蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動
2017年10月24日
相分離巨大リポソーム (Guv) 実験は頻繁生理的水条件を無視します。この作品は、膜ソリューションの非対称性と温度の関数として多成分荷電の膜の液-液相分離の高塩分濃度の緩衝効果を研究するアプローチを提示します。
このプロトコルの全体的な目標は、生理学的条件で見られる高塩分環境と膜貫通溶液の非対称性が膜相状態に及ぼす影響を定量的に評価することです。細胞内と細胞外の溶液は大きく異なります。私たちの方法は、溶液のアシンメトリーがメンブレンの特性と相挙動に及ぼす影響を理解するのに役立ちます。
私たちのアプローチの主な利点は、生理学的緩衝条件で小胞を調製でき、マイクロ流体デバイスを使用して非対称緩衝条件を作成できることです。手順を開始するには、PTFEプレートの片側を細かいサンドペーパーで粗くします。プレート、15ミリリットルのガラスバイアル、密封可能なガラス容器を市販の食器用洗剤、エタノール、クロロホルムで洗浄します。
25マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、10〜15マイクロリットルの脂質ストックをクロロホルムで清潔で乾燥したPTFEプレートの粗い面に沈着させます。脂質ストックをシリンジ針で広げて、均一な脂質膜を作成します。ピンセットを使用して、プレートを15ミリリットルのバイアルに移します。
プレートを摂氏60度に加熱し、2時間乾燥させて溶媒を蒸発させます。次に、脱イオン水をガラス容器に約1cmの高さまで加えます。バイアルをプレートと一緒に容器にセットし、安定して直立していることを確認し、容器を密封します。
脂質二重層を摂氏60度で4時間事前に膨潤させます。次に、バイアルを容器から取り出します。プラスチックシリンジに膨潤液5ミリリットルを注ぎ、シリンジの先端に0.45マイクロメートルのフィルターを取り付けます。
ろ過した膨潤溶液をバイアルに加えて、脂質フィルムを水和させます。バイアルにキャップをし、バイアルをプラスチックパラフィンフィルムで密封します。バイアルを摂氏60度で一晩保存して、GUV凝集体を取得します。
火から下ろしてから1時間以内に小胞を室温まで冷却します。200マイクロリットルのプラスチック製マイクロピペットチップの端を切り取り、GUV骨材をチップに引き込むことができるようにします。トリミングされたピペットチップを使用して、骨材と50マイクロリットルの膨潤溶液を清潔で乾燥した2ミリリットルのバイアルに移します。
バイアルに950マイクロリットルの新鮮な膨潤溶液または等張性溶液を加えて、それぞれ対称または非対称の溶液条件を達成します。混合物をピペットで上下に動かし、バイアルを数回静かに反転させてGUVを再懸濁します。評価を開始するには、顕微鏡スライドのシリコーンアイソレーターにGUV懸濁液のアリコートを置きます。
チャンバーをカバースリップで密封します。サンプルを5分間再平衡化します。次に、スライドを蛍光顕微鏡のサンプルステージに置き、バッチあたり少なくとも30個のGUVの画像を取得します。
イメージを調べて、イメージ GÜV の位相状態を判断します。単一液相状態のGUVは球状で滑らかで、蛍光標識が膜全体に均一に分布しています。液体で秩序立った無秩序な二相状態の GUV は球形になり、膜内の滑らかな境界を持つドメインに分割された蛍光標識があります。
ドメインが小胞表面上で自由に拡散し、合体できることを確認します。二相または三相の固液相状態のGUVは、いくつかの角度境界で丸められます。固体の背景上の液体ドメインは拡散を表示しないでくださいが、固体ドメインは液体の背景上で自由に拡散する必要があります。
各画像GUVの位相状態が特定されたら、バッチの支配的な位相状態を決定します。ドミナントフェーズの状態が僅差のマジョリティである場合は、独立したサンプルでこのプロセスを繰り返します。マイクロ流体デバイスを使用する前に、ショ糖と塩の膨潤溶液をそれぞれ少なくとも5ミリリットル調製してください。
各溶液を0.45マイクロメートルのフィルターでろ過します。次に、200マイクロリットルのプラスチックピペットチップの端を切り取り、デバイスの各チャネルにピペットチップを配置します。GUVの調製に使用したのと同じタイプの新鮮な濾過膨潤溶液100マイクロリットルを装置リザーバーに加える。
各ピペットの先端に5マイクロリットルの膨潤液を追加します。デバイスをGの900倍で10分間遠心分離し、デバイスのチャネルを満たします。次に、1ミリリットルのガラスシリンジに同じろ過された膨潤溶液を入れます。
長さのチューブをシリンジに接続します。プランジャーが完全に押し下げられ、チューブが溶液で満たされるまで、膨潤液をチューブに押し込みます。次に、チューブを出口チャネルに接続し、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。
次に、圧力制御ユニットをマイクロ流体チャネルインレットに接続します。バルブが閉じていることを確認してから、圧力を3バールに設定します。マイクロ流体デバイスを倒立共焦点顕微鏡のサンプルステージに置きます。
ピペットを使用して、25〜50マイクロリットルの溶液が残るまで、デバイスのリザーバーから膨潤溶液を取り除きます。150マイクロリットルのGUV懸濁液をリザーバーに加え、懸濁液を穏やかなピペッティングで混合します。シリンジポンプを引き出しモードで毎分10マイクロリットルで20分間、またはデバイストラップの90%以上が占有されるまで運転します。
次に、圧力制御ユニットのバルブを開いて、マイクロ流体デバイスのリングバルブを閉じます。シリンジポンプを停止し、デバイスを1時間放置してから、デバイス内のGUVの共焦点画像を取得します。次に、ピペットを使用してGUV懸濁液をリザーバーから取り外し、25〜50マイクロリットルだけを残します。
他の種類の濾過膨潤溶液を150マイクロリットルをリザーバーに加え、混合物を静かに上下にピペットで動かします。このプロセスを少なくとも5回繰り返して、リザーバー内の溶液を完全に交換します。シリンジポンプを引き出しモードで毎分10マイクロリットルで10分間運転し、マイクロチャネル内の溶液を交換します。
次に、流量を1分あたり1マイクロリットルに減らします。圧力制御ユニットのバルブを2秒間閉じてから、バルブを開いてシリンジポンプを停止します。デバイスを1時間放置してから、共焦点画像を記録します。
温度制御チャンバーの準備を開始するには、まず、厚さ2mmのカバースリップ窓を備えたアルミニウム製熱流アセンブリに有刺鉄線チューブ継手を取り付けます。カバースリップの1つにゴム製のスペーサーを取り付けて、観察室を形成します。100マイクロリットルのGUVサスペンションを観察室に装填し、カバースリップでチャンバーを密閉します。
アセンブリをゆっくりと反転させます。アルミニウムチャンバーを外部ウォーターバスに接続します。アセンブリを顕微鏡サンプルステージに取り付けます。
外部ウォーターバスを希望の最低温度に設定し、システムを10〜15分間平衡化させます。GUVの画像を取得し、さまざまな温度での相状態を決定します。GUVは、対称ショ糖または塩溶液中のDOPGと卵スフィンゴミエリン、およびコレステロールのさまざまな比率から調製されました。
それらの支配的な相状態は、蛍光顕微鏡法によって決定されました。次に、選択した組成物を希釈によって非対称条件に移し、相挙動に対する有効な溶液条件を評価しました。非対称溶液におけるGUV相の挙動をさらに調査するために、GUVをマイクロ流体デバイスに閉じ込めて、外部溶液の完全な交換を可能にしました。
トラップされたGUVは、流体交換の前後に共焦点顕微鏡法によって評価されました。均一から相分離されたGUVの割合をさまざまな温度で監視し、GUV相の挙動に対する有効温度を評価しました。データにはシグモイドパターンが観察され、それをボルツマンモデルに当てはめました。
位相分離GUVの割合が0.5であった温度は、適合曲線から決定されました。この方法は膜相の挙動に関する洞察を提供しますが、このアプリケーションは、生理学的条件での生体分子内の膜間の相互作用を研究するなど、他の実験にも使用できます。
概要
この研究は、高塩分バッファー条件が帯電した多成分巨大単層リポソーム（GUV）の液液相分離に与える影響を調査します。この研究は、膜特性を理解する上で、膜貫通溶液の非対称性と温度が重要であることを強調しています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 膜生物学
背景
- 巨大単層リポソーム（GUV）は膜力学を研究するためのモデルシステムです。
- 生理学的条件は実験設定とは大きく異なることがよくあります。
- 膜の相挙動を理解することは、細胞プロセスへの洞察を得るために重要です。
- 高塩分環境は膜の特性と相状態を変化させる可能性があります。
研究目的
- 高塩分と膜貫通溶液の非対称性が膜相状態に与える影響を定量的に評価すること。
- 生理学的バッファー条件下でGUVを調製する手法を開発すること。
- 溶液の非対称性が膜特性と相挙動に与える影響を探ること。
使用した方法
- PTFEプレート上にリピッド膜を調製し、水和させてGUVを形成すること。
- マイクロ流体デバイスを使用して非対称バッファー条件を作り出すこと。
- 蛍光顕微鏡を使用してGUVの相状態を評価すること。
- 蛍光分布に基づいて相状態の定量分析を行うこと。
主な結果
- GUVは溶液条件に基づいて異なる相状態を示します。
- 相挙動は塩分と膜貫通非対称性の両方によって影響を受けます。
- 開発された方法により、生理学的条件下での制御実験が可能になります。
- 結果は細胞環境に関連する膜力学に関する洞察を提供します。
結論
- この研究は、膜研究における生理学的条件の重要性を強調しています。
- GUVの相分離を理解することで、細胞膜の研究に情報を提供できます。
- 将来の研究では、これらの方法を基に複雑な生物学的システムを探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding membrane phase behavior under physiological solution conditions is critical for de-risking target validation in membrane-associated drug discovery. This protocol enables assessment of how high-salinity and transmembrane asymmetry influence lipid domain stability, providing predictive confidence in early-stage mechanistic studies. By modeling physiologically relevant membrane environments, the approach supports translational continuity from discovery to preclinical evaluation of compounds targeting membrane proteins or lipid-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how solution conditions modulate lipid raft formation, informing hypotheses about membrane protein localization and signaling complex assembly.
- Operational Value: Enables controlled testing of transmembrane asymmetry effects, reducing false positives in target engagement assays conducted under non-physiological buffer conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates phase-separated GUVs as reproducible models for evaluating compound partitioning into liquid-ordered or liquid-disordered domains.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation under symmetric or asymmetric high-salinity conditions, improving assay robustness for fluorescence-based membrane interaction screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links in vitro phase behavior to physiological relevance, supporting risk-adjusted advancement of leads whose activity depends on membrane microenvironment.
- Operational Value: Provides a scalable method to assess temperature-dependent phase transitions, enabling correlation with preclinical efficacy or toxicity signals under varying physiological conditions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where membrane target validation requires mechanistic de-risking of lipid-dependent mechanisms, particularly for targets implicated in lipid raft-mediated signaling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding how solution asymmetry influences domain formation and protein recruitment to specific lipid phases.
- Screening: Delivers assay-ready GUV populations with quantifiable phase states, enabling reliable comparison of compound effects across solution conditions.
- Analytics: Produces fluorescence-based domain partitioning metrics that help teams compare compound behavior in ordered versus disordered membrane phases.
- Translational Research: Connects GUV phase stability to physiological temperature and salinity ranges, informing preclinical model selection for membrane-targeted interventions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for evaluating membrane microenvironment effects across multiple projects, reducing redundant method development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by revealing how ionic strength and gradient conditions alter membrane material properties relevant to drug binding.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized GUV formation and solution exchange protocols, minimizing variability in membrane-based assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by identifying compounds whose activity is sensitive to physiological solution conditions, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of membrane-associated targets based on validated phase behavior under realistic extracellular and intracellular milieus.
Implementation Considerations
- Expertise in lipid film hydration, vesicle formation, and fluorescence microscopy interpretation is required to ensure accurate phase state assessment.
- Access to microfluidic systems and temperature-controlled chambers is necessary for implementing asymmetric solution conditions and thermal variation studies.
- Standardization across teams depends on consistent lipid composition, vesicle size selection, and imaging parameters to maintain comparability of phase state data.
- Adaptation to other model systems (e.g., different lipid mixes or protein-reconstituted vesicles) should consider potential alterations in phase transition temperatures and domain stability.
- Practical limitations include the need for careful avoidance of vesicle dilution during solution exchange and potential photobleaching during prolonged fluorescence imaging.
