タンパク質-RNA複合体の検出を向上させるための水平ゲル電気泳動

このプロトコルの全体的な内容は、水平ネイティブゲル電気泳動を使用してRNAタンパク質相互作用を分析することです。この方法は、特定のRNAタンパク質相互作用の特性を定義するなど、RNA生化学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、電気泳動中に複雑な形成を複数回監視できることです。

水平ゲル装置には、27 cm x 21 cmのキャスティングトレイと2つの24ウェルコーム用の容量を備えたゲルボックスを使用します。このセットアップでは、合計48個のサンプルを同時に分析できます。400ミリリットルの5x TBEを1, 600ミリリットルの水で希釈し、混合することにより、2リットルの1x TBEランニングバッファーを準備します。

TBEバッファーを冷蔵室に置いて冷まします。標準的な手順に従って、40%アクリルアミドベスト19:1、5x TBE、temed、および硫酸塩あたり10%アンモニウムの試薬を準備します。10%ネイティブアクリルアミドゲルを作るには、500ミリリットルのフラスコに以下を追加します:80ミリリットルの5x TBE、100ミリリットルの40%アクリルアミド、および水で最終容量400ミリリットルにします。

硫酸塩あたり10%アンモニウムを4ミリリットル加え、400マイクロリットルのテメドを加えてよく混ぜます。混合物を水平キャスティングトレイに注ぎ、ゲルをヒュームフード内で30分間重合させます。重合ゲルの厚さは約2センチメートルで、ゲルの上に薄い液体の層が残ります。

ジェルをジェルボックスに入れ、冷蔵室に持って行きます。次に、液体を注ぎ、ランニングバッファーですすいでください。コームを慎重に取り外し、2リットルのコールドランニングバッファーをゲルボックスに加え、シリンジを使用してランニングバッファーでウェルをすすぎます。

ゲルを120ボルトで摂氏4度で1時間、冷蔵室で事前に分析します。ゲルをプレランしている間に、結合反応を調製します。各RNAフリー微量遠心チューブに、以下の結合反応成分をこの順序で追加します:5マイクロリットルの10ミリモルBSA、5マイクロリットルの20ミリモルDTT、5マイクロリットルの10ミリモル酵母tRNA、10マイクロリットルの5倍結合バッファー、バイコーダルCタンパク質の最終濃度を50マイクロリットルに250ナノモル、DEPC処理水の最終容量を45マイクロリットル、蛍光標識RNA基質5マイクロリットル

チューブを閉じ、静かにフリックして混合し、チューブを短時間遠心分離し、室温で30分間暗所でインキュベートします。結合反応が完了したら、各反応に50%グリセロールを15マイクロリットル加え、穏やかに混合します。各反応液30マイクロリットルをゲルのウェルに慎重にロードすると、ゲルの厚さやウェルのサイズによって、1つのウェルにロードできるサンプルの量が異なります。

ゲル装置への電源供給は、電源を入れ、電圧を120ボルトに調整し、ゲルを摂氏4度で実行します。蛍光標識されたRNAの損傷や漂白を防ぐために、暗闇で電気泳動を行います。電気泳動の時間は、分析するRNAタンパク質複合体の特性によって異なります。

水平電気泳動移動度シフトアッセイ分析の主な利点は、ランが完了する前に電気泳動をゲル画像で停止できることです。イメージング蛍光基質を検出するために設計された任意の装置で分析を実行します。イメージャーの設定を調整し、蛍光標識されたリガンドの場合は、次の設定を使用します。

フルオレセイン波長は473ナノメートル、光電子増倍管電圧は750ボルト、ピクセルサイズは100マイクロメートルです。ゲルをスキャンして画像をキャプチャします。イメージング後、ゲルを装置に戻し、電気泳動を長時間続けることができます。

Xenopus bicaudal−CまたはBicc1タンパク質の蛍光標識Cripto1結合部位を含むCripto1 mRNAへの結合を、垂直および水平の両方のネイティブゲル電気泳動により解析し、ネガティブコントロールとして、Bicc1をCyclinB1 mRNAに由来する蛍光標識RNAと混合した。どちらの方法を使用しても、Bicc1がCripto1 RNAに結合して特定の複合体を形成することは容易に明らかでした。しかし、Bicc1、Cripto1複合体は、水平ゲルで分析すると有意に明確になり、検出が容易になり、タンパク質RNA複合体と非結合RNAの識別が可能になりました。

イメージング後、ゲルをゲル装置に戻し、さらに3時間半電気泳動し、再イメージングした。ここに示すように、複合体はさらに移動し、まだ容易に検出可能であり、その安定性を示しています。一度習得すると、このテクニックは適切に実行されれば、4〜5時間で実行できます。

このビデオを見れば、水平型ネイティブゲル電気泳動を使用してRNAタンパク質相互作用を解析する方法を十分に理解できるはずです。