新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

この手順の全体的な目標は、新生児または成体マウスの皮膚から初代マウスケラチノサイトをin vitro分化から単離すること、またはUVb曝露に対する自然免疫応答を研究することです。この方法は、ケラチノサイトの分化がどのように制御されているか、または表皮のケラチノサイトが外部刺激にどのように反応するかについて、表皮生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ケラチノサイトが従来、マウス、新生児、成体の両方のマウス皮膚から単離できること、およびそれらを当社の血清と一緒に培養できることです。

私と一緒に手順を実演するのは、私の研究室のスタッフ研究員であるFengwu Liです。まず、野生型C57 BL6出生後0日目から2匹のマウス新生児の手足を切除し、手首の絡み合った関節のすぐ上で、尾を完全に切り落とし、小さなボールを残します。尻尾の穴から鋭利なハサミを挿入し、体の背側正中線に沿って首の開口部まで皮膚を切ります。

1つの鉗子を使用して露出した体をつかみ、別の鉗子を使用して皮膚をつかみます。次に、皮膚をバラバラにしないように注意しながら、体全体と脚の切り株全体を一気に連続して剥がします。皮をむいた皮膚を10センチメートルのペトリ皿で50ミリメートルの滅菌PBSですすぎ、皮膚が折りたたまれないように注意しながら、氷冷したディスパーゼ消化緩衝液を含む2ミリリットルのチューブに皮膚を入れます。

新生児のスキンシートをすべて集めたら、チューブを摂氏4度のローテーターに一晩置きます。翌朝、チューブの内容物を新しいシャーレに注ぎます。次に、各組織片を50ミリリットルの滅菌PBSを含む新しいペトリ皿に移して、余分なディスパーゼを取り除きます。

2つの鉗子を使用して、皮膚サンプルを表皮を下にして個々のシャーレに入れ、ピースが皿の底で完全に伸びるように皮膚のひだを慎重に伸ばします。各皿にトリプシンベースの消化液の500マイクロリットルを追加し、1つの鉗子を使用して、2番目の鉗子で表皮を所定の位置に保持しながら、各真皮をゆっくりと持ち上げて表皮から離します。分離された表皮をトリプシン溶液に浮かべ、基底レベルを下にして皿を覆います。

次に、室温で水平シェーカー上で皮膚片をインキュベートし、20分間穏やかに攪拌します。インキュベーションの終わりに、表皮ごとに2ミリリットルの補充されたケラチノサイト増殖培地を各シャーレに加え、鉗子を使用して表皮シートを激しくこすり、皮膚組織から単一細胞を放出します。培地が濁ったら、皿を傾けて、細胞懸濁液を回収して新しいチューブに移します。

残りの表皮組織を皿に残します。細胞収集の3回目のラウンドの後、プールされた細胞懸濁液を数回穏やかに粉砕して細胞塊を分解し、100ミクロンのストレーナーを介して細胞をろ過して新しい50ミリリットルの円錐管に入れます。遠心分離によって細胞を回収し、ペレットを氷上の冷たいケラチノサイト増殖培地1ミリリットルに穏やかに再懸濁してカウントします。

培養皿中のケラチノサイト増殖培地に5×10〜4cm二乗の密度で細胞を播種し、細胞接着を促進する細胞外マトリックス製品でプレコートします。次に、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、細胞が適切なコンフルエントに達するまで、毎日上清を新鮮な培地と交換します。成体マウスからケラチノサイトを分離するには、まずその基部で尾部を取り除きます。

続いて、テールチップの約2ミリメートルを取り外して、穴が見えるようにします。鋭利な刃を使用して、尾皮の付け根から先端まで切り込みます。次に、露出した尾骨をつかむために1つの鉗子を使用し、皮膚をつかむために別の鉗子を使用して、1回の連続動作で骨から皮膚組織をそっと剥がします。

皮をむいた皮膚を正中線で切り、各ピースの長さが2〜3センチメートル未満になるようにし、10センチメートルのシャーレで15ミリリットルの滅菌PBSですすいでください。最大5尾の皮を、最大12ミリリットルの氷冷を含む15ミリリットルのチューブに入れ、消化緩衝液を分散させ、皮を摂氏4度で回転させて一晩インキュベートします。翌朝、新生児の皮膚サンプルで示したように、部分的に消化された皮膚シートから表皮細胞を分離します。

次に、単離された成体ケラチノサイト細胞を、コラーゲンでプレコートした培養皿中のケレーションサイト増殖培地中の5乗センチメートル平方密度まで1x10で播種します。細胞が適切なコンフルエンシーに達するまで、上清を毎日交換します。いずれかのタイプのケラチノサイト培養の最終分化を誘導するには、2ナノモル濃度の細胞に塩化カルシウムを添加します。

UVb照射による死亡については、コンフルエントケラチノサイト培養物の増殖培地を500マイクロリットルのPBSに交換し、細胞をUVbの1平方センチメートルあたり15ミリジュールに短時間さらします。PBSを新鮮な増殖培地と交換し、細胞を細胞培養インキュベーターに6時間戻します。各実験時点で馴染ませた培地を回収した後、製造元の指示に従って、Cell Counting Kit Aid Viability Assayを用いて細胞生存率を定量化します。

次に、照射されたケラチノサイトが標準プロトコルに従って馴化培地に放出されるTNLを測定します。プライマリモードの表皮ケラチノサイトは、06ナノモル塩化カルシウムでプレーティングおよび維持され、単層として成長し、個々の細胞は明確な細胞間空間を持つ多角形の形状を示し、コンフルエントすると全体的な丸石の外観を示します。塩化カルシウムを2ミリモルに上昇させると、細胞内の急速な形態変化が誘発されます。

細胞が平らになり、8時間以内に明確な細胞間空間が目立たなくなります。また、タイトジャンクション間の細胞間接着は、24時間以内により顕著になります。48〜72時間で、角化細胞エンベロープの形成と垂直細胞の層別化が明らかになります。

高カルシウム処理ケラチノサイトのファロイジン染色は、カルシウムスイッチ後3時間という早い時期に、隣接する細胞間にアクチン繊維に富むフィロポディアル突起の形成を明らかにします。6時間から24時間の間に、さらなるアクチンファイバーのリモデリングが明らかになります。高カルシウム曝露後48時間で顕著な量の細胞層別化が明らかになります。

UVb照射は、位相コントラストイメージングと細胞生存率アッセイの両方によって証明されるように、ケラチノサイト培養の時間依存的な細胞死を引き起こします。実際、24時間までに、ほぼすべての細胞が丸みを帯びて剥離し、細胞生存率アッセイによって生存不能と測定されます。おそらく、UVb曝露に反応して、ケラチノサイトによって緩和される高レベルのTNFアルファが原因です。

この手順を試みる際には、解離したケラチノサイトを常に氷上に保ち、単離された細胞の最終的な分化を避けるために、できるだけ早く細胞をプレート化することを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、表皮生物学の分野の研究者が、皮膚の発達と皮膚の自然免疫防御におけるケラチノサイトの役割を探求する道を開きました。このビデオを見れば、新生児または成体のマウスの皮膚から初代表皮ケラチノサイトを分離し、培養する方法を十分に理解できるはずです。