Name: 新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: 学ぶマウスケラチノサイトの単離培養法。新生児および成体マウス皮膚から初代ケラチノサイトを単離し、UVB暴露による分化と炎症応答をin vitroで解析する手法です。皮膚バリア機能と免疫応答の研究に活用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この研究は、潰瘍性大腸炎（R01AR069653〜Zhang LJ）および国立衛生研究所（5T32AR062496-03〜CA）によって支持された。

すべての動物実験は、UCSD機関動物管理および使用委員会の承認を受けています。 1.新生児皮膚由来の初代マウスKC単離および培養<ol><li> C57B / 6野生型マウス系統の生後0-2日の新生児をハサミを用いた断頭により犠牲にする。手首と足首の関節のすぐ上の手足を切断し、小さな穴を残して尻尾を完全に切断します。 </li><li> 皮膚全体を剥がすには、まず鋭いはさみを尾の穴に挿入し、身体の背中の中央線に沿って首の開口部に皮膚を切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した身体と他の鉗子で皮膚をつかみ、身体から皮膚全体を1つの連続した動きで脚の切り株に静かに引き剥がします。 <ol><li>損傷のない部分として皮膚を剥がし、皮膚を破片に分解しないように注意してください。これは、ディスパーゼ工程中に細胞が失われるためです。 </li></ol></li> &lt;10cmのペトリ皿中の15mLの滅菌PBSで剥離した皮膚をすすぎ、次にKC増殖培地中に4mg / mLのディスパーゼを含む氷冷ディスパーゼ消化緩衝液を充填した2mLのチューブに各仔の皮膚を入れる（KC基礎培地は0.06mMのCaCl 2 、dGSおよび抗生物質/抗真菌薬を有する）。 注：複数の皮膚分離株を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり最大5つのスキン）でインキュベートすることができます。ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。 <ol><li>皮膚が折り畳まれていないことを確認してください。折り畳まれた部分がディスパーゼ溶液に不十分に曝されることになります。 </li></ol></li><li>翌日（ディスパーゼで12〜18時間後）、ディスパーゼ溶液と共に皮膚をペトリ皿に移す。過剰のディスパーゼを洗い流すために、15mLの滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に各組織片を移す。 </li><li> 2対の鉗子を使用して、PBSから皮膚をつかみ、皮膚を持ち上げ、表側を下に、真皮側を上にして新しいペトリ皿に移す。肌のひだを注意深く引き伸ばし、ペトリ皿に完全に引き伸ばす。 </li><li> 新しいペトリ皿に各皮膚のためのトリプシンベースの消化溶液500μLを置きます。鉗子を使用して、表皮を下にして、表皮から真皮をゆっくり持ち上げます。生物を危険な物質として真皮を処分する。分離した表皮を移し、基底層を下にしてトリプシン溶液の各滴に浮遊させる。 <ol><li>表皮がトリプシン溶液で折りたたまれている場合は、上皮からの基底KCの効率的な消化を確実にするために、鉗子を使用して折り畳みを除去します。 </li></ol></li><li>穏やかに攪拌しながら水平シェーカー上で20分間室温（蓋を覆った状態）でトリプシン溶液中のペトリ皿上の皮膚をインキュベートする。 </li><li> 表皮あたり2mLの補充KC増殖培地（1平方インチあたり約1平方インチ表皮）をペトリ皿に加える。鉗子を使用して表皮を把握し、表皮を前後に激しくこすって表皮シートから単一細胞を放出させる。 <ol><li>細胞が表皮から分離するにつれて、中程度の濁りがますます激しくなるのを見てください。ペトリ皿を傾けて収集し、細胞懸濁液を新しいチューブに移し、残りの表皮シートを皿上に残す。 </li></ol></li><li> 2mLのKC増殖培地を添加した後、表皮シートをこすって2回以上繰り返し、同じチューブ内の細胞懸濁液を合わせる。 </li><li>適切な血清学的ピペットを使用して細胞塊を壊すために、細胞溶液を上下に穏やかに数回ピペットし、100μmフィルターに通して新しい50mL遠心チューブに移す。 </li><li>ろ過した細胞を180 x gで5分間遠心分離する。 </li><li>上清を吸引し、細胞ペレットを1mLの冷たいKC増殖培地/表皮に静かに再懸濁する。 </li><li>血球計数器で細胞を数える。 <br/&gt;注意：KCは懸濁液中で自発的に分化することができるので、細胞をできるだけ早く播種して細胞の最適な性能を確保する必要があります。細胞を氷上に置くことを推奨します。これは、KC自発分化の速度を低下させるためです。 </li><li> 細胞接着を促進する細胞外マトリックス（ECM）産物で予め被覆した培養皿中のKC増殖培地で5×10 4 / cm 2の密度で細胞を播種する。 注：我々は、市販のものを使用しています（例：ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子（詳細については表を参照）。5％CO 2の加湿インキュベーターで37℃で細胞を培養し、一日おきに補充する。 <ol><li>コーティングのために、細胞播種前に10分〜2時間室温に加温された細胞付着コーティング材料で培養皿をコートする。直前のアタッチメント係数を削除する細胞懸濁液を添加する。 </li></ol></li><li>初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。 </li></ol> 2.成体テールスキンからの一次マウスKC単離<ol><li>動物施設の規定に従って、成体C57BL / 6マウス（好ましくは、6〜15週齢、男性または女性）を屠殺する。テールベースから身体の尾を切り取り、先端に目に見える穴ができるように尾の先端を〜2 mmカットします。 </li><li>尾の皮を剥がすには、まず鋭い刃を使って裾の皮を基部から尾の先端まで切断します。次に、1つの鉗子を使用して、露出した尾骨と他の鉗子で皮膚をつかみ、穏やかに1つの連続した動きで骨から尾の皮膚を剥がします。ミッドラインから剥がした肌を切り取って、各部分の長さが2〜3cm未満になるようにします。 </li><li> 剥がした肌をすすいでください10cmのペトリ皿に15mLの滅菌PBSを入れ、次に氷冷ディスパーゼ消化緩衝液（KC増殖培地中の4mg / mLディスパーゼ）で満たした2mLチューブに各尾から皮膚を置く。 注：複数の皮膚片を組み合わせて、ディスパーゼ溶液12 mLを含む1つの15 mLチューブ（チューブあたり5テールまで）でインキュベートすることもできます。 <ol><li>ローテーター上で4℃の冷蔵庫で一晩皮膚をインキュベートする。 </li></ol></li><li>単一の細胞懸濁液を尾の表皮から単離するために、ステップ1.4からステップ1.13を実行する。 </li><li>コラーゲンでプレコートした培養皿中のKC増殖培地中で10×10 4 / cm 2 （血球計算盤で計数）の密度で成体細胞を播種する。 注：市販のコラーゲンベースのコーティングキットを使用しています（詳細については、 表を参照）。細胞を37℃、5％CO 2の加湿インキュベーターで培養し、1日おきに新鮮な培地を補充した。一般に、c最終的な皿は、細胞播種の30分から1時間前にコラーゲンでコーティングされるべきである。本発明者らは、ゼラチンベースのコーティング材料である付着因子と比較して、コラーゲンでコーティングした場合、皿に成人のKC付着が有意に増強することを観察する。 </li><li>初期メッキの24時間後に培地を交換し、付着していない細胞を除去し、実験前に細胞が所望の集密度に達するまで毎日培地を交換する。 </li></ol> 3.高カルシウムによるKCのin vitro分化<ol><li>最終分化を誘導するために、培地中に0.2mMまでCaCl 2を添加する。 </li><li>あるいは、高カルシウムを添加する前に、低カルシウムKC基礎培地に増殖補助剤を添加せずに、一晩培養したKCを飢餓状態にする。 注：成長因子飢餓は早期分化への細胞のコミットメントを高め、早期分化マーカー、例えばK10 5 </。 </li></ol> 4.KBからのUVB照射細胞致死およびTNFα放出<ol><li> KC増殖培地（37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中）でマウスKCを培養し、細胞がコンフルエンシーに達するまで毎日培地を交換する。 UVB照射の直前に、増殖培地を除去し、500μLのPBSと交換する。次に、細胞を25mJ / cm 2 UVBまたはモックコントロール（UVBなし）に付す。 注：UVB照射は、以前10に記載されているように2個の8 W電球（312 nm）を有するハンドヘルドUVBランプを用いて行われます。 UVB照射後、PBSを吸引し、新鮮な培地を加える。 </li><li>測定及び6,8でCCK-8細胞生存率アッセイによって細胞生存率を定量化し、製造業者の説明書11以下の24時間後UVB治療。 </li><li>所望の時点でUVBで処理したKCから馴化培地を収集し、放出されたTNFαを測定する製造業者の指示7、12以下マウスTNF（モノ/モノ）ELISAキットによって馴化培地です。 </li></ol>

<ol><li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2%2B+and+K%2B+gradients+in+murine+epidermis%3A+quantitative+measurement+using+PIXE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li>
<li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis%3A+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li>
<li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li>
<li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li>
<li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li>
<li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li>
<li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li>
<li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li>
<li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+%28DPP4%29+in+primary+human+%28pre%29adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074(2016).</li>
<li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage-inducible+C-type+lectin%2C+mincle%2C+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li>
<li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li>
<li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes%2C+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li>
<li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li>
<li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li>
<li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15502164">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li>
<li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li>
<li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li>
<li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li>
<li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation%2C+cell+cycle+exit%2C+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes%3A+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li>
<li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+1.2+mmol%2Fl+calcium%2C+triamcinolone+acetonide%2C+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, Suppl 27. 64-72 (1984).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

皮膚の表皮は、身体を外部環境から分離し保護し、水分喪失、病原体、熱およびUV照射からの損傷に対する重大な障壁として機能する。 KCは表皮の優勢な細胞系統であり、表皮KCの初代培養は、インビトロでの障壁形成の生物学的プロセスおよび環境傷害に対するKCの応答を研究および理解するのに有用なツールである。 ここでは、初代表皮KCを新生児および成体マウス皮膚から単離および培養する方法を説明する。初代マウスKCは、新生仔マウス皮膚から好都合に単離することができるが、成体KCの単離および成功した培養は、表皮の薄層化および成体マウス背側皮膚の高い毛嚢密度のために困難であると考えられる。本明細書に記載の方法は、成体マウス尾皮膚を基礎KCの便利で豊富な供給源として使用する。厚い表皮の存在と低いため<html>尾皮膚の毛包密度を高めるために、表皮を真皮から分離することによってKCを単離する重要な工程は、一晩の尾皮膚の消化後に実現可能となる。対照的に、このプロトコールを用いて成人の背部皮膚からKCを単離する試みは成功せず、単離後の細胞収率が低くなり、プレーティング後の細胞付着が低くなった...

皮膚は体の最も大きな臓器であり、最も外側の層は表皮である。表皮は、身体を環境から分離する無傷の表皮障壁を形成する上で決定的に重要な役割を果たし、したがって水分喪失を防ぎ、アレルゲン、病原体およびUVB曝露などの環境傷害から防御する。表皮は、未分化基底ケラチノサイト（KC）の単一層から基底層、棘突起層、顆粒層および角質層からなる多層重層化上皮に発達する。表皮幹細胞および中継増幅細胞の両方からなる基底KCは、増殖性および未分化性である。基本的なKCが細胞周期を終了すると、細胞は分化に拘束され、細胞 - 細胞接合の成熟および表皮透過障壁（EPB）の形成を伴って、表皮の表面に向かって徐々に移動する。棘状層のKCは、早期の差異を示すケラチン10（K10）のようなイオンマーカー; KCが顆粒層に移動すると、細胞はフィラグリン（FLG）、ロリクリン（LOR）およびインボルクリン（INV）などの後期分化マーカーを発現する。角質層では、KCは最終的に分化した角質細胞になり、最終的に新しい細胞がそれらに取って代わると落屑から流出する。 カルシウムは、表皮において最も生理学的に作用する物質であると考えられ、 インビトロおよびインビボで同様の方法で分化を誘発する。正常な皮膚表皮において、カルシウムイオンは、皮膚表面1、2、3に向かって濃度が増加し、特徴的な「濃度勾配」を形成します。カルシウム濃度は、最も低い副層（基底および棘の層）の低レベルから上部の顆粒層のピークまで上昇し、次いで最も表面の層（角質層）において無視できるレベルまで低下する。<html>カルシウム勾配は、カルシウム透過性がKC分化の重要な役割を果たすことを裏付ける成分透過性障壁の出現と同時に発生する。 インビトロでは 、低カルシウム（0.02-0.1mM）は単層としての基底KCの増殖を維持するが、高カルシウム（&gt; 0.1mM）はタイトジャンクション形成および誘導によって示されるように細胞の最終分化への迅速かつ不可逆的なコミットメントを誘導する基底KCS 4、5〜高カルシウム処理時LOR及びINVの。 障壁形成に加えて、表皮KCも皮膚の先天性免疫系の重要な構成要素である。 UVB照射または傷害時に放出される病原体または損傷関連分子パターン（DAMP）に応答して、KCはTNFα、IL6およびIFNβのような大量の炎症性サイトカインを産生し、免疫系の活性化をもたらす&gt; 6、7、8、9。 KCSから適切な炎症性シグナル伝達は、病原体のクリアランスに必要であるが、制御されない炎症性応答は、乾癬および酒6,8として自己炎症性皮膚疾患の発生をトリガすることができます。 全体として、KCは、無傷の皮膚バリアを維持し、病原体侵襲または環境傷害に対する免疫応答を開始する上で重要な役割を果たす。したがって、表皮KCの初代培養は、上皮生物学、KC分化、およびKC刺激による自然免疫応答を研究するための有用な技術である。主要マウス表皮KCの単離および培養は、KCの感受性および様々な外部刺激剤に対する感受性のために、困難なプロセスであり得る。ここでは、新生仔マウスの皮膚からKCを単離して培養する方法を説明します。成体マウスの尾の皮膚。成人のKC単離では、以下の理由により、この組織から十分な量の生存可能なKCを単離することが困難なため、マウス背側皮膚を使用しない：第1に、毛周期（休止期）の休止期における成人背側皮膚は、真皮からの表皮の非効率的な分離をもたらし、これは成功したKC単離のための重要なステップである。第2に、成人の背部皮膚上に存在する高い毛嚢密度は、真皮から表皮を分離することの困難さにさらに寄与する。その代わりに、我々は成体マウスKCsの供給源として尾皮膚を日常的に使用する。なぜなら、この上皮は表皮のKCの3〜5層でより厚いからである。それはまた、表皮の分離を妨げない、より低い毛嚢密度を有し、したがって、マウスの年齢および毛髪サイクリング段階に関係なく、成体マウス尾皮膚からのKC単離を可能にする。孤立した新生児タルKCをゼラチンコート培養皿に播種し、新生児対応細胞と比較して成体細胞が接着する能力が損なわれているため、コラーゲン被覆皿を用いて単離された成体KCを播種する。マウスKCを培養するために、低カルシウム基礎培地に、表皮成長因子（EGF）、ウシトランスフェリン、インスリン様増殖因子c1（IGF1）、プロスタグランジンE2（PGE2）、ウシ血清アルブミン（BSA）およびヒドロコルチゾンを含むdGSを補充する。最初の播種後2〜4日の間に、分化したKCの大部分は毎日の培地交換の間に洗い流すことができ、残りの接着細胞は典型的な敷石形態4を示し 、増殖し、早期分化マーカーK10を発現しない。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6新生児または成体野生型マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td>野生型マウス(もともとジャクソン研究所から購入)は、UCSDの動物ビバリウムで繁殖および維持されています。</td></tr><tr><td>KC 基礎培地 (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>0.06 mM CaCl2</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>培地用増殖サプリメント</td></tr><tr><td>Dispase powder</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td> 表<td>皮を真皮</td></tr><tr><td>から解離する酵素付着因子</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>ゼラチンベースのコーティング材料</td></tr><tr><td>Coating Matrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>コラーゲンベースのコーティング材料</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>表皮シートからケラチノサイトを解離する穏やかなトリプシン様酵素</td></tr><tr><td>100 &mu;m Cell Strainer Nylon mesh</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 cell viability Kit</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Corded Hand-Held UV Lamps</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-watt UV tubes</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養用光倒立顕微鏡</td><td>ZEISS、イェーナ、ドイツ</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

ケラチノサイト（KC）は、皮膚の最外層である表皮の優勢な細胞型である。上皮KCは、UVB照射または病原体などの環境傷害に対するインタクトな皮膚バリアを形成することによって、またそれらの傷害に対して炎症反応を開始することによって、皮膚防御を提供する上で重要な役割を果たす。ここでは、新生児マウス皮膚および成体マウス尾皮膚からKCを単離する方法を説明する。本発明者らはまた、キレキシブウシ胎児血清（cFBS）と比較して規定された成長補助剤（dGS）を用いて培養条件を記載する。機能的には、新生児および成人の両方のKCが、高カルシウム誘発性の分化、タイトジャンクションの形成および層別化に対して高い応答性を有することを示す。さらに、培養された成体KCは、UVB誘発細胞死に感受性であり、UVB照射の際に大量のTNFを放出し得る。一緒に、ここに記載された方法は、インビトロモデルの設定のための研究者にとって有用であろう新生児マウスおよび/または成体マウスの表皮生物学を研究する。

高カルシウムは、新生児および成人のKCの最終分化を誘導した。 0.06mM CaCl 2で平板培養し維持した初代マウス表皮KCは、単層として増殖し、個々の細胞は、明確な細胞間空間を有する多角形を有し、コンフルエントになると、石畳の外観を示した（ 図1Aおよび図2A ）。 CaCl 2を0.2mMまで上昇させると、細胞の急速な形態変化が誘導された。高カルシウム交換後8時間以内に、細胞は平らになり、明確な細胞間スペースはほとんど見られなくなり、24時間までにタイトジャンクションによる細胞 - 細胞接着が明らかになった（ 図1Aおよび図2B ）。角化細胞エンベロープの形成および垂直細胞層別化は、高カルシウムスイッチ後約48〜72時間に開始した（ <strong c...

上皮ケラチノサイトは、機能的な皮膚バリアを形成し、外部環境傷害に対する宿主防御の最前線に位置付けられる。ここでは、新生児および成体マウスの皮膚からの表皮ケラチノサイトの単離および初代培養、およびケラチノサイトからの最終分化およびUVB誘発性炎症反応の誘導のための方法を記載する。

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

この手順の目的は、新生仔または成体マウスの皮膚から初代マウス角化細胞を分離し、in-vitroでの分化を解析すること、あるいはUVb曝露に対する自然免疫応答を研究することです。本手法は、角化細胞の分化がどのように調節されているか、あるいは表皮角化細胞が外部刺激にどのように反応するかという、表皮生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、新生仔と成体双方のマウス皮膚から角化細胞を従来の方法で分離でき、かつ無血清で培養可能であることです。私と共に手順を実演するのは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるFengwu Liです。まず、野生型C57 BL6の生後0日から2日のマウス新生仔の四肢を、手首の関節のすぐ上で切り離し、尾を根元に少し残して完全に切り落とします。鋭い鋏を尾の切断部から挿入し、体の背側正中線に沿って首の開口部まで皮膚を切開します。一方のピンセットで露出した体を固定し、もう一方のピンセットで皮膚をつかみます。次に、皮膚が破れないように注意しながら、体から脚の切り株にかけて、皮膚全体を一度の連続した動作でゆっくりと剥がします。剥がした皮膚を10 centimeterのペトリ皿に入れた50 millimetersの滅菌PBSで洗浄し、皮膚が折れ曲がらないように注意しながら、氷冷したdispase消化バッファーが入った2 milliliterチューブに移します。新生児皮膚シートをすべて回収したら、チューブを4°Cのローテーターにセットし、一晩静置します。翌朝、チューブの内容物を新しいペトリ皿に分注します。その後、過剰なディスパーゼを除去するため、各組織片を50 mLの滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に移します。2本のピンセットを使用し、皮膚サンプルを個別のペトリ皿に表皮側を下にして配置し、皮膚のしわを慎重に伸ばして、サンプルが皿の底に完全に広がるようにします。各皿に500 microlitersのトリプシンベースの消化液を加え、1本のピンセットで表皮を固定しながら、もう1本のピンセットで真皮をゆっくりと表皮から持ち上げて剥離させます。分離した表皮を、基底層を下にしてトリプシン溶液に浮かべ、皿に蓋をします。次に、皮膚片を室温の水平シェーカーで20分間、緩やかに振盪しながらインキュベートします。インキュベーション後、各ペトリ皿に表皮1枚あたり2 mLの補充済み角化細胞増殖培地を加え、ピンセットを用いて表皮シートを激しくこすり、皮膚組織から単一細胞を遊離させます。培地が濁ってきたら、皿を傾けて細胞懸濁液を回収し、新しいチューブに移します。残った表皮組織はディッシュに残します。3回目の細胞回収後、プールした細胞懸濁液を数回穏やかにトリチュレーションし、細胞塊を分散させ、100 micronストレーナーを用いて新しい50 millil

isolation-culture-primary-mouse-keratinocytes-from-neonatal-adult

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

人間の皮膚から実行可能な成人上皮幹細胞を単離の迅速、確実な方法が記載されている。方法は、毛包と細胞培養のための単一の細胞懸濁液または組織断片の分離の摘採が続く皮膚のコラーゲンマトリックスの酵素消化を、利用しています。...

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

このビデオでは、ヒトの皮膚表皮層の最も顕著な細胞であるケラチノサイトを、酵素消化法と機械的破壊法を組み合わせて分離する様子を説明しています。この方法は、選択的増殖培地を使用して、他の皮膚細胞タイプよりもケラチノサイトを優先的に増殖するのに役立ちます。...

ヒト皮膚ケラチノサイト単離:皮膚サンプルから初代ケラチノサイトを培養する方法

成体幹細胞の生物学を研究するための理想的なモデルは、マウスの毛包です。ここでは、マウスの背側皮膚の酵素消化とそれに続くFACS分析を使用して、毛包幹細胞と表皮ケラチノサイトの異なる集団を分離するためのプロトコルを紹介します。...

背マウス皮膚から毛包幹細胞と表皮角化細胞の単離

人間の皮膚は外部環境に対する防御の最初の行として機能します。大人の皮膚から人間ケラチノ サイト主を分離する手法を提案します。これらの孤立したケラチノ サイトは、多数の実験のセットアップに便利、皮膚の生物学の in...

世代、大人の肌からプライマリ ヒト角化培養

大人の皮膚組織からプライマリ ヒト角を効率的に分離するためのプロトコルをご紹介します。このメソッドは、自発的に皮膚細胞から表皮細胞を分離する接種培地で岩阻害剤の Y-27632...

大人の皮膚組織から人間ケラチノ サイト主を特定する簡易で効率的な方法

このプロトコルの目的は、分子生物学、生化学、蛍光活性化細胞選別、一次インビトロ用途(例えば、クロノジェニック)などの様々な下流アプリケーションのために、成体マウスの後皮から表皮ケラチノサイトを分離することです。ケラチノサイト)。...

マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

このプロトコルは、皮膚ケラチノサイトをマウスモデルから単離し、金属タグ付き抗体で染色し、異なる細胞周期相で目的のタンパク質の発現パターンをプロファイリングするために質量サイトメトリーによって染色された細胞を分析する方法について説明する。...

質量細胞血症による細胞タンパク質発現の細胞周期特異的解析におけるマウス皮膚ケラチノサイトの単離と染色

ここでは、3D懸濁液培養における表皮スフェロイドの系統的培養のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、様々な上皮組織タイプで使用し、いくつかのヒト疾患および状態のモデリングのための幅広い用途を有する。...

ケラチノサイト幹細胞の可塑性をモデル化する高スループット表皮球面培養システムの確立

本プロトコルは、成人マウス口蓋に由来する経口角化細胞の分離および培養について説明する。免疫染色を用いた評価方法も報告されている。...

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

このプロトコールは、生細胞イメージングで使用するための新たに得られた(継代0)ケラチノサイトの培養を概説しています。...

ケラチノサイト生細胞イメージングのための初代培養物の生成

ここでは、マウスの血管線条から原発周辺細胞の分離、精製、培養および酸化ストレスおよび細胞老化の in vitro...

新生マウスからの血管条線の一次境界細胞の単離および培養

学ぶマウスケラチノサイトの単離培養法。新生児および成体マウス皮膚から初代ケラチノサイトを単離し、UVB暴露による分化と炎症応答をin vitroで解析する手法です。皮膚バリア機能と免疫応答の研究に活用できます。

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

さらに動画を探す