アフリカツメガエルのリープフロッギング CRISPR/Cas9 ベースの始原生殖細胞の移植

リープフロッグ法の全体的な目的は、胚発生に不可欠な遺伝子の変異株の作製を容易にすることです。この手法は、発生遺伝学およびその他の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法の主な利点は、必須遺伝子の変異体をF1世代で得られることです。

本手順を開始するには、テキストプロトコルに記載されている通り、Cas9-sgRNA複合体を1細胞期のXenopus胚にマイクロインジェクションします。受精後4.5時間で胚が初期胞胚期（ステージ9）に達したら、25 °Cのインキュベーターから取り出し、室温で発生を継続させます。受精後5時間に移植を開始するため、パスツールピペットを用いて、非注入胚1個を、グラフトレシピエントとなる窪み付きの60 mmアガロース皿に移します。

さらに、PGCドナー胚を1個ディッシュに移します。ピンセットを用いて、各胚から卵黄膜を手動で除去します。そして、両方の胚を回転させ、植物極が視認でき、手術が可能な状態にします。

次に、ヘアループで受容胚を固定しながら、眉毛ヘアナイフの鋭い先端を表面直下の植物極に挿入します。そして、素早い上方への切り込み動作で、原口となる将来のボトル細胞が形成される領域内に、正方形の形に4本の浅い切開を入れます。正方形の4辺が描かれたら、同様の切断動作を用いて眉毛ヘアナイフで各切開を深め、胞胚腔の底までの距離の約1/3から1/2の深さまで切り込みます。

レシピエント胚の深層植物極領域に1回または数回の水平切開を加え、植物極組織の外植片を遊離させます。次に、迅速に、PGCドナー胚に対しても同様の手順を行い、移植用の同程度の大きさの植物極組織断片を作成します。PGCを含む組織をドナー胚から取り出した後、眉毛の毛を用いたナイフとヘアループを使用して、レシピエント胚に作成した開口部に外植片を配置します。

眉毛用カミソリの柄を移植片の表面と平行に持ち、受容胚の植物側表面にある開口部に移植片をゆっくりと押し込みます。ヘアループを使用して、ドナー胚の死骸をアガロース表面上でゆっくりと滑らせ、ウェルの中に入れます。この際、死骸の切開口がバルク液体側を向いていることを確認してください。

レシピエント胚を隣接するウェルにスライドさせ、同様に、移植された植極組織がバルク液体側を向いていることを確認します。胚が概ね原腸陥入初期のステージ10に達するまで、さらに多くの胚を用いてPGCsの移植を繰り返し、移植ペアを増やします。移植に合わせて胚を空のウェルに移動させてください。移植後、通常30〜45分で移植片が定着し治癒したら、パストールピペットを用いて、ディプレッションからアガロースコーティングされた24ウェルプレートの各ウェルへ胚を非常に慎重に移動させます。

胚を回転させ、動物極が上向きになり、バルク溶液に面するように配置します。胚のペアを把握しやすくするため、ドナーの死骸とグラフトレシピエントを隣接するウェルに配置し、この情報を記録します。その後、胚が入った24ウェルプレートを25 °Cのインキュベーターに一晩入れます。

翌日、初期尾芽期に達した各接ぎ木受容体を、アガロースでコーティングした新しい6ウェルプレートの個別のウェルに移動させます。リープフロッグ胚を育成し、死骸から回収したドナーDNAの解析を本文のプロトコルに従って行います。リープフロッグ法は、生殖細胞系列が変異アレルに効率的に置換された個体を産出するため、F1世代で変異表現体を得ることが可能です。

この表に示されているように、Blitzらは、メラノサイトおよび網膜の色素沈着に必要なチロシナーゼ遺伝子座を標的としたF0個体の大部分において、tyrマイナスのアルビノ個体との戻し交配による測定の結果、ドナー由来の変異ゲノムが100%の生殖細胞系伝達を示すことを報告しました。このビデオを視聴したことで、Xenopusの始原生殖細胞を移植する方法について十分に理解できたはずです。