2018年3月8日
膵微小血管バソモーション アイレット血液の分布を調節して膵島 β 細胞の生理学的機能を維持します。このプロトコルは、膵微小血管バソモーション生体内での機能の状態を確認して膵臓病に膵微小循環の貢献を評価するレーザーのドップラー モニターを使用して説明します。
この手順の全体的な目標は、膵島の機能状態を決定することです in vivo 関連疾患への影響を評価するために、膵島微小血管血管運動。この方法は、膵島微小血管の血管運動が病理学的状態に変化するかどうかなど、医療循環領域における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、糖尿病の発症に進化した機能的なメカ循環があることを実証したときでした。
この技術の主な利点は、臨床と実験室の両方の設定で、組織と臓器の微小血管血管運動の機能状態を評価できることです。この方法は、膵島関連疾患についての洞察を提供することができます。また、腎臓や網膜関連の微小血管疾患など、他のシステムにも適用できます。
この技術の応用は、微小血管血管運動の機能状態における傾向の性質を理解することにも及びます。一般に、この方法に不慣れな人は、実験中にレーザードップラーから得られる微小血管の学術データが大量にあるため、苦労するでしょう。この方法のデモンストレーションは、多くの要因が微小循環データの正確な収集に悪影響を与える可能性があるため、重要であることを確認してください。
このプロトコルは、マウスにSTZを毎日5日間連続して注射することから始まります。STZをクエン酸ナトリウム緩衝液に溶解し、5ミリグラム/ミリリットルの使用濃度にします。次に、1ミリリットルの注射器と25ゲージの針で腹腔内注射を行います。
マウスは注射の4時間前に絶食する必要がありますが、水へのアクセスは削除しないでください。対照マウスに同量の純粋なクエン酸ナトリウム緩衝液を注入します。注射後、マウスに通常の餌と10%のショ糖水を供給します。
STZを注入してから5日目以降、10%ショ糖水を通常の水と交換します。9日後、血糖値を検査します。まず、マウスを6時間絶食させ、水を無料で利用します。
次に、尾静脈から血液を採取し、標準のハンドヘルド血糖値計を使用して血液を測定します。血糖値が糖尿病患者1デシリットルあたり200ミリグラムを超えるマウスを考えてみましょう。レーザードップラー装置を使用する前に、まずプローブチップとプローブコネクタの光学面を柔らかい非研磨性の布で清掃し、次にケーブルを機器のポートに差し込みます。
次に、キャリブレーションスタンドを組み立てます。まず、保管したフラックス標準器を室温に戻します。これには約30分かかります。
次に、フラックススタンダードを10秒間静かに振とうし、キャリブレーションベースに2分間置きます。次に、クランプをできるだけ高く上げ、プローブをクランプに固定します。次に、プローブをフラックス標準器にゆっくりと沈め、プローブホルダーを使用してプローブを固定します。
続行するには、部屋の照明を暗くし、レーザードップラー装置のキャリブレーションを押します。次に、プローブが接続されている作業チャネルを選択し、キャリブレーションプログラムを実行します。麻酔をかけたマウスを作業プラットフォーム上で仰臥位に置き、サージカルテープで固定します。
次に、子宮頸部から尾部まで腹部の皮膚を75%エタノールで滅菌し、中央に幅3センチの穴が開いている乾燥ガーゼスポンジで腹部の周囲を覆います。次に、鉗子で腹部の皮膚を持ち上げ、メスまたは皮膚はさみを使用して腹部の正中線に沿って最初の垂直切開を行います。次に、鉗子で下にある筋肉をつかみ、切開して腹腔に入ります。
臓器を傷つけないでください。腹腔を露出させるには、皮膚とその下の筋肉を胸の上で折りたたみ、次に鈍い鼻の鉗子を使用して膵臓と脾臓を優しく露出させます。次に、レーザードップラー装置の制御ソフトウェアで、新しい測定ファイルを作成し、接続されているモニターを構成します。
[一般]タブで、監視期間をフリーランに設定し、[LDF監視]タブに工場出荷時のデフォルトを使用します。次に、ディスプレイ設定ダイアログボックスを開き、適切なチャネルを選択します。次に、次のパラメーターを切り替えます:チャネルとラベル、単位、および色のデータソース、[次へ]をクリックします。
次に、ファイル情報ダイアログボックスに対象物と測定に関する識別情報を入力し、もう一度[次へ]をクリックして続行します。これで、設定が完了し、測定ウィンドウがポップアップ表示されます。次に、電極を膵臓から1ミリメートル以内に手動で進めます。
測定の精度は、プローブと膵島組織との間の距離に関連しています。血流の読み取りは、組織とプローブの間の1ミリメートルの隙間を注意深く接着しない限り、不正確になります。記録を開始するには、開始アイコンをクリックすると、微小血管血PUデータの保存が開始されます。
これを1分間行い、表示の圧縮ボタンと拡大ボタン、およびグラフトレースの高さの増加または減少ボタンを使用して、記録中に表示される効果を調整し、記録を停止します。次に、ファイルを適切な名前で保存します。次に、プローブを手動で再配置して、相加効果と収縮能力と緩和能力の局所的な消耗を回避します。
全体として、各マウスの膵臓上の3つのランダムな点からPUデータを収集します。実験中のある時点で、無反射プレートからのPUデータを測定し、ベースライン制御値を取得します。3つの測定を行った後、3-OH縫合糸を使用して筋肉層を閉じ、次に4-OH縫合糸を使用して皮膚層を閉じます。
次に、マウスを回復ケージで監視し、清潔なホームケージに移す準備ができるまでマウスを監視します。一般に、膵島の微小循環状態は、周期的な収縮期と弛緩期で表されます。全体的な血行動態現象は、血流灌流のパターンを作り出します。
レーザードップラー装置を使用して、PUデータを収集し、非糖尿病マウスと糖尿病マウスの微小血管血液灌流の分布パターンを示しました。結果は全く違いました。膵島微小血管の収縮と弛緩のリズムは、STZ誘発性糖尿病マウスでは混沌としており、不規則であったが、非糖尿病対照ではリズミカルな振動が見られました。
次に、PUプロファイルを使用して血管運動を定量化しました。対照と比較して、STZ誘発性糖尿病マウスでは、膵島の微小循環の平均血液灌流が減少しました。これらのマウスはまた、この血管運動の振幅と頻度、および膵島への血液灌流の相対速度に有意な減少を示しました。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば30分で完了します。この手順を試みるときは、プローブと膵臓組織の間の距離が1ミリメートル以内であることを確認することを忘れないでください。不適切な距離は、血流の読み取り値を人為的に増加させたり減少させたりします。
この手順に続いて、虚血の視覚化、血流評価、微小血管血管運動評価の機能状態などの追加の質問に答えるために、レーザースペックルや酸素の移動などの他の方法を実行できます。その開発後、この技術は、内分泌学と代謝の分野の研究者や臨床医が膵島関連疾患の背後に隠された微小循環メカニズムを探求する道を開きました。レーザー機器での作業は、放射線被曝のために非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、環境側が目から少なくとも200ミリメートル離れているなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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本プロトコルでは、膵島微小血管の血管運動の機能的状態をin vivoで評価する方法について概説します。このプロセスを理解することは、膵臓関連疾患におけるその役割を評価する上で極めて重要です。
膵島の微小血管血管運動(バソモーション)を評価することで、微小循環の健全性に関する機能的な情報を得ることができ、糖尿病や膵炎の研究における標的検証に役立てることが可能です。振幅、周波数、灌流などの血管運動パラメータを定量化することで、血管機能不全を膵島の病理生理学的に結びつけ、メカニズムに基づいたリスク低減が可能になります。このアプローチは、下流の標的に決定する前に、疾患の進行に対する血管の寄与を特定することで、初期探索における予測の信頼性を高めます。
本手法は、分子生物学的および組織学的なエンドポイントを補完する機能的な血管データを提供することで、標的同定から前臨床検証に至るディスカバリー・コンティニュアム(創薬の連続的プロセス)に適合します。