レーザーのドップラー: 膵微小血管皮膚血管運動In Vivo測定のためのツール

本手順の全体的な目的は、生体内における膵島微小血管の血管運動の機能的状態を決定し、関連疾患への影響を評価することです。この手法は、病理学的状態で膵島微小血管の血管運動が変化するかどうかなど、医学的循環分野における重要な疑問への回答に寄与します。私たちは、糖尿病の発症過程において機能的な微小循環が形成されることを示した際に、この手法を着想しました。

この技術の主な利点は、臨床および研究の両方の環境において、組織や器官の微小血管の血管運動の機能的状態を評価できることです。この手法は、膵島に関連する疾患についての知見を提供することができます。また、腎臓や網膜に関連する微小血管疾患など、他の系にも適用可能です。

この手法の応用範囲は、微小血管の血管運動における機能的状態の傾向の性質を理解することまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな個人は、実験中のレーザードップラーから得られる膨大な量の微小血管学データに苦慮することになります。微小循環データの正確な収集に悪影響を及ぼす要因が多く存在するため、この手法のデモンストレーションを行うことが極めて重要です。

このプロトコルでは、まずマウスにSTZを5日間連続で毎日注射します。STZをクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、5 mg/mLの調製濃度にします。次に、1 mLシリンジと25G針を用いて腹腔内注射を行います。

マウスは注射の4時間前に絶食させますが、水へのアクセスは制限しないでください。対照群のマウスには、同容量の純粋なクエン酸ナトリウム緩衝液を注射します。注射後、マウスに通常の飼料と10% sucrose水を供給してください。

STZ投与の5日後、10% sucrose水（スクロース水）を通常水に replacement してください。その9日後に、血糖値を測定します。まず、マウスを6時間絶食させますが、水は自由飲水としてください。

次に、尾静脈から採血し、標準的な携帯型血糖計を用いて血糖値を測定します。血糖値が200 mg/dLを超えるマウスを糖尿病と判定します。レーザードップラー装置を使用する前に、まずプローブ先端とプローブコネクタの光学表面を柔らかい非研磨性の布で清掃し、ケーブルを装置のポートに接続します。

次に、校正スタンドを組み立てます。まず、保管されていたフラックス標準物質を室温に戻してください。これには約30分かかります。

次に、フラックス標準液を10秒間ゆっくりと振とうし、校正ベースの上で2分間静置します。続いて、クランプを最大限まで上げ、プローブをクランプに固定します。そして、プローブをゆっくりとフラックス標準液に浸し、プローブホルダーを用いて固定してください。

次に、室内の照明を暗くし、レーザードップラー装置のキャリブレーションボタンを押してください。次に、プローブが接続されている動作チャンネルを選択し、キャリブレーションプログラムを実行します。麻酔をかけたマウスを動作プラットフォーム上に仰向けに配置し、外科用テープで固定します。

次に、頸部から尾側にかけて腹部の皮膚を75%ethanolで滅菌し、中心に幅3cmの穴が開いた乾燥ガーゼスポンジで周辺部を覆います。次に、ピンセットで腹部の皮膚を持ち上げ、メスまたは皮膚用ハサミを用いて腹部正中線に沿って垂直に初回切開を行います。その後、下層の筋肉をピンセットで把持し、切開して腹腔内に入ります。

いかなる臓器も傷つけないようにしてください。腹腔を露出させるため、皮膚および下層の筋肉を胸部側に折り返し、鈍端鉗子を用いて膵体と脾臓を慎重に露出させます。次に、レーザードップラー装置の制御ソフトウェアで新しい測定ファイルを作成し、接続されたモニターを設定します。

「General」タブで、モニタリング期間を「free run」に設定し、「LDF monitor」タブでは工場出荷時のデフォルト設定を使用します。次に、「Display setup」ダイアログボックスを開き、適切なチャンネルを選択します。その後、チャンネルのデータソースとラベル、単位、色などのパラメータを切り替え、「Next」をクリックします。

次に、ファイル情報ダイアログボックスに被験者と測定に関する識別情報を入力し、再度「次へ」をクリックして進みます。これで設定が完了し、測定ウィンドウが表示されます。続いて、電極を手動で膵臓の1 mm以内にまで近づけます。

測定の精度は、プローブと膵島組織との距離に依存します。組織とプローブの間に1 mmの隙間を厳密に維持しなければ、血流の読み取り値が不正確になります。記録を開始するには、スタートアイコンをクリックすると、微小血管血流PUデータが保存され始めます。

これを1分間行い、録画中に表示される効果を調整するために、表示の圧縮・拡大ボタンおよびグラフトレースの高さ増減ボタンを使用し、その後録画を停止します。次に、ファイルを適切な名前で保存します。ここで、加算効果や収縮・弛緩能の局所的な枯渇を避けるため、プローブを手動で再配置してください。

合計で、マウス1匹につき膵臓の任意の3点からPUデータを収集します。実験の途中で、非反射プレートを用いてPUデータを測定し、ベースラインのコントロール値を得ます。3箇所の測定が完了した後、3-0縫合糸で筋層を閉鎖し、続いて4-0縫合糸で皮膚層を閉鎖します。

マウスをリカバリーケージ内で観察し、清潔なホームケージへ移せる状態になるまで待機します。一般的に、膵島の微小循環状態は、周期的な収縮相と弛緩相によって表されます。これらの総合的な血行動態現象により、血流灌流のパターンが形成されます。

レーザードップラー装置を用いて、非糖尿病マウスおよび糖尿病マウスにおける微小血管血流灌流の分布パターンを示すためにPUデータを収集しました。その結果は完全に異なっていました。STZ誘発糖尿病マウスでは、膵島微小血管の血管運動の収縮と弛緩のリズムが不規則で混沌としていたのに対し、非糖尿病対照群ではリズムのある振動が認められました。

次に、PUプロファイルを用いて血管運動を定量化しました。対照群と比較して、STZ誘発糖尿病マウスでは膵島微小循環の平均血流灌流が減少していました。また、これらのマウスでは、この血管運動の振幅と頻度、および膵島への血流灌流の相対速度に有意な低下が認められました。

この技術を習得すれば、適切に実施することで30分以内に完了させることができます。この手順を行う際は、プローブと膵臓組織の間の距離を1 mm以内に保つことが重要です。距離が不適切であると、血流の測定値が不自然に高く、あるいは低く表示されます。

本手順に続き、虚血の可視化、血流の評価、微小血管の血管運動の機能状態の評価といった追加の課題を解決するために、レーザースペックル法や酸素移動法などの他の手法を実施することができます。この技術の開発により、内分泌学および代謝分野の研究者や臨床医は、膵島関連疾患の背後に隠れた微小循環メカニズムを探索する道が開かれました。レーザー機器の使用は放射線曝露により極めて危険であるため、本手順の実施中は、眼から少なくとも200 millimeter離れた環境を確保するなど、常に十分な予防措置を講じてください。