適応マイクロ嗅覚を用いた男性c. の Elegans頭ニューロンのフェロモン応答における神経活動のイメージング
September 7th, 2017
線虫男性の効率的なカルシウム イメージング用適応「嗅覚チップ」をご紹介します。グリセロールとフェロモンに男性露出の研究も示しています。
この手順の全体的な目標は、フェロモンへの曝露時に、男性のC.Elegans頭部ニューロンの画像カルシウム一過性を効率的に捕捉することです。この方法は、性特異的な神経回路制御の理解など、神経生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、オスのC.エレガンスをマイクロ流体トラップデバイスで効率的にイメージングできるようになったことです。
一般的に、この方法に不慣れな個体は、動物への負荷が最初は困難であり、生体フェロモンがすべての動物でカルシウムの過渡性を引き出すわけではないため、苦労するでしょう。リザーバーの組み立てを開始するには、一方の端に針を挿入し、もう一方の端に金属チューブを挿入して、3セットのチューブを準備します。次に、各リザーバーについて、3ウェイルアーバルブを取り、プランジャーを取り外した30ミリリットルのシリンジ、3ミリリットルのシリンジ、およびチューブを取り付けます。
各リザーバーに、刺激S基底またはフルオレシンを含むS基底のいずれかの適切な緩衝液を満たします。次に、シリンジをフリックしてポンピングすることにより、リザーバーとチューブの両方から気泡を取り除きます。次に、新しい3ミリリットルのシリンジとチューブにS基礎を充填し、マイクロ流体デバイスの出口ポートに挿入します。
バッファーが入口穴の表面に現れるまで、シリンジに少し圧力をかけます。次に、フロー制御チューブ、バッファーチューブ、および刺激リザーバーチューブを適切な入口穴に接続し、ローディングポートの穴と取り付けるチューブの両方に液滴が存在することを確認します。次に、液滴がウォームローディングポートインレットに現れるまでシリンジにもう少し圧力をかけてから、そのポートに固体ブロッキングピンを挿入します。
次に、シリンジをコンセントポートから取り外し、真空の家に接続されたコンセントラインを取り付けます。次に、顕微鏡からのビデオフィードのフロートチャネルに気泡がないかデバイスを検査します。ライブをクリックしてライブ画像を観察し、泡が自然に消えるのを待ってから続行します。
次に、蛍光灯をONにし、GFPフィルターを使用して適切な流れのダイナミクスを確認します。3波バルブを作動させ、バルブが開いているときに蛍光制御ストリームがビデオフィードに表示されるのを観察します。まず、シードされていないNGM寒天プレートに1匹のワームを選び、ワームが這い去るのを待ちます。
次に、プレートをS基底で浮かせます。ワームを含む溶液をシリンジに引き込みます。次に、デバイスでバキュームをオフにし、アウトレットルアーバルブを使用して流れを停止します。
次に、ウォームローディングポートを塞いでいるソリッドピンを取り外します。ウォームを含むチューブをローディングポートに挿入します。アウトレットルアーバルブを開き、ライブビデオフィードを観察します。
次に、ワームが現れるまでシリンジに穏やかな圧力をかけます。ワームを引っ張ると、ワームが最初に尾に入ると、刺激にさらされるためには頭から入る必要があります。ユーザーは、尾部がチャネルに完全に入る前にワームを引き戻さなければならず、そうでなければ、ワームをチャネルから取り出すことは非常に困難であり、通常はワームをチャネルを通して完全に洗い流し、新しいワームをロードする必要があります。
次に、シリンジからの圧力を使用して、線虫をチャネル内を進み、線虫の頭の位置を合わせて、線虫がバッファーの流れにさらされますが、チャネルの奥深くまではさらされず、自由に動き回れるようにします。麻痺していない動物では、少量の軸方向または回転方向の動きが予想されます。ただし、バッファーに麻痺薬を追加すると、この影響はほぼ解消されます。
試験中の動きの可能性を減らすには、より効率的に閉じ込められる高齢のオスを使用するか、ワームのローディングポートの幅または厚さを減らすか、麻痺患者で過ごす時間を増やします。ソフトウェアを使用して、青色光励起を使用して録音を行います。露出を100ミリ秒に設定し、画像取得ウィンドウを開き、間隔をゼロにして時間ポイントを300に設定してから、画像取得を開始します。
5秒後、バッファーを制御する三方弁を変更して刺激を適用します。10秒の刺激は良い出発点であり、刺激の長さは必要に応じて調整できます。刺激後、もう一度ボタンを押して流れを戻し、30秒のビデオが完了するまで録画を続けます。
これにより、g camp 蛍光をベースラインに戻すことができます。さて、次のトライアルの前に準備を30秒間休ませます。感受性のないニューロンであるASHでgキャンプ3を発現する線虫は、ASHニューロン内の蛍光に目に見える変化を伴う1モルのグリセロールに応答し、神経活動を示します。
ニューロンはビデオ全体にわたって分析領域に留まるべきであり、そうでなければ運動アーチファクトが発生する可能性があります。その場合は、それらの時点の解析エリアを移動し、強度値をマージして 1 つのトレースを作成します。曝露中に魅力的な生体フェロモンアスカロシド3で刺激された男性は、カルシウムの過渡性が4つのCEMニューロンで測定されました。
動物から動物へ、ニューロンからニューロンへ、痕跡は形、兆候、大きさがさまざまでした。したがって、フェロモン応答を研究する際には、多くの動物を分析することが非常に重要です。このビデオを見れば、オスのCエレガンスをマイクロ流体デバイスにロードする方法と、頭部ニューロンのカルシウム過渡性を分析する方法についてよく理解できるはずです。
同じプロセスを雌雄同体でも使用して、神経応答のsec特異的な違いを特定できます。このテクニックを習得すると、最初に画像化された動物に対して30分で完了します。最初の録画後、約10分で新しい動物を画像にロードできます。
この手順に続いて、光遺伝学のような他の方法をこのプロトコルと組み合わせることで、神経回路がどのように制御されているかをさらに理解することができます。
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概要
この記事では、グリセロールとフェロモンへの反応において、C. elegansのオスの効率的なカルシウムイメージング用に設計された適応型の「嗅覚チップ」について説明します。この方法は、神経生物学における性別特異的な神経回路の制御の理解を深めます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経生物学
- カルシウムイメージング
- 行動分析
背景
- C. elegansは神経機能の研究に重要なモデル生物として機能します。
- カルシウムイメージングにより、神経回路をリアルタイムで観察することができます。
- 刺激に対する性別特異的な反応は、神経回路のダイナミクスについての洞察を提供します。
- 効率的な捕捉技術は、生きた準備のイメージング能力を向上させます。
研究の目的
- オスのC. elegansの頭部ニューロンにおけるカルシウム遷移をイメージングするための技術を開発すること。
- オスが生物学的フェロモンやその他の刺激にどのように反応するかを探索すること。
- 性別特異的な神経回路の制御に関する新しい洞察を提供すること。
使用された方法
- C. elegansの捕捉とイメージングのためにマイクロ流体デバイスが使用されました。
- 神経反応の評価のための生物学的モデルとしてオスのC. elegansに焦点を当てました。
- ニューロンの活動を可視化するために蛍光タンパク質を使用してカルシウムイメージングが行われました。
- 重要なステップには、ワームの慎重なローディングとイメージング中の流体の流れの制御が含まれました。
- このプロセスにより、約10分で新しい動物のイメージングが可能になります。
主要な結果
- フェロモンへの露出時にASHニューロンと4つのCEMニューロンでカルシウム遷移が観察されました。
- 反応の形状と大きさは様々で、神経反応における個人差を示しています。
- この方法は、フェロモンに対する神経回路の反応を理解する上で有望な可能性を示しました。
- 動きのアーティファクトを最小限に抑えた神経活動のイメージングの実現可能性を示しました。
結論
- この研究は、オスのC. elegansのニューロン活動をリアルタイムでイメージングする方法を確立しました。
- この技術は、性別特異的な神経メカニズムを調査するために適応することができます。
- このアプローチは、化学的刺激に対する神経反応とそれらの神経回路制御への影響についての理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This microfluidic olfactory chip enables efficient calcium imaging in male C. elegans, addressing a key gap in sex-specific neurobiology research. By allowing real-time imaging of neuronal responses to pheromones, the method supports mechanistic de-risking in target validation for neuroactive compounds. The approach provides predictive value in early discovery by clarifying sex-dimorphic neural circuit regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of sex-specific neural circuits in response to pheromonal stimuli.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for trapping and imaging male C. elegans head neurons.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing of sex-dimorphic mechanisms in neuroactive compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of validated neuronal systems for downstream compound screening.
- Operational Value: Enables standardized, quantitative calcium transient measurements in defined neuronal populations.
- Assay Readiness: Supports scalable imaging workflows with minimal movement artifacts after initial training.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Connects discovery-phase neural imaging to preclinical continuity via sex-specific biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in sex-specific neural responses to chemical stimuli.
- Predictive Confidence: Enables risk-adjusted advancement decisions by revealing variable response patterns across individuals.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for neuroactive compounds requiring sex-specific efficacy profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of sex-specific neural circuit regulation through controlled pheromone exposure.
- Screening: Delivers assay-ready neuronal preparations with reproducible stimulus delivery and calcium readouts.
- Analytics: Enables quantitative analysis of calcium transients in ASH and CEM neurons using ImageJ for comparative condition evaluation.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by providing sex-stratified neural response data relevant to biomarker development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable microfluidic platform for rapid turnover of male C. elegans imaging, reducing per-animal preparation time after initial training.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving sex-specific neural signaling mechanisms.
- Operational Value: Standardizes worm loading and imaging procedures, improving throughput and reducing variability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by revealing sex-dimorphic neural responses that may predict differential compound efficacy.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroactive compounds based on sex-specific neural activity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly, worm handling, and calcium imaging techniques.
- Depends on access to fluorescence microscopy, syringe pumps, and vacuum control systems for fluid regulation.
- Necessitates standardization across teams for consistent worm loading orientation and stimulus timing.
- Involves adaptation considerations when extending the protocol to hermaphrodites or other neuronal strains.
- Includes practical limitations such as variable pheromone response rates and initial learning curve for worm loading efficiency.
