-52 (2016).</li>
<li>Clokey, G. V., Jacobson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autofluorescent+%26%2334%3Blipofuscin+granules%26%2334%3B+in+the+intestinal+cells+of+Caenorhabditis+elegans+are+secondary+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">The autofluorescent &#34;lipofuscin granules&#34; in the intestinal cells of Caenorhabditis elegans are secondary lysosomes.</a> Mech Ageing Dev. 35 (1), 79-94 (1986).</li>
<li>Coburn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthranilate+Fluorescence+Marks+a+Calcium-Propagated+Necrotic+Wave+That+Promotes+Organismal+Death+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Anthranilate Fluorescence Marks a Calcium-Propagated Necrotic Wave That Promotes Organismal Death in C. elegans.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001613(2013).</li>
<li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hub-and-spoke+circuit+drives+pheromone+attraction+and+social+behaviour+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A hub-and-spoke circuit drives pheromone attraction and social behaviour in C. elegans.</a> Nature. 458 (7242), 1171-1175 (2009).</li>
<li>Park, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+structure-specific+and+promiscuous+G-protein-coupled+receptors+mediates+small-molecule+signaling+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction of structure-specific and promiscuous G-protein-coupled receptors mediates small-molecule signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (25), 9917-9922 (2012).</li>
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男性に適応した嗅覚チップは、男性c. の elegansの効率的なトラップの方向のより詳細に制御でき狭いロードポートにターンを組み込みます。Z スタックを必要とせず、神経の二国間ペアの左と右の両方のメンバーの可視化が可能になります。この曲線は、アッシュ (2 D 図-e)29,30などの蛍光マーカーで 1 つだけの二国間のペアが割り当てられているワームの時間の垂直 100% から方向に します。ただし、CEM など 4 つの放射状に対称なニューロンと神経のクラスですべての 4 つのニューロンが表示されます時間の 3 分の 1 だけ。ワームをテストの 3 分の 1 3 つのだけ目に見える 4 つのニューロンと残りの 3 番目ののみ区別の違いは、背側と腹側の細胞体、左右非対称性 (データは示されていない) のいない間。狭いポートは、z 軸にワームの変動を防ぐためにより低いチャネル高さと結合されます。このデザインは、...

マイクロ流体デバイスなどを提供正確に制御された環境へのアクセス増加前記動物、線虫C. elegans、実験操作1をすることができます。これらの研究は、行動アッセイ、カルシウム イメージング、または実験結果1,2,3,4より正確な測定の結果、特定の表現型にも上映 5,6。マイクロは、試薬の最小限の量を活用しながら、詳細な実験を実行できる小規模液体条件を提供します。新しいマイクロ流体デバイス設計の一定の生産、アリーナ自然正弦波運動線虫の行動と神経イメージング研究における神経イメージング デバイスをトラップすることができるから、それぞれの使用方法が異なります・高スループットによる遺伝的形質解析画面4,5,6,7は、デバイスへの嗅覚研究。次のマスター型の製作、マイクロ流体デバイスが構築する高価な-マスターの再利用性を与えられる- で使いやすい、高スループット研究を介して迅速なデータを生成することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) などの高分子材料を用いたデバイスの作製時間以内の新しいデバイスを作成できます。
カルシウム イメージング研究は、リアルタイム8,9,10,11にこれらの細胞のダイナミクスを測定するのに遺伝的コード化カルシウム指示薬 (GECIs) ターゲット細胞で発現を使用します。線虫 c. エレガンスの透過的な性質は、生きている動物のこれらの蛋白質の蛍光レベルのレコーディングのためことができます。GECIs が伝統的に、緑色蛍光タンパク質 (GFP) に依存-用いたセンサー GFP カルモジュリン M13 ペプチド (GCaMP) より最近の研究より良い信号対雑音比と赤いシフト励起プロファイルを許可するこれらのセンサーを適応しています。GCaMP6s や GCaMP6f などのセンサーを含む、これらの仕様が付いている蛋白質を変化の次の GCaMP3 の開発 (低速と蛍光をオフ-料金をそれぞれ高速)、RFP カルモジュリン M13 ペプチド (RCaMP)、および赤いシフトがあります。活性化のプロフィール。線虫の細胞特異的遺伝子のプロモータ配列でこれら GECIs の組み合わせ興味、特にニューロン12,13,14,15のセルを対象します。,16。
マイクロ流体研究にc. の elegansの使いやすさを感じ取ることが、ほぼすべての研究が両性具有に焦点を当てた。男性のみは 0.01 0.02 にもかかわらず野生型人口の % は、非常に貴重な所見はその特性から生じる。両性系の物理のコネクトームは何十年も17に完全にマップされている、男性のコネクトームの動物18の頭部領域を中心に、不完全なままです。男性のカルシウム イメージングの使用は男性の神経系と 2 つの男女間の差異の理解を生成するのに役立ちます。線虫 c. エレガンスの成人男性のサイズを小さく大きいの両性具有の設計された伝統的な嗅覚デバイスの読み込みポートで効果的かつ信頼性の高いトラップを防ぎます。これに対処するためヴォックストロット嗅覚チップ19の修正版は開発された狭い読み込みポート、チャネル背の低いと、ワームのロードのポート (動物を回転)、二国間左/右の可視化が可能になります神経のペア。このデザインができます: 若い成人男性の (1) の有効なトラップ、二国間の対ニューロンの両方のメンバーと男性のニューロンの神経活動の (3) の精密な画像処理の可視化のための動物の (2) のより信頼性の高い向き。
ますます、研究は、線虫の男性が様々 な ascarosides (ascr) または線虫フェロモン20,21,22,23 に両性具有とは異なる応答を示す ,24。したがって、ダイナミクスと男性のコネクトーム内表現の理解を深めると、さらにもっと適切ななっています。男性c. の elegans含む両性25,26, に存在しない 87 セックス特定ニューロンとしてのコネクトームを変更-未定方法。これらのユニークなダイナミクスをイメージすることは、私たちはセックス固有の応答と脳内表現を理解しです。
このプロトコルは男性のc. の elegansの神経イメージングのため男性に適応した嗅覚チップの使用を説明しますその。灰は 1 M グリセリン男性、以前の雌雄同体に確実に応答する侵害受容ニューロンの研究27。Ascarosides への暴露は、テストされる動物の大きい数を必要とする動物から動物へ変数を応答を引き出すことがあります。男性固有の CEM ニューロンの応答以前示されている、電気生理学とイメージング研究、カルシウム ascaroside #323に必ず対応します。

<table><tbody><tr><td>シリコンウェーハ</td><td>大学ウェーハ</td><td>452</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2035</td><td>MicroChem</td><td>Y111070-0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>開発者</td><td>MicroChem</td><td>Y020100-4000L1PE</td><td></td></tr><tr><td>ウェーハマスク</td><td>CAD /アートサービス</td><td>-</td><td>カスタムオーダー。25,000dpiで印刷。</td></tr><tr><td>Sylgard-184</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>1.0 mm Dermal Punches</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P150</td><td></td></tr><tr><td>ソフトチューブ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-06419-01</td><td></td></tr><tr><td>ハードチューブ</td><td>IDEX健康&科学</td><td>1622</td><td></td></tr><tr><td>ピンニュー</td><td>イングランドスモールチューブ</td><td>NE-1027-12</td><td></td></tr>ブロッキング<tr><td>ピン</td><td>ニューイングランドスモールチューブ0.415</td><td>/0.425インチOD×.500ロング</td><td>バッチPB07027</td></tr><tr><td>3mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>30mLシリンジ</td><td>バイタリティメディカル</td><td>302832</td><td>バッファーリザーバーとして使用されます。</td></tr><tr><td>ステンレス鋼の鈍い針23ゲージ、ポリプロリレンルアー</td><td>部品供給会社</td><td>NE-231PL-50</td><td></td></tr>ル<tr><td>アー接続付きストップコック;3ウェイ;オスロック;5フローパターン;非滅菌</td><td>コールパーマーEW-30600-07</td><td></td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーファイネストプレミアムカバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック12-548-5M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メルカトル制御システムLF-5プラズマシステム</td><td>メルカトル</td><td>LF-5</td><td></td></tr><tr><td>スコッチテープスコ</td><td>ッチ</td><td>BSN43575</td><td></td></tr><tr><td>シリーズ20チャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>P-2</td><td></td></tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>ベルアートScienceware420250000</td><td></td><td>24センチメートル内径。</td></tr><tr><td>重量を量るボート</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-01017-27</td><td></td></tr><tr><td>クラシックプラスバランス</td><td>メトラー・トレド</td><td>PB1501-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>コール・パーマー</td><td>EW-25554-06</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>30-202</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td>シェル</td><td>ドン・マニュファクチャリング・インク</td><td>9120993 モデル番号:1500E。</td></tr><tr><td>60 mm、ノンベント、シャープエッジ ペトリ皿</td><td>TriTech Research</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer.A1</td><td>Zeiss-Hammamatsu</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Orca Flash 4.0 Digital CMOS</td><td>Hammamatsu</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Blue Fluorescent Light</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM6-LCR-SA</td><td>24-30V/7.9A DC.</td></tr><tr><td>照明</td><td>アダプターZeiss</td><td>423302-0000</td><td></td></tr><tr><td>シリーズ1および2ミニチュア不活性PTFEアイソレーションバルブ</td><td>パー</td><td>カー001-0017-900</td>流れ<td>を制御するための3ウェイバルブ。</td></tr><tr><td>バルブリンク8.2&reg;</td><td>AutoMate Scientific</td><td>01-18</td><td>Flow Switch Controller</td></tr><tr><td>Micro Manager</td><td>Micro-Manager-Free</td><td></td> <td>ソフトウェアは、https://www.micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>ImageJ-Free</td><td></td> <td>ソフトウェアをダウンロード可能: https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Agar, Bacteriological Grade Apex</td><td></td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン</td><td>Apex</td><td>20-260</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>VWR</td><td>BDH0224-1KG</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391-1kg</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>アルファ Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270741-4L</td><td></td></tr><tr><td>テトラミソール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756-10(G)</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>フルオレセイン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>FD2000S-250mg</td><td>光感受性。光保護バイアルに保管してください。</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6279-1L</td><td></td></tr><tr><td>Ascaroside #3</td> <td>-</td><td>-</td> <td>Schroeder Lab(コーネル大学)で合成。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Genesee Scientific</td><td>18-215</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>BDH</td><td>BDH9268.25</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T. Baker</td><td>3252-025</td><td></td></tr><tr><td>ASH GCaMP3 line</td><td></td><td>--</td><td>CX10979 (KyEx2865 [psra-6::GCAMP3 @ 100 ng/uL]).Bargmann研究室で開発。Albrecht Labライブラリから提供。</td></tr><tr><td>CEM GCaMP6ライン</td><td>-</td><td>-</td><td>JSR49 (FkEx98[ppkd-2::GCaMP::SL2::d sRED + pBX-1]; pha-1 (e2123ts); him-5 (e1490); lite-1 (ce314))Robyn Lints によって開発されました。Srinivasan Labライブラリから提供。</td></tr><tr><td>大腸菌 (OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>「リザーバー」</td><td></td>-<td>-</td><td>リザーバーを作成するには:「30mLシリンジ」は、「3mLシリンジ」と「ステンレス鋼鈍針23ゲージ」に接続されている「ルアー接続付きストップコック」に接続されています。 ポリプロリレン・ルアー」。次に、「ステンレス鋼鈍針23ゲージ、ポリプロリレンルアー」を針の約1/3の「ソフトチューブ」に挿入します。</td></tr></tbody></table>

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

カルシウム指標の使用に神経回路のダイナミクスとその制御の私達の理解が高まります。マップを完全に神経系と透明な解剖学、線虫線虫は、カルシウムの指標を使用してリアルタイムのダイナミクスを理解するための理想的なモデルを示します。マイクロ流体技術や実験のデザインと組み合わせて、これらの指標を用いたカルシウム イメージング研究は自由移動と閉じ込められた動物で実行されます。しかし、ヴォックストロットらで説明されている嗅覚のチップなどの捕集装置を利用した前の調査があるより少なく共通の男性、両方の形態学的および構造的より一般的な両性具有者で使用するために設計されたデバイス異種。適応嗅覚チップを設計、若い大人動物を用いた男性神経イメージングにおける効率性の向上のために作製します。ターンは、動物を回転し、2 D イメージングで二国間ペア内で個々 のニューロンの分離を可能にするポートをロード ワームに組み込まれました。ワームは、以前両性研究に従ってマイクロ流体デバイス内での匂いの流れを制御する公開されます。カルシウム濃度は ImageJ のオープン ソース ソフトウェアを使用して分析しています。男性ベースのc. の elegansの量の増加対応記載手順必要がありますカルシウム イメージング研究、セックスに固有の神経信号のメカニズムの私達の理解を深めます。

全体的なデバイスの設定の例は、図 1 aBで見ることができます。図 1 aは、適切な貯水池建設とセットアップを示しています。図 1 bは、マイクロ流体デバイスに貯水池の接続を示しています。図 1は、個々 のポートをわかりやすくするためのラベル付きのマイクロ流体デバイスを示しています。
男性に適応したマイクロ流体デバイスの設計に読み込みポートのカーブが含まれているが、流動、ヴォックストロットによって設計されたデバイスと同じら19(図 2 a-2 ...

線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。

適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

本手順の目的は、フェロモンに曝露した際、雄のC. elegansの頭部ニューロンにおけるカルシウムの一過性変化の画像を効率的にキャプチャすることです。この手法は、性特異的な神経回路の調節などの、神経生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイクロ流体トラップデバイスを用いて、雄のC. elegansを効率的にイメージングできるようになったことです。一般的に、この手法に不慣れな方は、最初は動物のセットに苦労することや、生体由来のフェロモンがすべての個体でカルシウム・トランジェンスを誘発するわけではないため、困難に直面することがあります。リザーバーの組み立てを開始するには、片端に針を、もう片端に金属チューブを挿入して、3セットのチューブを用意します。次に、各リザーバーについて、3方ルアーバルブを用意し、プランジャーを外した30 mLシリンジ、3 mLシリンジ、およびチューブを取り付けます。各リザーバーに、刺激S basalまたはフルオレセイン含有S basalの適切なバッファーを満たします。次に、シリンジを軽く叩いたりポンプ操作を行ったりして、リザーバーとチューブ内の気泡をすべて取り除きます。その後、新しい3 mLシリンジとチューブにS basalを満たし、マイクロ流体デバイスの出口ポートに挿入します。バッファーが入口穴の表面に現れるまで、シリンジに軽く圧力をかけます。次に、フローコントロール、バッファー、および刺激剤リザーバーのチューブを適切な入口穴に接続します。その際、充填ポートの穴と接続するチューブの両方に液滴があることを確認してください。ここで、再びシリンジに軽く圧力をかけ、線虫充填ポートの入口に液滴が現れたら、そのポートにソリッドブロッキングピンを挿入します。次に、シリンジを出口ポートから外し、施設内真空ラインに接続された出口ラインを取り付けます。ここで、顕微鏡のビデオフィードを用いて、フローティングチャネル内に気泡がないかデバイスを確認します。[live]をクリックしてライブ画像を観察し、気泡が自然に消えるまで待ってから次へ進んでください。次に、蛍光光源を点灯させ、GFPフィルターを使用してフローダイナミクスが適切であることを確認します。3ウェーブバルブを作動させ、バルブが開いているときにビデオフィードに蛍光コントロールストリームが現れることを観察します。まず、線虫を1匹選び、播種していないNGMアガールプレート上に載せ、線虫が這って移動するようにします。次に、S basalを用いてプレートを浮かせてください。虫体を含む溶液をシリンジで吸い上げます。その後、デバイスの出口ルアーバルブを使用して真空を切り、流れを停止させます。次に、ウォームロードポートを塞いでいるソリッドピンを取り除きます。ウォームの入ったチューブをロードポートに挿入します。アウトレットルアーバルブを開き、ライブビデオフィードを観察します。次に、線虫が現れるまでシリンジをゆっくりと押します。もし線虫が尾側から入った場合は、刺激にさらすために頭側から進入させる必要があるため、一度引き戻してください。尾側が完全にチャネルに入る前に引き戻す必要があります。さもなければ、線虫をチャネルから取り出すことは極めて困難であり、通常は線虫をチャネルの最後まで完全に流し切り、新しい線虫を導入することになります。次に、シリンジで圧力をかけ、チャネル内にウォームを送り、ウォームの頭部がバッファーの流れにさらされる位置に配置します。ただし、ウォームが自由に動き回れるほどチャネルの奥まで進めないようにしてください。麻痺していない個体では、わずかな軸方向または回転方向の動きが見込まれます。なお、バッファーに麻痺剤を添加すると、この影響をほぼ完全に排除できます。試験中の移動の可能性を低くするためには、より効率的にトラップできる高齢の雄を使用するか、虫の投入ポートの幅または厚みを小さくするか、あるいは麻酔剤に浸漬させる時間を長くしてください。ソフトウェアを使用して、青色光励起による記録を行います。露光時間を100 millisecondsに設定し、画像取得ウィンドウを開いて、タイムポイントを300、インターバルを0に設定してから、画像取得を開始してください。5秒後、バッファーを制御する三方バルブを切り替えて刺激を与えます。刺激時間は10秒から開始するのが適切であり、必要に応じて調整してください。刺激後、再びボタンを押してフローを戻し、30秒間のビデオ録画が完了するまで記録を続けます。これにより、g campの蛍光がベースラインまで戻ります。次に、次の試行まで調製物を30秒間静置します。ノシセプティブ（侵害受容）ニューロンであるASHにg camp threeを発現している線虫は、1 molarのグリセロールに対してASHニューロン内の蛍光の可視的な変化で反応し、これは神経活動を示しています。ニューロンはビデオ全体を通して解析領域内に留まっている必要があります。そうでなければ、移動アーティファクトが発生する可能性があります。その場合は、該当するタイムポイントの解析領域を移動させ、強度値を統合して単一のトレースを作成してください。曝露中に誘引性バイオジェニックフェロモンであるascaroside threeで刺激した雄において、4つのCEMニューロンのカルシウム過渡応答を測定しました。個体間およびニューロン間で、トレースの形状、符号、および大きさは異なっていました。したがって、フェロモン応答を研究する際は、多くの個体を解析することが非常に重要です。このビデオを視聴することで、雄の C elegans をマイクロ流体デバイスにロードし、頭部ニューロンにおけるカルシウム一過性応答を解析する方法について十分に理解できるはずです。雌雄同体を用いて同様のプロセスを行うことで、性別に特異的な神経応答の違いを特定できます。この手法を習得すれば、最初の個体のイメージングに要する時間は30分で完了します。最初の記録後は、約10分で新しい個体をセットしてイメージングすることが可能です。本手順に続き、光遺伝学などの他の手法を本プロトコルと組み合わせることで、神経回路がどのように制御されているかをさらに深く理解することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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ここでは、の長期的な嗅覚順応の分子読み出しを記述...

の長期嗅覚順応の分子読み出し<em&gt; Cエレガンス</em

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における損傷応答のライブイメージングや研究のためのマイクロ流体チップを使用<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫

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マイクロ流体デバイスを用いた機械的刺激と線虫の高解像度イメージング

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Caenorhabditis elegansにおける揮発性性フェロモン抽出と化学吸引アッセイ

このプロトコルは、マイクロ流体ベースの C.エレガンス...

すべての幼虫期にわたる高解像度 のC.エレガンス イメージング

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適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング

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