Name: タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: 学ぼう、水平ネイティブゲル電気泳動を用いたRNA-タンパク質相互作用の解析法。電気泳動中に複合体形成をリアルタイムでモニタリングでき、48サンプルを同時に分析可能です。RNA生化学研究に有用です。

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フィギュアを準備してくれたLaura Vanderploegに感謝します。 Sheetsラボでの作業は、NSFグラント1050395とNIHグラント（R21HD076828）によってサポートされています。 Ryderラボの研究は、NIHグラントR01GM117237とR01GM117008によってサポートされています。 Megan Dowdleは、国立衛生研究所（T32GM008349）の全米医科学研究所を通じて、ウィスコンシン大学マディソン大学院大学およびバイオテクノロジー訓練プログラムを通じて、SciMed GRS Advanced Opportunity Fellowshipの支援を受けています。

水平ネイティブポリアクリルアミドゲルの調製4 。 <ol><li> 必要な材料の準備。 <ol><li>水平ゲル装置の場合は、27cm×21cmのトレイを備えたゲルボックス（37cm×24cm）を使用し、2つの24ウェルコームの容量を使用します。この設定では、合計48個のサンプルを同時に分析できます。 </li><li> 40％アクリルアミド - ビス19：1,5x TBE（Tris-ボレート-EDTA pH8.0）、TEMED、および10％APS（過硫酸アンモニウム）の試薬を調製する。 </li></ol></li><li> 10％天然アクリルアミドゲルの生成。 <ol><li> 500mLのフラスコに、80mLの5×TBE、100mLの40％アクリルアミド、および水を最終容量400mLまで加える。 </li><li> 10％APS 4mLとTEMED400μLを加える。よく混ぜます。 </li><li>混合物を水平キャスティングトレーに注ぎ、ゲルを30分間重合させる。ゲルの厚さは約2cmです。 注：ゲルはヒュームフードでキャストしてスピードを上げることができます重合を開始する。重合後、薄い液体層がゲルの上に残る。 </li><li>液体を注ぎ、ランニングバッファーですすいでください。慎重に櫛を外し、シリンジを使用してランニングバッファーでウェルをリンスします。 </li></ol></li><li> ランニングバッファーの準備。 <ol><li>ゲルボックス用の1x TBEランニングバッファー2 Lを調製する。 400mLの5XTBEを1600mLで希釈し、混合する。冷たい部屋に1x TBE緩衝液を入れて冷ます。 </li></ol></li><li> ゲルのプレ - ランニング <ol><li> 2Lの冷たいランニングバッファーをゲルボックスに加え、ゲルを挿入する。 </li><li>冷たい部屋で4℃、1時間、120Vでゲルをプレランします。この間、結合反応を準備する。 </li></ol></li></ol> 2.結合反応8 <ol><li> 2.1。以下の反応成分を調製する。 20mM DTT 10mM BSA 10mM酵母tRNA 5X結合緩衝液（50mM HEPES pH8.0,5mM EDTA、25μl0mM KCl、0.2％Tween-20） 市販されている100nMフルオレセイン標識RNA 濃縮されたBicaudal-Cタンパク質 DEPC処理H 2 O中の50％グリセロール DEPC処理H 2 O </li><li> 結合反応成分をRNaseフリーの微量遠心チューブに集める。 <ol><li>チューブに、5μLの10mM BSA、5μLの20mM DTT、5μLの10mM酵母tRNA、10μLの5×Binding Bufferを加えます。 </li></ol></li><li>タンパク質を50μL中250nMの最終濃度に添加する。 45μLの最終容量に水を加える。 </li><li> 5μLの蛍光標識RNA基質を添加する。市販の3 &#39;フルオレセイン標識32-ヌクレオチド基質を使用する。 </li><li>混合し、室温で30分間暗所でインキュベートする。 </li></ol> 3.ネイティブ水平ポリアクリルアミドゲル上の試料の分析<ol><li>各反応に、50μLのグリセロール15μLを添加し、穏やかに混合する。 </li><li>ケアフー各反応液30μLをゲルに加える。単一のウェルに充填することができる試料の量は、ゲルの厚さおよびウェルのサイズに依存して変化する。私たちは、24ウェルの櫛で作製したゲルの1ウェルに、15μLと45μLという少量を充填し、2cmの厚さに注いだ。 </li><li> 電源をゲル装置のスイッチに接続して電源を入れ、電圧を調整します。ゲルを4℃、120Vで反応させる。 注：水平ゲル装置の場合、これは約5V / cmになる。縦型ゲル装置の場合、これは16V / cmである。 <ol><li>蛍光標識されたRNAの損傷または漂白を防ぐために、暗所で電気泳動を行います。 </li><li>分析されるRNA-タンパク質複合体の特性に応じて電気泳動時間を変化させる。 注：水平EMSA分析の主な利点は、電気泳動を停止し、ゲルを画像化し、次にゲルlを装置に戻すことができ、電気泳動をより長い時間続けることができる。 </li></ol></li></ol> 4.ゲルのイメージング<ol><li>蛍光基質の検出とイメージング用に設計された任意の機器で分析を行います。 </li><li>イメージャにゲルを置きます。 </li><li>イメージャの設定を調整します。フルオレセイン標識RNAリガンドについては、以下の設定を用いる：FAM（波長473nm）、750光電子増倍管電圧（PMT）、100μmピクセルサイズ。 </li><li>ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。 </li></ol>

<ol><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li>
<li>Dahlberg, A. E., Dingman, C. W., Peacock, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+characterization+of+bacterial+polyribosomes+in+agarose-acrylamide+composite+gels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic characterization of bacterial polyribosomes in agarose-acrylamide composite gels.</a> J Mol Biol. 41 (1), 139-147 (1969).</li>
<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+mobility+shift+assay+%28EMSA%29+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat Protoc. 2 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Pagano, J. M., Farley, B. M., Essien, K. I., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+recognition+by+the+embryonic+cell+fate+determinant+and+germline+totipotency+factor+MEX-3%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">RNA recognition by the embryonic cell fate determinant and germline totipotency factor MEX-3.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (48), 20252-20257 (2009).</li>
<li>Royer, C. A., Scarlata, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+approaches+to+quantifying+biomolecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence approaches to quantifying biomolecular interactions.</a> Meth Enzymol. 450, 79-106 (2008).</li>
<li>Su, C., Wang, F., Ciolek, D., Pan, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoresis+of+proteins+and+protein-protein+complexes+in+native+polyacrylamide+gels+using+a+horizontal+gel+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Electrophoresis of proteins and protein-protein complexes in native polyacrylamide gels using a horizontal gel apparatus.</a> Anal Biochem. 223, 93-98 (1994).</li>
<li>Buczek, P., Horvath, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+Characterization+of+Binding+Oxytricha+nova+Single+Strand+Telomere+DNA+with+the+Alpha+Protein+N-terminal+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic Characterization of Binding Oxytricha nova Single Strand Telomere DNA with the Alpha Protein N-terminal Domain.</a> J Mol Biol. 359 (5), 1217-1234 (2006).</li>
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<li>Saffman, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+translation+of+oskar+in+oocytes+lacking+the+RNA-binding+protein+bicaudal-C%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Premature translation of oskar in oocytes lacking the RNA-binding protein bicaudal-C.</a> Mol Cell Biol. 18 (8), 4855-4862 (1998).</li>
<li>Chicoine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+recruits+CCR4-NOT+deadenylase+to+target+mRNAs+and+regulates+oogenesis%2C+cytoskeletal+organization%2C+and+its+own+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C recruits CCR4-NOT deadenylase to target mRNAs and regulates oogenesis, cytoskeletal organization, and its own expression.</a> Dev Cell. 13 (5), 691-704 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal-C+spatially+controls+translation+of+vertebrate+maternal+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Bicaudal-C spatially controls translation of vertebrate maternal mRNAs.</a> RNA. 19 (11), 1575-1582 (2013).</li>
<li>Maisonneuve, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bicaudal+C%2C+a+novel+regulator+of+Dvl+signaling+abutting+RNA-processing+bodies%2C+controls+cilia+orientation+and+leftward+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Bicaudal C, a novel regulator of Dvl signaling abutting RNA-processing bodies, controls cilia orientation and leftward flow.</a> Development. 136 (17), 3019-3030 (2009).</li>
<li>Tran, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA-binding+protein+bicaudal+C+regulates+polycystin+2+in+the+kidney+by+antagonizing+miR-17+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The RNA-binding protein bicaudal C regulates polycystin 2 in the kidney by antagonizing miR-17 activity.</a> Development. 137 (7), 1107-1116 (2010).</li>
<li>Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+approaches+to+monitor+protein-nucleic+acid+interactions+using+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes.</a> RNA. 17 (1), 14-20 (2011).</li>
<li>Foley, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+to+Enable+the+Pharmacological+Profiling+of+Small+Molecules+in+Gel-Based+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Platform to Enable the Pharmacological Profiling of Small Molecules in Gel-Based Electrophoretic Mobility Shift Assays.</a> J Biomol Screen. 21 (10), 1125-1131 (2016).</li>
</ol>

著者は何も開示することはない。

ネイティブポリアクリルアミドゲルは、タンパク質-RNA相互作用を調査し、伝統的に、これらのゲルを上下に2、3電気泳動するための貴重なツールです。我々が作成され、水平方向に1、4、6、7、15電気泳動ネイティブポリアクリルアミドゲルを代入プロトコルの変形を使用しています。蛍光標識されたRNA基質と組み合わせて使用​​されるこれらの変化は、タンパク質-RNA結合相互作用の生化学分析に多数の利点を提供する。これらの利点には、緩衝液を下部チャンバから上部に移すためにポンプを必要とする垂直装置と比較して、緩衝液の混合が単純化されており、水平のゲルは、水平ゲル電気泳動は、しばしば、垂直ゲルと比較してRNA-タン...

電気泳動移動度泳動シフトアッセイ（EMSA）は、特定のタンパク質-核酸相互作用1、2、3を分析するための貴重な生化学的ツールであることが証明されています。これらのアッセイは、核酸 - タンパク質複合体1の成分化学量論であるRNAまたはDNA 3に対するタンパク質の結合親和性に関する重要な情報を提供し、基質競合実験1を介したRNA結合タンパク質の結合特異性に関する重要な新しい洞察を提供する。 これらのアッセイのための従来の実験装置は、精製されたタンパク質を放射性標識されたRNA基質と混合することからなる。次いで、得られた複合体を、2つのガラスプレートの間に注がれた非変性（天然）ポリアクリルアミドゲルで分析し、次いで垂直装置3でサンプル電気泳動を行う。このアプローチは、タンパク質の核酸への結合の基礎をなす生化学的メカニズムにおける重要な洞察を提供するために徹底的に使用されてきたが、いくつかの制限もある。例えば、この基本戦略はスループットが比較的低く、多くの結合反応を並行して分析する必要がある用途には容易に適応できない。加えて、従来の縦型装置では、潜在的に電気泳動図3、 図4中に複数回に錯体を監視することが困難です。 ここでは、フラットベッド装置で鋳造ネイティブポリアクリルアミドゲル、水平電気泳動および蛍光標識されたRNA基質4、5、6、7を使用するEMSAアッセイの適応を提示します。これらの比較的簡単な変更を基本的なひずみに組み込むことtegyはいくつかの強力な利点を提供します。特に、水平フラットベッドフォーマットは、数十のサンプルを同時に分析するのに適しています4 。また、Bicaudal-Cタンパク質とそのRNA基質との間に形成されるRNA-タンパク質複合体の場合、水平ゲル中での電気泳動は、異なるRNA-タンパク質複合体を分離し、これらを非結合RNA基質から区別する能力を高める。

<table><tbody><tr><td>ホリゾンタルジェルボックス</td><td>OWL</td><td>N/A</td><td>製品はもう製造されていません。同様のゲルボックスは、Thermo Scientific の A シリーズゲルボックスでも見つけることができます。カタログ番号:A2-BP</td></tr><tr><td>24ウェル大型大型水平ゲル電気泳動コームフ</td><td>クロウ</td><td>N / A</td><td>製品はもう作られていません。同様のジェルボックスは、Thermo ScientificのAシリーズゲルボックスコームで見つけることができます。カタログ番号: A2-24C</td></tr><tr><td>Powerpac 300</td><td>Bio-Rad</td><td>1655050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean II 電気泳動細胞</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2940</td><td></td></tr><tr><td>InstaPAGE-19 40% 19:1 アクリルアミド/Bis</td><td>IBI</td><td>IB70015</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>IBI</td><td>IB70120</td><td></td></tr><tr><td>APS</td><td>IBI</td><td>IB70080</td><td></td></tr><tr><td>酵母 tRNA</td><td>Ambion</td><td>AM7119</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン標識 RNA</td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>注文は、長さと希望の配列にカスタムすることができます</td></tr><tr><td>EDTA四ナトリウム塩水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5391-1KG</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース 超高純度</td><td>US バイオロジカル</td><td>T8600</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP366-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>3483 12 3</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td> <td>シグマ・アルドリッチ</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質-rna複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Horizontal Gel Electrophoresis for Enhanced Detection of Protein-RNA Complexes

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用の生化学的分析に広範に使用されている分子生物学の基本的ツールである。これらの相互作用は、伝統的に、2枚のガラスプレートの間に生成されたポリアクリルアミドゲルおよび垂直に電気泳動されたサンプルで分析されてきた。しかし、ポリアクリルアミドゲルは、トレイにキャスティングされ、水平に電気泳動されると、いくつかの利点をもたらす。例えば、蛍光RNA基質と特定のタンパク質との間の複合体を分析するために使用される水平ゲルは、電気泳動が進行するにつれて複数回画像化することができる。これは、実験中のいくつかの時点でRNA-タンパク質複合体をモニターする独特の機会を提供する。さらに、水平ゲル電気泳動は、多数の試料を並行して分析することを可能にする。これは、時間経過の実験を大幅に促進するだけでなく、複数の反応を同時に分析して、異なる成分および条件を比較することができる。ここで私たちはprRNA-タンパク質相互作用を分析するための水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコルを提供する。

水平ネイティブゲル電気泳動の力と汎用性を実証するために、我々はBicc1結合部位を含む蛍光標識されたRNAをアフリカツメガエル Bicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を分析しました。 Bicc1タンパク質は、動物の開発9の母体段階の間の細胞運命決定を制御するために、mRNAを特異的翻訳リプレッサーとして機能10、11、12、並びに成人13における特定の器官の機能、14。 Cripto-1 mRNAの8、12の3&#39;UTRから32ヌクレオチド領域： <e...

ネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動は、RNA-タンパク質相互作用を分析するための基本的なツールです。伝統的に、ほとんどの実験では垂直ゲルが使用されています。しかしながら、水平ゲルは、電気泳動の間に複合体をモニターする機会のようないくつかの利点を提供する。我々は、水平ネイティブゲル電気泳動を生成および使用するための詳細なプロトコールを提供する。

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

Native polyacrylamide gel electrophoresis is a fundamental tool of molecular biology that has been used extensively for the biochemical analysis of ...

このプロトコルの目的は、水平ネイティブゲル電気泳動を用いてRNAタンパク質相互作用を解析することです。この手法は、特定のRNAタンパク質相互作用の特性を定義するなど、RNA生化学における重要な疑問の解決に役立ちます。本手法の主な利点は、電気泳動中に複合体形成を複数回モニタリングできることです。水平ゲル電気泳動装置には、27 cm × 21 cmのキャスティングトレーを備え、24ウェルのコームを2本使用可能なゲルボックスを使用します。この設定により、合計48個のサンプルを同時に解析できます。5x TBE 400 mLを水1,600 mLで希釈し、混合して1x TBE走行バッファーを2 L調製します。TBEバッファーを冷室に置いて冷却します。標準的な手順に従い、40%アクリルアミド（19:1が最適）、5x TBE、TEMED、および10%過硫酸アンモニウムの各試薬を調製します。10%ネイティブアクリルアミドゲルを作製するには、500 mLフラスコに5x TBE 80 mL、40%アクリルアミド 100 mLを加え、最終容量が400 mLになるまで水を加えます。10%硫酸アンモニウムを4 mL、TEMEDを400 µL加え、よく混合します。混合液を水平キャスティングトレーに注ぎ、ドラフトチャンバー内で30分間静置してゲルを重合させます。重合したゲルの厚さは約2 cmとなり、ゲルの表面に薄い液層が残ります。ゲルをゲルボックスに入れ、低温室に運びます。次に、液体を捨て、ランニングバッファーで洗浄します。コームを慎重に取り除き、冷やしたランニングバッファー2 Lをゲルボックスに加え、シリンジを使用してウェル内をランニングバッファーで洗浄します。コールドルーム内で、ゲルを120 Vで1時間、4 °Cでプレランさせる。ゲルのプレラン中に、結合反応を準備する。RNAフリーのマイクロ遠心チューブに、以下の結合反応成分をこの順序で加える：10 mM BSAを5 µL、20 mM DTTを5 µL、10 mM 酵母tRNAを5 µL、5x 結合バッファーを10 µL、bicaudal-cタンパク質を最終濃度250 nMとなるように50 µLに、DEPC処理水を最終容量45 µLまで、そして蛍光標識RNA基質を5 µL。チューブを閉じて軽く弾いて混ぜ合わせ、短時間遠心分離し、室温の暗所で30分間インキュベートします。結合反応が完了したら、各反応液に50% glycerolを15 µL加え、穏やかに混ぜます。各反応液30 µLをゲルのウェルに慎重にロードします。1つのウェルにロード可能なサンプル量は、ゲルの厚さやウェルのサイズによって異なります。ゲル装置に電源を接続し、電源を入れ、電圧を120Vに調整して4°Cでゲル電気泳動を行います。蛍光標識したRNAの損傷や退色を防ぐため、電気泳動は暗所で行ってください。電気泳動時間は、解析対象となるRNAタンパク質複合体の詳細によって異なります。水平方向の電気泳動 mobility shift アッセイ分析の大きな利点は、ランが完了する前にゲル画像内で電気泳動を停止できることです。蛍光基質の検出用に設計された任意の装置を用いて分析を行ってください。蛍光標識リガンドの場合、イメージャーの設定を次のように調整してください。フルオレセインの波長を473 nanometers、光電子増倍管電圧を750 volts、ピクセルサイズを100 micrometersに設定します。ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。イメージング後、ゲルを装置に戻して、より長い時間電気泳動を継続することが可能です。Bicc1結合部位を含む蛍光標識Cripto1 mRNAへのゼノパスBicaudal-C（Bicc1）タンパク質の結合を、垂直および水平ネイティブゲル電気泳動の両方を用いて解析した。陰性対照として、Bicc1をCyclinB1 mRNA由来の蛍光標識RNAと混合させた。いずれの手法においても、Bicc1がCripto1 RNAに結合し、特異的な複合体を形成することが明確に示された。しかし、水平ゲルで解析した場合、Bicc1-Cripto1複合体はより顕著に分離され、検出が容易になるとともに、タンパク質-RNA複合体と未結合RNAとの識別が可能となった。イメージング後、ゲルを電気泳動装置に戻し、さらに3時間半電泳させた後、再度イメージングを行いました。ここで示されているように、複合体はさらに泳動しており、依然として容易に検出できたことから、その安定性が示されました。この手法に習熟し、適切に実施すれば、4〜5時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、水平ネイティブゲル電気泳動を用いてRNAタンパク質相互作用を解析する方法について十分に理解することができます。

horizontal-gel-electrophoresis-for-enhanced-detection-protein-rna

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

出典: Stenum, T. S. ら。 大 腸菌におけるトランスファーRNAの存在比および荷射レベルの定量化。 J. Vis. Exp. (2017年)このビデオでは、ゲル電気泳動とノーザンブロッティングを用いて、アミノアシル化型と脱アシル化型を分離することで大 腸菌...

大腸菌におけるtRNAチャージレベルを検出するためのゲル電気泳動およびノーザンブロッティング

このビデオでは、タンパク質の変性ポリアクリルアミドベースの分離技術を示しています。この手法は、分子量に基づくタンパク質の予備的な同定に役立ちます。...

タンパク質分析のためのドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動:分子量に基づいてタンパク質を分離し、可視化する技術

このビデオでは、ヒト非機能性下垂体腺腫(NFPA)の腫瘍組織から得られた複雑なタンパク質混合物から個々のタンパク質を分離する二次元ゲル電気泳動法を実演します。タンパク質は、最初の次元では電荷に基づいて分離され、さらに2番目の次元では分子量に基づいて分離されます。...

二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:電荷と分子量に基づく複雑なタンパク質混合物中のタンパク質の分析のための分離技術

このビデオでは、赤外線蛍光標識DNAプローブを使用してタンパク質-DNA相互作用を検出する電気泳動移動度シフトアッセイを実演します。タンパク質がDNAプローブに結合すると、大きな複合体が形成され、ゆっくりと移動し、ゲル上にシフトしたバンドとして現れます。...

転写因子-DNA複合体の検出のための電気泳動移動度シフトアッセイ

ここでは、RNA /タンパク質相互作用を分析するためのプロトコルを提示する。電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、ネイティブゲル電気泳動中のRNA /タンパク質複合体および遊離RNAの差動移動に基づいている。放射性標識RNAプローブを用いて、RNA /タンパク質複合体は、オートラジオグラフィーによって可視化することができる。...

IRE / IRP例：RNA  - タンパク質相互作用の研究のための電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）

ここで重要な生物学的質問に取り組むためのケーススタディとして、赤外蛍光色素標識DNAプローブと一緒に精製されたSOX-2タンパク質を用いた蛍光電気泳動移動度シフトアッセイ（FEMSA）の最適化されたプロトコルを記述します。...

赤外蛍光色素で標識されたオリゴヌクレオチドを使用したゲルシフトアッセイのために最適化されたプロトコル

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA...

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

sheathless多孔チップインタフェース設計を使用してキャピラリー電気泳動 - 質量分析法による生体試料の代謝プロファイリングのためのプロトコルが提供されます。...

生体試料の代謝プロファイリングのためのSheathlessキャピラリー電気泳動 - 質量分析法

この記事では、非変性PAGEとウェスタンブロット分析の組み合わせを使用して、ヒト細胞のライセートからのダイナミン様GTPase...

非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

学ぼう、水平ネイティブゲル電気泳動を用いたRNA-タンパク質相互作用の解析法。電気泳動中に複合体形成をリアルタイムでモニタリングでき、48サンプルを同時に分析可能です。RNA生化学研究に有用です。

タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

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