窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。
August 18th, 2017
超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。
この実験手順の全体的な目標は、培養細胞を最適に均質化し、膜画分と可溶性画分との間の細胞タンパク質の分配を分析することです。この方法は、細胞生物学における重要な課題の1つである、膜末梢タンパク質の細胞内区画化に対処するのに役立ちます。この技術の主な利点は、界面活性剤を使用せずに、固体および膜画分内の内因性タンパク質の分配を高い精度で再現性よく検出できることです。
まず、HGK293細胞を90%のコンフルエンシーで培養し、15cmディッシュ1個あたりの収量が、37°CのDMEMで5%の二酸化炭素を培養した場合、7番目の細胞に対して約2×10になるように培養します。次に、成長培地を真空で吸引します。次に、培養皿を氷の上に置き、培養皿に10ミリリットルの冷やした均質化緩衝液で培養皿上で細胞を2回優しく洗浄します。
洗浄後、大型セルスクレーパーを使用して、適切な量の均質化バッファーを使用して細胞を回収します。次に、細胞懸濁液を、あらかじめ冷やしておいた清潔な自己破壊爆弾に移し、攪拌板の上の氷浴に入れます。懸濁液の均質性を維持するには、マイクロマグネチックスターバーを爆弾の内部に配置し、スタープレートをオンにします。
その後、懸濁液にプロテアーゼ阻害剤錠剤を1錠加え、Oリングを上に押し上げて爆弾を適切に閉じるための重要なステップを含む、製造元の指示に従って爆弾を閉じます。完了したら、製造元の指示に従って、圧力計が300〜600PSIを読み取るまで、窒素ガスタンクで爆弾を徐々に加圧します。希望の圧力が得られたら、すべてのバルブを閉じ、窒素タンクを外します。
窒素が溶解し、細胞内で平衡に達するまで20分間待ちます。次に、使い捨てワイプを使用して排出バルブの周りの余分な水を取り除き、バルブを静かに開いてホモジネートを落下させて放出し、ホモジネートを事前に冷却した15ミリリットルのチューブに集めます。キャビテートの上に泡が乗った乳白色の外観を観察します。
加圧中は、ゆっくりとした弁状放電を伴うキャビテートを、収集終了近くの突然の放電に対応するのに最適な位置にある適切なアクセス容量を持つ収集チューブに収集することにより、単純な損失を回避することが重要です。キャビテートを採取した後、チューブを遠心分離して核内の壊れていない細胞を取り除きます。そして、核後上清またはPNSを収集します。
次に、PNSをポリカーボネート製超遠心チューブに移します。超遠心分離を行い、細胞質画分と膜画分を分離します。超遠心分離後、ペレットと上清を分離します。
1ミリリットルのピペットを使用して、上清またはS画分を収集します。上清を回収した後、ペレットを4ミリリットルの冷たいPBSで慎重にすすぎ、ペレットを乱さないように注意してから、吸引して緩衝液を取り除きます。細胞質画分と同量の可溶化バッファーを使用してペレットを再懸濁し、細胞同等性を達成します。
次に、完全に可溶化したペレット懸濁液を卓上遠心分離機で遠心分離します。1ミリリットルのピペットを使用して上清またはP画分を収集し、ペレットを廃棄します。最後に、フラクションを摂氏80度で保存します。
3つの代表的な細胞株から単離された細胞質画分と膜画分の両方からの内因性タンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析後に示されています。細胞質画分と膜画分の両方に、EEA1、Rab7、Rab9、ヘキソキナーゼ1などの緩やかに結合した末梢膜タンパク質の存在は、この技術の有用性を実証し、末梢タンパク質の膜会合の強度を評価します。PNS中の内因性タンパク質のマウントを介して、ジャーカット細胞を異なる機械的破壊技術にさらした後に分析した。
ヘキソキナーゼ1やRasなどの末梢膜タンパク質の収量は、窒素キャビテーションで調製したサンプルで高くなります。均質化効率は、低張緩衝液とショ糖または塩化ナトリウムで等張性にした緩衝液と比較しました。等張ショ糖緩衝液を使用して破壊された細胞のPNS中のタンパク質レベルは、濃縮されたフィブロラリンを除いて、より少ない回復を示しました。
これらの結果は、ファルネシル化NRASがP画分とS画分の両方に分配されていることを示しています。NRASのプレノ修飾がないため、完全に細胞質の局在化がもたらされ、末梢膜タンパク質分配のダイナミクスを研究するためのこのプロトコルの信頼性が確認されます。習得すると、膜画分の再懸濁を伴わない細胞質画分と膜画分の分離は、1時間45分、または膜分画の再懸濁により約4時間で行うことができます。
バイケミカル分画には固有の人工的な性質があるため、細胞質画分と膜分画の間の絶対分布ではなく、タンパク質の分配における実験条件全体の変化に焦点を当てることが重要です。さらに、最適な結果を得るために、窒素キャビテーション用のさまざまな均質化バッファーをテストすることをお勧めします。この手順の後、イムノブロッティングおよび酵素活性アッセイを実施して、末梢タンパク質の膜関連強度などの追加の質問に答えることができます。
高圧窒素爆弾での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する際には、適切な個人用保護具を着用するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。ご覧いただきありがとうございます、実験頑張ってください。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概要
この記事では、窒素空化を利用した培養哺乳類細胞の洗剤フリー同質化プロトコルを紹介します。この方法は、細胞質および膜結合タンパク質の分離を可能にし、周辺膜タンパク質の分画の研究を促進します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 細胞生物学
- タンパク質分析
- 膜生物学
背景
- 細胞内のサブコムパルトメント化は細胞生物学における重要な課題です。
- 膜周辺タンパク質の分画の理解は様々な生物学的プロセスにとって重要です。
- 従来の方法は洗剤を使用することが多く、タンパク質分析に干渉する可能性があります。
- この方法はタンパク質検出の正確性を確保するための洗剤フリーの代替手段を提供します。
研究の目的
- 培養細胞を同質化する信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 膜と可溶性画分間の細胞タンパク質の分画を分析すること。
- 内因性タンパク質の検出の精度を向上させること。
使用された方法
- DMEMで90%接合率でHGK293細胞を培養すること。
- 細胞同質化に窒素空化を使用すること。
- 超遠心分離により細胞質および膜結合タンパク質を分離すること。
- 処理前に冷却した同質化バッファーで細胞を洗浄すること。
主要な結果
- この方法はタンパク質の分画の検出を再現可能にします。
- 洗剤を使用せずに正確な分析を可能にします。
- 内因性タンパク質を固体および膜画分の両方で効果的に分析できます。
- 結果は窒素空化のタンパク質分離の有効性を示しています。
結論
- このプロトコルは膜タンパク質ダイナミクスの研究に有用なツールです。
- 洗剤フリーの方法はタンパク質分析の信頼性を高めます。
- 将来的には様々な細胞タイプと実験条件に応用される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of peripheral membrane protein partitioning is critical for target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. Detergent-free subcellular fractionation enables reproducible detection of endogenous protein dynamics without artifacts that confound mechanistic interpretation. This method supports predictive confidence in assessing membrane association strength, directly informing go/no-go decisions for targets with marginal membrane affinity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying shifts in peripheral membrane protein localization between cytosolic and membrane fractions.
- Operational Value: Provides detergent-free fractionation that preserves native protein associations, reducing false positives in target engagement assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by measuring membrane association strength of targets like Ras isoforms, informing prioritization based on druggability and pathway relevance.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates validated cytosolic and membrane fractions suitable for downstream immunoblotting and enzyme activity assays to assess compound effects on protein partitioning.
- Reproducibility: Delivers consistent separation across cell types (e.g., HEK293, Jurkat), enabling standardized assay formats for high-content screening campaigns.
- Scalability: Compatible with ultracentrifugation workflows, allowing parallel processing of multiple conditions for dose-response or time-course studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase partitioning data to preclinical validation by monitoring endogenous protein dynamics in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from altered membrane association versus expression changes, reducing ambiguity in target mechanism.
- Biomarker Alignment: Supports identification of translocation-based biomarkers when peripheral membrane proteins serve as readouts for pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization, providing biochemical resolution of protein localization that complements imaging-based approaches.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of membrane recruitment mechanisms for signaling proteins like Rab GTPases and kinases.
- Screening: Enables assay development for compounds that modulate peripheral membrane protein partitioning, with quantitative outputs from fractionated samples.
- Analytics: Generates supernatant and pellet fractions for western blot analysis, providing measurable readouts to compare partitioning under different experimental conditions.
- Translational Research: Facilitates continuity from cultured cell models to preclinical systems by assessing conservation of membrane association patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable fractionation platform applicable across multiple targets and projects, reducing reliance on antibody-dependent imaging for quantification.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity around peripheral membrane protein behavior.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization across labs through a detergent-free, pressure-based homogenization method.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets with weak membrane affinity, minimizing investment in non-viable candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative data on target localization, a key parameter for assessing druggability and pathway modulation potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in subcellular fractionation and ultracentrifugation techniques.
- Depends on access to nitrogen cavitation equipment and compatible ultracentrifugation infrastructure.
- Necessitates standardization of homogenization buffers and pressure parameters across teams for reproducible results.
- Involves adaptation considerations for different cell types and protein complexes, particularly regarding optimal disruption conditions.
- Limited by the inherent variability of biochemical fractionation; focus should remain on relative changes across conditions rather than absolute distribution values.
