Name: 蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぶ蛍光顕微鏡を用いた荷電巨大一重層ベシクル（GUV）の相挙動評価法。高塩濃度環境と膜内外溶液非対称性が膜相状態に与える影響を定量的に解析し、生理学的条件下での膜ダイナミクス理解に貢献します。

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この作品は、連邦教育省、ドイツ研究、マックス ・ プランク協会によって共同で資金が供給される MaxSynBio コンソーシアムの一部です。

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対称および非対称の高塩分濃度の条件下での位相状態観察の Guv の成功の生産
ここで紹介するプロトコルは、高塩分濃度のバッファーとソリューションの非対称性の組成物の広い範囲にわたって荷電膜の膜の相状態に及ぼす影響を評価するための戦略を紹介します。この目標の達成に向けた主要な課題の 1 つは、高塩分濃度バッファーで荷電膜の生産です。
ショ糖液とで塩分の高いバッファーで膜を生成される正常に堆積した脂質膜の前水和ステップおよび小胞の成長のための一晩の最終的な水分補給手順を含んだ単純な自発的な腫れアプローチで。ベシクルの収量にも脂質が広がっているように荒く PTFE 板に脂質沈着が行われることに注意してくださいすることが重要です。さらに、脂質膜が同種と流体の相州は温小胞準備中にすべてのステップを行うために不可欠です。他、小胞の人口構成の多と最終的な人口相の状態分析をバイアスします。一方で再取得する小さなボリュームで中断する可能性を提供する小胞塊 Guv 利回りの自発の腫れの特定のプロトコル高濃度分散液胞と非対称のソリューションを提供する一方、膜小胞8,28の希薄化を最小限に抑えながら条件。小胞希釈または外部のソリューション中に交換、内部と浸透圧の不一致による形態変化が誘発または Lo + Ld 相分離41を防ぐため、または低張の場合外 osmolarities まま一致するが肝要です。条件は、小胞が破裂する可能性があります。
PVA による腫れをもたらした多重層膜ベシクル中、高塩濃度の electroformation プロトコルを最適化しよう結果ない膜の生産に。にもかかわらず、自発的に準備時間が長くなると低品質10,17の小胞バッチの結果、荷電ベシクルの巧妙な生産が必要です腫れは付加的な利点が付属します。統計バッチ分析のための十分な収穫で、その結果、最小限の労力を要求し、electroformation とは異なり高度な機器や最適化は必要ありませんでした。さらに、脂質の酸化による汚染が観察されていない42,43。文献によると小胞の脂質組成とそれらが7,17が栽培された対応する株の違いはございません。さらに、PTFE 基板上小胞形成は外国の分子を基板23によって導入されるゲルによる腫れメソッドとは対照的に任意の汚染を含めることを要求されません。Electroformation は、非対称ソリューションの条件を作成するとき過剰な小胞の希釈に関連するそれ以上の欠点が付属します。Electroformation によって生成される膜 (自発的な腫れの中に形成される塊の形で高濃度小胞サスペンション) と対照をなして均一分散として通常存在しています。外部ソリューションの任意の希釈は実質的に同様の小胞数を希釈します。さらに、観察されたこの作品のコース上に高塩分濃度バッファーで希釈した場合不安定な DOPG/eSM/哲膜がショ糖の electroformation によって生成されることなった。蛍光顕微鏡スライドの脂質パッチからの目視検査が可能だった前に、小胞が破裂する示されています。このような不安定と思われる自発的な腫れ10によって得られるものと比較して electroformation により作製したベシクルの上昇した膜緊張します。
高率に部分的な外部ソリューション exchange それだけに実現している小胞希釈非対称 GUV ソリューションの条件を作成する簡単かつ迅速な方法ですが、(ここで: 95%、図 2) の痕跡を希釈時に、ソリューションを腫れが残ります。外部ソリューション exchange の程度の選択は、(セクション 2) の腫れのソリューションと共に小胞塊をピペッティングし、ないあまり希釈間のトレードオフです。したがって、迅速かつ完全な外部ソリューション exchange GUV 相状態観測中に希釈した位相状態の観察を確認することができます詳細37で他の所で説明した代替マイクロ アプローチを紹介小胞。対称非対称ソリューションの条件に変更する場合の位相状態変化の観察はことに同意確かに観察されました。両方の方法、非対称ソリューション条件表示ここでは、比較的簡単な (比較参考文献8) を生み出し、いいえ、知られているリスクの局所組成変化 (比較参照30,31) とさらに、膜張力 (比較参考32)、増加額又は局所加熱 (比較参照33)、別の方法としては、導入で説明されています。マイクロ トラップ中に小胞の内部と外部の浸透圧のバランスではない前述の相状態の成果物だけでなく、高張液条件によるデフレを避けるために唯一のエッセンシャルはスリップに閉じ込められた膜を引き起こす可能性があります。外部ソリューション交換後の記事。
ダイレクトオン/eSM/哲システムでは、その他の場合は、料金の不在からの小胞が GUV 個々 膜44 間の反発の結果の欠如による膨潤を損なう可能性がありますにもかかわらず、自発的な腫れは、非荷電成長に正常に適用されています。.あらかじめ腫れの期間延長またはかさばる脂質 headgroups を導入することは、この問題45をカウンター可能性があります。さらに、腫れに使用したものと異なるソリューションで、希釈後小胞の安定性は、異なる脂質組成と希釈のメディアは、我々 はここで検討していないため異なる場合があります。我々 はまた、紹介調製法と旦那の平均粒径を調整の可能性を検討していません。発泡組成やソリューションを膨潤などのパラメーターが結果に影響を与える可能性があります。代替方法46のアプリケーションは脂質およびここで使用されるソリューションの大きい小胞をもたらす可能性があります、しかし、彼らは、メソッドに関連付けられている他の欠点と来るかもしれない。対称および非対称の高塩分濃度条件で膜を生成する上記のアプローチは、異なる脂質組成から成り、別のメディアに分散した小胞のさらなる研究のため潜在的なツールを提供します。我々 はこれらの可能性を検討していないと、未来の試験は GUV 準備と希釈方法を適用可能性がありますどのように一般的に表示されます。
さまざまな温度で相分離を観察すること
さまざまな温度で膜を研究に適した異なった実験組み立ては存在します。これらの設定は、一般的、文献内で詳細に記載されていない、現在の仕事研究の適用の基本的なアセンブリを示します。
_content"> コントロール測定表示これ社内の設計および構築室の温度はサーモスタットによりきめ細かい制御が、チャンバー内の温度勾配は実験温度分解能内。それは実験熱条件がサーモスタットの読書の間の一貫性が保証されています。
広い温度範囲にわたって GUV 位相状態の評価、時に温度が変更された後は、観察された小胞は平衡も重要です。これを実現する方法の 1 つは、履歴を確認することです。ヒステリシスがある場合温度ステップを下げる必要がありますおよび/または平衡時間は増加します。この作品で制御は動作温度の範囲は 0 - 100 ° C に理想的に限定して確立水ベースのサーモスタットによってその温度としてこの範囲を展開する石油など他の温度制御の液体を使用するかなど、その他の設定を採用することによりペルチェ素子。実習では、動作温度は、可能な限り凝縮または蒸発によっても制限されます。さらに、温度室温から遠く離れて、観察室の間で定常状態温度勾配の発生に可能性が高くなります。また、撮像装置は、極端な温度で被害かもしれない。典型的な温度範囲脂質ベシクル研究 (~ 10-50 ° C7,9) 適切な観測装置の損傷考慮すべきが期待されていません通常。
小胞のドメイン観察成果物
ワイド フィールド蛍光顕微鏡を用いた観察成果物のソース数があります。まず、1 つは小胞段階状態の外観検査の適用されるオブジェクトの最大解像度rが脂質ドメインの検出限界を決定することに注意してくださいする必要があります。 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> λは、波長、NA は対物レンズの数値の絞り。X 倍率と緑色発光を検出する 0.6 NA 40 の典型的な目的光約 560 nm に達する光学解像度で ~0.6 μ m. したがって、フェーズ状態間で異なる特定の脂質の混合物から作られた小胞の比較研究条件は、同じ目的を同じ脂質混合物の使用にしてください。
他のアイテムは、励起光41への延長露出のため脂質光酸化の結果として脂質ドメインの出来事です。写真の損傷は、脂質の不飽和炭化水素鎖で優先的に発生します。実際には、いくつかの脂質組成の最初均質な小胞のようなドメイン形成後に観察されたここで励起光照射の長期間 (~ 30 s)。その問題に対抗するため励起光保たれた焦点を 1 つのビューのフィールドで相状態評価の数秒。したがって、DiIC18は、我々 の目的に適していた。他の染料は、ただし、可能性がありますはるかに敏感、励起光照射時間の短縮と低い励起強度で処理する必要があります。
小胞のピペット転送から機械的せん断応力は潜在的ドメインを一時的に、それにより歪曲明白な小胞の相挙動をミックスします。いくつかのバッチの異なる小胞は異なる相挙動を示した 0 分後と 5 分後ピペット顕微鏡 coverslip に転送します。また47の混合ドメインで発生するマイクロ流体デバイスにおける流体の流れによるせん断応力を示されています。小胞は、観察する前に平衡のための時間の十分な量の妨げられていない残っているべき。この研究内小胞マイクロ流体デバイスに閉じ込められて後の残された 1 h の妨げられていない小胞の読み込みと観察する前にソリューション交流。
核磁気共鳴分光法48や超解像顕微鏡技術49など代替方法、光の回折限界によって課された制限と同様に、上記の問題のいくつかを避けるために採用される可能性があります。
結論と展望
提示された作品は、高塩分の対称および非対称のソリューションの条件が膜相分離に及ぼす影響の解析は、一連のメソッドを示します。すべての提示されたメソッドは、他のアプリケーションに適しています。マイクロ流体デバイスは、たとえばドメイン形成と解決策の非対称性の誘導の時に消失の動力学を調査するためのプラットフォームを提供します。また、そのように塩分濃度の関数としてドメインの外観を検査できます。すべてのメソッドは、見て興味の他のソリューションを使用して相挙動に及ぼす影響にも使えます。

液-液相分離巨大リポソーム (Guv) 蛍光顕微鏡による微小ドメインの観測以来膜は脂質ラフト仮説1,2を調査するモデル システムとして使用されています。,3. 彼らの自立膜の細胞からの範囲にある、仮説のいかだを備えた細胞膜の適切な模倣です。このような膜に関する数多くの研究は、純粋な水、ショ糖や低塩分ソリューション4,5,6,7、8に分散した小胞で行われています。これらの条件も反映されません高塩分環境と膜ソリューション非対称性生体膜の生理学的に関連する暴露細胞のための条件は。
この仕事と私たちのグループ9から前の文書では、膜荷電成分 Guv の相状態を塩とソリューションの非対称性の存在の関数として調べた。Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG)、卵スフィンゴミエリン (eSM)、及びコレステロール (哲) (浸透圧 210 mOsm/kg) とショ糖液や高塩分濃度バッファー (100 mM の NaCl、10 mM トリス、pH 7.5、210 の比が異なる混合膜の調製mOsm/kg)。脂質の選択は、すでにこの混合6,8の相図で得られたデータによって正当化されました。
Guv の準備のためのメソッドの数は文献10、11,12で利用できる (ここで注意、水性相油ベースから脂質の転送を含むそれらを考慮13,14膜相挙動に影響を与えるかもしれない残りの石油留分の固有の危険のために)。高塩分濃度バッファーで膜の準備は、具体的な課題に関連付けられます。低いイオン強さの解決策は、については、electroformation 法15,16は、小さな欠陥10,17高収率で膜を準備する簡単な方法を示します。メソッドは、導電性表面 (電極) 脂質の層を堆積、それらを乾燥、交流電界の適用中に水溶液で潤いに基づいています。ただし、このメソッドは、調整塩は水溶液18,19にある必要があります。Electroformation による小胞の成長の原動力である高い伝導率20で妨げられる浸透16と見なされます。したがって、高塩分溶液中膜の electroswelling は、それは異なる塩濃度には腫れのソリューションの最適化を必要と簡単な方法ではありません。21,22を膨潤ゲルによる小胞は形成時間がさらに高速の electroformation の潜在的な代替です。(アガロースまたはポリビニル アルコール (PVA)) ゲルを基板として使用する場合、このアプローチは強化された脂質膜の水和に基づいています。これらのアプローチでは、ただし、場合 agarose ベース腫れ23および/または温度制限の PVA 系の腫れの場合と同様に膜の汚染のリスクが付いています。同様に、セルロース紙基板に膜を成長するプロトコル最近確立された24となっています。このメソッドの一般的な問題は、基板の純度を制御の欠如だけでなく、脂質の大量の使用。この作品の紹介、GUV の準備、すなわち、自発的な膨潤法25,26の最も伝統的な方法の利点を提示します。水蒸気雰囲気でその後腫れ腫れ解決する潤い疎油基基板上の脂質層を乾燥ので構成されます (図 1とプロトコルのセクションで詳細を参照してください)。このメソッドは小胞のサイズ分布の制御を提供していません、高分子基板またはマイクロ流体を意味する電界印加による生産を支援する、手法と比較して全体的に小さい小胞の結果します。しかし、小胞の品質とサイズはここで探検として膜の相状態の確認のために適切にあります。
同様に特定の課題に関連付けられて小胞膜ソリューション間の非対称性を作成します。一般的に使用される方法の 1 つは、目的の外部ソリューション27,28小胞懸濁液の直接希釈です。ただし、これも小胞の分布密度は低くなります。別の戦略は、ゆっくり Guv のソリューションは、フローセルの下部に決済周りの外部ソリューションを交換することで、送受信。不安も流れに小胞を失ったりしないように、低流量、応用8、このアプローチの時間非効率的なレンダリングです。さらに、これらのアプローチのどちらもは完全な外部ソリューション exchange を保証します。明白な解決策は、外部ソリューション交換中にそれらを失うことを避けるために小胞を固定化することです。例えば、ビオチン化膜は、ストレプトアビジン コーティングの表面の29につながれることができます。しかし、このアプローチは、付着の組成の変化につながる可能性があります、したがって非付着膜セグメント30,31。小胞の膜を課す結果をトラップする磁気のアプリケーションまたは電界は緊張32です。ハンドルを持つ必要があります小嚢をトラップする光ピンセットを用いた光担架の使用は局所加熱33を含む可能性があります (すなわちビーズ)、接続されています。膜のトラップは、最終剥離34なし白金線にそれらを成長することにより実現できます。これはただし、薄い脂質管 (テザー) によって分離され、通常ワイヤに接続されている小胞または他の小胞を得られます。
提示された作品は、前述の制限を克服するための戦略を強調表示します。最初自発の膨潤法適応、高塩分濃度バッファーで膜の生産用に最適化の詳細な説明を提案します。その後、単純な希釈やマイクロ流体デバイスの使用率によって非対称ソリューション条件を効率的に作成する 2 つのアプローチを紹介します。私たちの目標は、別のソリューションの条件で膜の膜相状態の解析は、後続のセクションは、統計解析に成功の条件と偽の分類を避けるため現在のヒントについて説明します。
温度変動下におけると同様、等温条件下で解析が行われました。温度 c 中管理を用い、実験的温度制御チャンバーの詳細については、ほとんど説明。ここでは、さまざまな温度条件で膜を観察する社内構築されたセットアップが表示されます。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジオレオイル-SN-グリセロ-3-ホスホ-(1'-RAC-グリセロール)、ナトリウム塩</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475C</td><td>DOPGと略される</td></tr><tr><td>鶏卵スフィンゴミエリン</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>860061</td><td>eSM</td></tr><tr><td>コレステロール(ヒツジウール、> 98%)</td>と略される <td>Avanti Polar Lipids</td><td>700000</td><td>Chol</td></tr><tr><td>と略される1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩</td><td>分子プローブ</td><td>D-282</td>は<td>、DiIC18</td></tr><tr><td>Chloroform、HPLCグレード(&ge; 99.8%)</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl(> 99.8%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl(37%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス(&ge; 99.9%)</td><td>Roth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ショ糖 (&ge; 99.5 %)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スレッドバイアル 45x27 mm、15 mL</td><td>キンブル</td><td></td><td>ソーダ 平底、白色スクリューキャップ</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td>メトラー・トレド</td><td>MP220</td><td></td></tr><tr><td>浸透圧計</td><td>ゴノテック</td><td>Osmomat030</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオオブザーバーD1</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP5</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 40x, 0.6 NA</td><td>ツァイス</td><td>LD アクロプラン</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 40x, 0.75 NA</td><td>ライカ</td><td>506174</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ 63x, 0.9 NA</td><td>ライカ</td><td>506148</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド, 56x26 mm, 0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml;ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、22x22 mm、0.17 &plusmn; 0.01 mm</td><td>Menzel-Gl&auml;aser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm "M"</td><td>Bremix Flexible Packaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &micro;mシリンジフィルター</td><td>GVS North America</td><td>Cameo 25AS, 1213723</td><td>アセテート, 滅菌済み</td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

相分離巨大リポソーム (Guv) と共存する出展液注文し、液体不規則ドメインが脂質ラフト仮説を調査する一般的な生物物理学的ツール。多くの研究は、しかし、生理学的なソリューションの条件の影響を無視します。そのアカウントの現在の仕事は dioleylphosphatidylglycerol、卵スフィンゴミエリンやコレステロールから成長して荷電膜の液-液相分離に及ぼす高塩分濃度のバッファーと膜ソリューションの非対称性を示します。等温およびさまざまな温度条件下での効果を調べた。
装置および対称および非対称の高塩濃度条件下での荷電ベシクル共存液体ドメインの安定性を監視するため該当する実験的戦略について述べる。これは、高温高塩分濃度バッファーで荷電成分 Guv の準備へのアプローチが含まれています。プロトコルは、小胞の希釈を最小限に抑えながら単純な希釈段階で外部のソリューションの部分的な交換を実行するオプションを必要があります。代替的アプローチは、完全な外部ソリューション exchange では、マイクロ流体デバイスを利用した提示されます。温度変動下における相分離ソリューションの効果を検討した.このため、基本設計と、社内の内蔵温度試験槽のユーティリティを提案します。それとそれらを回避する方法に落とし穴が関連付けられているはさらに、我々 GUV 位相状態の評価に反映します。

相分離巨大リポソーム (Guv) 実験は頻繁生理的水条件を無視します。この作品は、膜ソリューションの非対称性と温度の関数として多成分荷電の膜の液-液相分離の高塩分濃度の緩衝効果を研究するアプローチを提示します。

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

本プロトコルの総合的な目的は、生理学的条件に見られる高塩濃度環境および膜貫通溶液の非対称性が、膜の相状態に及ぼす影響を定量的に評価することです。細胞内液と細胞外液は大きく異なります。本手法は、溶液の非対称性が膜特性や相挙動に及ぼす影響を理解するのに役立ちます。本手法の主な利点は、生理的な緩衝液条件下でベシクルを調製でき、かつマイクロ流体デバイスを用いて非対称な緩衝液条件を作り出せることです。手順を開始するには、PTFEプレートの一面を細かいサンドペーパーで粗くします。プレート、15 milliliterのガラスバイアル、および密封可能なガラス容器を、市販の食器用洗剤、エタノール、およびクロロホルムで洗浄します。25 µLのガラスシリンジを用いて、クロロホルムに溶解した脂質ストック溶液10〜15 µLを、清潔で乾燥したPTFEプレートの粗い面に滴下します。シリンジの針で脂質ストック溶液を広げ、均一な脂質膜を作成します。ピンセットを用いて、プレートを15 mLバイアルに移します。プレートを60 °Cで加熱し、2時間乾燥させて溶媒を蒸発させます。次に、ガラス容器に脱イオン水を約1 cmの高さまで加えます。プレートを入れたバイアルを容器に入れ、安定して直立した状態であることを確認し、容器を密封します。脂質二重層を60 °Cで4時間予備膨潤させます。その後、容器からバイアルを取り出します。プラスチック製シリンジに膨潤液を5 mL吸引し、シリンジの先端に0.45 µmフィルターを取り付けます。濾過した膨潤溶液をバイアルに加え、脂質フィルムを水和させます。バイアルにキャップをし、パラフィンフィルムで密閉します。バイアルを60 °Cで一晩保存し、GUV凝集体を得ます。加熱から取り出した後、1時間以内にベシクルを室温まで冷却します。200 microliterのプラスチック製マイクロピペットチップの先端を切り取り、GUV凝集体をチップ内に吸い込めるようにします。切り取ったピペットチップを使用して、凝集体と50 microlitersの膨潤溶液を、清潔で乾燥した2 milliliterバイアルに移します。バイアルに、対称的または非対称的な溶液条件をそれぞれ得るために、新鮮な膨潤溶液または等張溶液を950 µL加えます。ピペッティングを行い、次にバイアルを数回ゆっくりと転倒混和してGUVを再懸濁させます。評価を開始するために、GUV懸濁液の一分画を顕微鏡スライド上のシリコンアイソレーターに配置します。カバーガラスでチャンバーを密閉します。サンプルを5分間再平衡化させます。その後、スライドを蛍光顕微鏡の試料ステージに設置し、1バッチあたり少なくとも30個のGUVの画像を撮影します。画像を確認し、GUVの相状態を判定します。単一液相状態のGUVは球形で表面が滑らかであり、蛍光ラベルが膜全体に均一に分布しています。液状秩序相と液状無秩序相の2相共存状態にあるGUVは球形であり、蛍光ラベルが膜内の滑らかな境界を持つドメインに分かれて分布しています。ドメインが小胞表面で自由に拡散し、合一できることを確認します。2相または3相の固液相状態にあるGUVは、一部に角ばった境界を持つ円形になります。固相の背景にある液相ドメインは拡散を示しませんが、液相の背景にある固相ドメインは自由に拡散するはずです。各画像内のGUVの相状態を特定した後、そのバッチにおける支配的な相状態を決定します。支配的な相状態が僅差である場合は、独立したサンプルを用いてこのプロセスを繰り返してください。マイクロ流体デバイスを使用する前に、スクロースおよび塩膨潤溶液をそれぞれ少なくとも5 mL準備してください。各溶液を0.45 µmフィルターでろ過します。次に、200 µLプラスチックピペットチップの先端をカットし、デバイスの各チャンネルにピペットチップを配置します。デバイスのリザーバーに、GUVsの作製に使用したものと同じ種類の、ろ過した新鮮な膨潤溶液を100 µL加えます。膨潤溶液を5 µLずつ各ピペットチップに加えます。デバイスを900 ×gで10分間遠心分離し、デバイスのチャネルを満たします。その後、同様にろ過した膨潤溶液を1 mLガラスシリンジに充填します。シリンジに一定の長さのチューブを接続します。プランジャーが完全に押し込まれ、チューブ内が溶液で満たされるまで、チューブを通して膨潤溶液を注入します。その後、チューブを出口チャンネルに接続し、シリンジをシリンジポンプに取り付けます。次に、圧力制御ユニットをマイクロ流路チャネルの入口に接続します。バルブが閉じていることを確認し、圧力を3 barに設定します。その後、マイクロ流体デバイスを倒立共焦点顕微鏡のサンプルステージ上に設置します。ピペットを使用して、デバイスのリザーバーから膨潤溶液を取り除き、溶液が25〜50 µLだけ残るようにします。リザーバーに150 µLのGUV懸濁液を加え、緩やかなピペッティングで懸濁液を混合します。シリンジポンプを吸引モードで10 µL/minの速度で20分間、またはデバイスのトラップの90%以上が占有されるまで作動させます。次に、圧力制御ユニットのバルブを開き、マイクロ流体デバイス内のリングバルブを閉じます。シリンジポンプを停止し、デバイス内のGUVの共焦点画像を取得するまで1時間静置します。その後、ピペットを使用してリザーバーからGUV懸濁液を取り除き、25〜50 µLのみを残します。リザーバーに別の種類のろ過済み膨潤液を150 µL加え、ピペットで混合液をゆっくりと吸い上げ、吐出させる操作を繰り返します。リザーバー内の溶液を完全に置換するため、この工程を少なくとも5回繰り返してください。次に、シリンジポンプを吸引モードで10 µL/minの速度で10分間作動させ、マイクロチャネル内の溶液を置換します。次に、流量を1 µL/minまで下げます。圧力制御ユニットのバルブを2秒間閉じ、その後バルブを開いてシリンジポンプを停止させます。共焦点画像を記録する前に、デバイスを1時間静置します。温度制御チャンバーの準備を開始するには、まず、厚さ2mmのカバーガラス窓を備えたアルミニウム製熱流アセンブリにバーブ付きチューブ継手を取り付けます。カバーガラスの一方にゴムスペーサーを取り付け、観察チャンバーを形成します。100 µLのGUV懸濁液を観察チャンバーに注入し、カバーガラスでチャンバーを密封します。アセンブリをゆっくりと反転させます。アルミニウムチャンバーを外部の水槽に接続します。アセンブリを顕微鏡のサンプルステージに取り付けます。外部ウォーターバスを目的の最低温度に設定し、システムを10〜15分間平衡化させます。GUVの画像を撮影し、さまざまな温度における相状態を決定します。GUVは、対称的なスクロース溶液または塩溶液中で、DOPG、卵黄スフィンゴミエリン、およびコレステロールをさまざまな比率で混合して調製しました。蛍光顕微鏡を用いて、それらの支配的な相状態を決定した。次に、相挙動に対する有効な溶液条件を評価するため、選択した組成を希釈によって非対称条件に移行させた。非対称溶液中におけるGUVの相挙動をさらに詳細に調査するため、GUVをマイクロ流体デバイスでトラップし、外部溶液の完全な交換を可能にした。トラップされたGUVは、流体交換の前後で共焦点顕微鏡により評価されました。GUVの相挙動に対する有効温度を評価するため、均一な状態から相分離した状態へのGUVの割合を、一定の温度範囲にわたってモニタリングしました。データにシグモイドパターンが観察されたため、これをボルツマンモデルにフィッティングさせました。相分離したGUVの割合が0.5となる温度を、フィッティング曲線から決定しました。この手法は膜の相挙動に関する知見を得られるだけでなく、生理的条件下における生体分子の膜間相互作用の研究など、他の実験への応用も可能です。

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化学

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プロトコルの目的は、マイクロピペット吸引によって巨大小胞の膜機械的特性を確実に測定することである。...

マイクロピペット吸引による電気形成による巨大ユニラメラハイブリッド小胞の閉塞と機械的性質の測定

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

無細胞再構成は、細胞骨格アセンブリを理解するための重要なツールであり、過去10年間の研究は、最小限の系におけるセプチンダイナミクスを研究するためのアプローチを確立した。ここでは、異なる膜コンテキストでセプチンアセンブリを観察するための3つの相補的な方法、すなわち平面二重層、球状支持体、およびロッド支持体を提示する。...

生物物理学的特性と機能を研究するための膜でのセプチンアセンブリの再構成

学ぶ蛍光顕微鏡を用いた荷電巨大一重層ベシクル（GUV）の相挙動評価法。高塩濃度環境と膜内外溶液非対称性が膜相状態に与える影響を定量的に解析し、生理学的条件下での膜ダイナミクス理解に貢献します。

蛍光顕微鏡による監視対称および非対称のソリューションの条件下での荷電ベシクルの相挙動

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