Name: 窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶ 窒素キャビテーションと差動遠心分離を用いた培養細胞の周辺膜蛋白質分布解析法。界面活性剤不使用で細胞質と膜画分を分離し、内因性蛋白質の局在を正確に評価できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、GM055279、CA116034 および CA163489 によって賄われていた。

1 バッファーと機器の準備 <ol><li>4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c</li>。
	<li>準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ 。
	注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バッファーは、10 mM HEPES ph 7.4 では、10 mM KCl と 1.5 mM MgCl 2 (低張性均質化バッファーとしてという) で構成されます。ほとんどのバッファーは窒素のキャビテーションのために適応することができます (ディスカッション を参照してください).</li>
	<li>の準備で 4 ° C 追加プロテアーゼ阻害剤錠使用前に新鮮なサンプルあたり Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) バッファー x 1 の 6 mL を寒さと 。
	注: このプロトコルで使用される PBS バッファー pH 7.4 では、1.8 mM KH 2 PO 4、137 mM NaCl と KCl 2.7 mM で 10 mm Na 2 HPO 4 で構成されています</li>。
	<li>準備可溶化バッファー使用直前の 4 ° C 追加 1 つのプロテアーゼ阻害剤のタブレットでサンプルごとの 4 つの mL を寒さと 。
	注: このプロトコルで使用される可溶化バッファーは 1 の x Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.1 %sds、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1%、25 mM Tris から成っている NP 40。4.6 の注を参照してください</li>。
</ol> 2。セル収穫 型のセルの <ol>推奨で 10 9 ティッシュ文化セル x 2 x 10 の成長 7-10 <li>培地。通常、1 つの 15 cm 皿利回り 2 x 10 7 HEK 293 細胞 DMEM で 90% の confluency ( 図 1) にします</li>。
	<li>真空によって成長媒体を削除します</li>。
	<li>付着性のセルのため氷の上の培養皿を配置、チルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 15 cm 皿あたり) で軽く文化皿で直接細胞を洗浄し、適切な量で大細胞スクレーパーとセルを収穫均質化バッファー;浮遊細胞の場合収集しチルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 50 mL カルチャごと) 4 ° C、5 分で 500 x g スピンに細胞ペレットを洗って、氷の上の均質化バッファーの適切なボリュームで洗浄細胞ペレットを再懸濁します。 注: ボリュームは、細胞破壊爆弾で許可される最小/最大ボリュームと同様に、意図されていた実験の蛋白質の集中の要件に基づく必要があります。一般的なガイドラインは 2-10 10 7 セル/mL、x またはセルの約 10 巻ペレットします。このプロトコルは、2 mL の均質化バッファーの HEK 293 の細胞の 3 つの 15 cm 料理に最適です</li>。
</ol> 3。窒素キャビテーション <ol><li>波紋上氷浴で清潔でチルド爆弾への転送細胞懸濁液プレートします 。
	注意: 爆弾、高圧、低温、窒素ガス &#8211; 適切な個人用保護具 . を着用</li>
	<li>爆弾の中マイクロ電磁攪拌棒を置き、懸濁液の均質性を維持するために攪拌プレートをオンにします</li>。
	<li>懸濁液に 1 つのプロテアーゼ阻害剤タブレットを追加し、メーカーごとの爆弾を閉じます &#39; s 命令</li>。
	<li>徐々 に加圧窒素ガスのタンク メーカーごとに爆弾 &#39; 爆弾圧力計まで s 命令は 300 に 600 psi を読み取ります。すべてのバルブを閉じ窒素タンクを切断しています 。
	注: セルの種類によって必要な圧力が異なります。Jurkat、NIH 3T3 HEK 293 の細胞の 400 に 350 psi でキャビテーションを行ったここ</li>。
	<li>窒素に分解し、細胞内で平衡に達するように 20 分待つ</li>。
	<li>布タオルを使用して吐出バルブ周りの余分な水を削除します。磨砕液の滴下しリリースを達成し、前冷蔵 15 mL チューブに収集に優しく吐出バルブを開きます 。
	注: コレクションの末尾近くあるホモジネートのスパートとシューという音とともにガスが出てくる。ガスがないことを確認してください以前に収集された原因はチューブから撮影する妨 (それ故に 15 mL の使用チューブ 1.5 mL チューブの代わりに)。スパートを開始すると、吐出バルブを閉じて、減圧爆弾と爆弾の残りのセルのキャビテーションを達成するために突然窒素入口弁を開きます。オープンは爆弾の妨の回復と徹底的に掃除します 。
	注: 上の泡と乳白色の外観は、最終的な cavitate 必要があります。ピペット チップ遠心分離前に沈静化して泡を許可すると優しくかき混ぜる 。
	注: は、均質化の効率を判断する位相差顕微鏡による、cavitate を確認します。15 μ L のドロップを追加、coverslip でカバーして顕微鏡スライドの表面に空洞を作る。20 × 対物で 3.4 3.6 多すぎる場合にのみ切れ目のない細胞が検出手順を繰り返します 。
	注: 均質化バッファーに EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を含まない場合に追加収集した退院後 5 分以内 1 mM の最終的な集中を妨します</li>。
</ol> 4。Cytosolic と膜画分の分離 切れ目のない細胞や核を削除する 4 ° C で 10 分間の <ol><li>遠心分離機 500 x cavitate g. 
	注: は遠心分離のステップを繰り返して表示されているペレットは生成されませんし、上部に浮かぶ泡を回避しながらポスト核上清 (PNS) を収集します。必要に応じてさらに収集し、PNS を結合するフォームを再遠心分離機 ( 図 1).</li>
	<li>は、関心の分数を取得する必要に応じて、PNS を処理します。ゾル性細胞質の分離と膜の一部分を目的として遠心チューブに PNS を転送し、必要に応じて遠心を行います。このプロトコルが最適です、&#60; 3.5 mL サンプル 4 で 1 時間 350,000 × g で遠心、ポリカーボネート製遠心管に ° C</li>
	<li>(S 分画) 上清 1 mL ピペットを使用してを収集します</li>。
	<li>は、それを乱すことがなく慎重に 3 mL の冷 PBS でペレットをすすいでください。真空によって PBS を削除します 。
	注: ゾル性細胞質蛋白質によって膜画分の汚染がサンプルの損失より大きい問題は、ペレット寒さの PBS と 4.2 の手順と再遠心の 3 mL に再懸濁します。真空によって PBS を削除します</li>。
	<li>は好みの洗剤を含む可溶化バッファーの適切なボリュームでペレットを完全に再懸濁します。セルの等価を達成、内局として可溶化バッファーの同じボリュームを使用します 。
	注: 効率的な膜蛋白質の抽出のための可溶化バッファーとして 1 x RIPA バッファーを使用してお勧めします。下流のアッセイが膜画分の必要ない場合は、最大膜たんぱく質抽出用 1 x laemmli サンプル バッファーを使用します 。
	メモ: 提案は外れ、最大膜蛋白質の抽出のための 4 ° C で管上クリーン チューブ可溶化バッファーにペレットを転送します 。
	注: ペレットが目から効率的に削除する粘り (あまりにも多くの脂質) の場合e 可溶化バッファーの超遠心機チューブ スナップおすすめペレットを液体窒素で凍結、ペレットは分解する前にすぐにミニ金属ヘラで超遠心機チューブからペレットを外れします 。
	注: また、膜ペレットだけ再停止できない膜小胞懸濁液、遠心分離のステップ 4.6 の場合は不要の P 分数を生成する洗剤を含むバッファー中に溶解しました。膜協会に依存する酵素活性などの機能を調査するときその P 端数が役に立つ</li>。
	<li>4時 10 分卓上遠心分離機で 20,000 × g ステップ 4.5 から完全に可溶化されたペレット懸濁液を遠心分離機 ° C 上清 1 mL ピペット (P の一部) を使用してを収集し、ペレット (不溶性の脂質) を破棄します</li>。
	<li>ゾル性細胞質や膜画分を用いてウェスタンブロッティングなど必要なアッセイを実行または将来使用するため-80 ° C で保存します</li>。
</ol>

<ol><li>Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins+on+the+move%3A+insights+gained+from+fluorescent+protein+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (10), 656-668 (2011).</li>
<li>Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+commercial+extraction+kits+for+subsequent+membrane+protein+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling.</a> Cytotechnology. 61 (3), 153-159 (2009).</li>
<li>Simpson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+cultured+cells+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).</li>
<li>Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+plasma+membranes.+I.+High-yield+purification+of+human+neutrophil+plasma+membrane+vesicles+by+nitrogen+cavitation+and+differential+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation.</a> J Cell Biol. 86 (1), 21-28 (1980).</li>
<li>Philips, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+molecular+weight+GTP-binding+proteins+in+human+neutrophil+granule+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).</li>
<li>Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phospholipides+of+Ehrlich+ascites+carcinoma+cells%3A+composition+and+intracellular+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution.</a> Cancer Res. 20, 397-402 (1960).</li>
<li>Hunter, M. J., Commerford, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+homogenization+of+mammalian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Pressure homogenization of mammalian tissues.</a> Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).</li>
<li>Wallach, D. F., Kamat, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+Cytoplasmic+Membrane+Fragments+from+Ehrlich+Ascites+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).</li>
<li>Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3 (3), 653-654 (1977).</li>
<li>Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+5-lipoxygenase+to+the+nucleus+of+unstimulated+rat+basophilic+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells.</a> J Biol Chem. 269 (35), 22059-22066 (1994).</li>
<li>Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+liver+and+muscle+polyribosomes+in+high+yield+after+cell+disruption+by+nitrogen+cavitation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation.</a> FEBS Letters. 2 (1), (1968).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+prenylcysteine+carboxyl+methyltransferase+is+in+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum.</a> J Biol Chem. 273 (24), 15030-15034 (1998).</li>
<li>Wynne, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rap1-interacting+adapter+molecule+%28RIAM%29+associates+with+the+plasma+membrane+via+a+proximity+detector%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector.</a> J Cell Biol. , (2012).</li>
<li>Zhou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS35+binds+farnesylated+N-Ras+in+the+cytosol+to+regulate+N-Ras+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking.</a> J Cell Biol. 214 (4), 445-458 (2016).</li>
<li>Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+possess+and+require+an+active+protein+palmitoylation+pathway+for+agonist-mediated+activation+and+in+vivo+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (6), 1478-1485 (2007).</li>
<li>Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperoxidized+peroxiredoxin+2+interacts+with+the+protein+disulfide-+isomerase+ERp46%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46.</a> Biochem J. 453 (3), 475-485 (2013).</li>
<li>Annis, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+localized+Bcl-2+prevents+apoptosis+when+redistribution+of+cytochrome+c+is+a+late+event%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event.</a> Oncogene. 20 (16), 1939-1952 (2001).</li>
<li>Berkowitz, S. A., Wolff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+calcium+sensitivity+of+tubulin+polymerization.+The+contributions+of+temperature%2C+tubulin+concentration%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins.</a> J Biol Chem. 256 (21), 11216-11223 (1981).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では制限されているため小さいセル サイズをサンプル サイズや濃度のサンプルします。したがって、通関ベース Dounce 以上針の通路均質化付加的な利点を提供しています。窒素のキャビテーションは、同じ圧力でサンプル全体に一様に適用される同じ破壊力を再現できるより一貫した結果を提供しています。また、各セルのみの 1 つの単一の時間中断プロセスを経験し、細胞レベル下のコンポーネントが変数の破壊的な力を絶えず公開されます、したがって。これは細胞小器官の artefactual 断片化を制限します。中断によって引き起こされる不安定な細胞成分の酸化の心配は軽減されますまた、窒素は細胞懸濁液を飽和させるため、酸素補給の無料です。窒素キャビテーションによって課せられた制限の物理的・化学的ストレスにより、不安定...

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質1の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。
タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ2に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核3を破壊できる、膜バインド リソソーム4のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate5を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。
しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。
窒素のキャビテーションは 1960 年代6以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold7は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備10、11、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (&#62; 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。

<table><tbody><tr><td>細胞破壊容器(45 mL)</td><td>Parr Instrument</td><td>4639</td><td>窒素キャビテーション爆弾</td></tr><tr><td>ドンスホモジナイザー(2 mL)</td><td>Kontes</td><td>885300-0002</td><td>乳棒とチューブ</td></tr><tr><td>U-100インスリン注射器28G&frac12を</td>ダウンス。<td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Atg12 antibody</td><td>Santa Cruz</td><td>271688</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>&β;-アクチン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>47778</td><td>マウス抗体、1:1000</td></tr>希釈<tr><td>で使用&β;-チューブリン抗体</td><td>DSHB</td><td>E7-s</td><td>マウス抗体、1:5000希釈で使用</td></tr><tr><td>Calnexin抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>23954</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>カルレギュリン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>373863</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>カタラーゼ抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>271803</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>CIMPR抗体</td><td>アブカム</td><td>124767</td><td>ウサギ抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>EEA1抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>137130</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>EGFR抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>373746</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>F0-ATPase抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>514419</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>F1-ATPase抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>55597</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr> フィ<tr><td>ブリラリン抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>374022</td><td>マウス抗体、1:200 希釈で使用</td></tr><tr><td>Golgin 97 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>59820</td><td>マウス抗体、1:1000 希釈で使用</td></tr><tr><td>HDAC1 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>81598</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>Hexokinase 1 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2024S</td><td>ウサギ抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>Lamin A/C 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>376248</td><td>マウス抗体、1:1000 希釈で使用</td></tr><tr><td>LAMP1 抗体</td><td>DSHB</td><td>H4A3-c</td><td>マウス抗体、1:1000 希釈で使用</td></tr><tr><td>Na+/K+ ATPase 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>48345</td><td>マウス抗体、1:1000 希釈で使用</td></tr><tr><td>Rab7 抗体</td><td>アブカム</td><td>137029</td><td>ウサギ抗体、1:1000 希釈で使用</td></tr><tr><td>Rab9抗体</td><td>Thermo</td><td>MA3-067</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>RCAS1抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>398052</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>RhoGDI抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>360</td><td>ウサギ抗体、1:3000希釈で使用</td></tr><tr><td>リボソームタンパク質 S6抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>74459</td><td>マウス抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>Sec61a抗体</td><td>サンタクルス</td><td>12322</td><td>ヤギ抗体、1:1000希釈で使用</td></tr><tr><td>厚肉ポリカーボネート超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>349622</td><td>超遠心分離用サンプルチューブ</td></tr><tr><td>TLK-100.3ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>超遠心349481</td><td>ローター</td></tr><tr><td>オプティマMAX 大容量パーソナル超遠心機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>364300</td><td>超遠心分離機</td></tr><tr><td>cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>11697498001</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>25cmハンドルと3.0cmブレード付きセルスクレーパー</td><td>コーニング</td><td>353089</td><td>ラージセルスクレーパー</td></tr><tr><td>マグネティックスターバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-513-57SIX</td><td>マイクロスターバー</td></tr><tr><td>セラミックトップマグネティックスターラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィックS504501AS</td><td></td><td>マグネチックスターラー</td></tr></tbody></table>

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾル性細胞質と膜の一部分、それぞれ。窒素キャビテーション後細胞質と膜の効率的な分離を確認した 〜 低張バッファー内の 350 の psi に続いて 1 時間 350,000 × g で遠心。総蛋白が治った S と P の分数は小胞体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体、他の細胞器官のマーカーと、分析しました。すべての膜貫通タンパク質は膜画分に存在のみ、Na+を含む/K+ ATPase と原形質膜、小胞体、リソソーム膜蛋白質 1 (LAMP1) からカ...

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

Cultured cells are useful for studying the subcellular distribution of proteins, including peripheral membrane proteins. Genetically encoded fluorescently ...

この実験手順の全体的な目的は、培養細胞を最適にホモジナイズし、膜画分と可溶性画分の間における細胞タンパク質の分配を解析することです。この手法は、細胞生物学における主要な課題の一つである、膜周辺タンパク質の細胞内コンパートメント化の解明に寄与します。本手法の最大の利点は、界面活性剤を使用せずに、固体画分および膜画分における内因性タンパク質の分配を、高い精度で再現性良く検出できる点にあります。まず、DMEMを用い、37 °C、5% CO₂の条件下で、15 cmディッシュ1枚あたり約2 x 10⁷個の細胞が得られるように、HGK293細胞をコンフルエンシー90%まで培養します。次に、成長培地を吸引して除去します。続いて、培養ディッシュを氷上に置き、1枚あたり10 mLの冷却したホモジナイゼーションバッファーを用いて、ディッシュ上の細胞を穏やかに2回洗浄します。洗浄後、適切な量のホモジナイズバッファーを用いて、大きなセルスクレーパーで細胞を回収します。次に、細胞懸濁液を、スターラー上の氷浴に置いた、あらかじめ冷却した清潔なセルディスラプションチューブ（セルフデストラクションボム）に移します。懸濁液の均一性を維持するため、チューブの中にマイクロマグネティックスターバーを入れ、スターラーのスイッチを入れます。その後、懸濁液にプロテアーゼ阻害剤タブレットを1錠加え、メーカーの指示に従ってボムを密閉します。この際、ボムを適切に閉じるために、Oリングを上に押し上げるという重要な手順を含めてください。完了後、メーカーの指示に従い、圧力計が300から600 PSIの間を示すまで、窒素ガスボンベを用いて徐々に加圧します。目的の圧力に達したら、すべてのバルブを閉じ、窒素ボンベを切り離します。窒素が細胞内に溶解し、平衡状態に達するまで20分間待機します。次に、使い捨てワイプを使用して排出バルブ周辺の余分な水分を取り除き、バルブをゆっくりと開いてホモジネートを滴下させ、あらかじめ冷却した15 milliliterチューブに回収します。キャビテートの上部に泡を伴う乳白色の外観を確認してください。加圧中には、十分な容量を持つ回収チューブへ、バルブを用いてゆっくりと排出して回収することで、単純な損失を避けることが極めて重要です。このチューブは、回収終了間際に起こりうる急激な排出に対応できるよう、最適に配置してください。回収後、チューブを遠心分離して、破壊されていない細胞や核を除去します。その後、核上清（PNS）を回収します。次に、PNSをポリカーボネート製超遠心管に移します。超遠心分離を行い、細胞質画分と膜画分を分離します。超遠心分離後、ペレットと上清を分離します。1 mLピペットを使用して、上清またはS分画を回収します。上清の回収後、ペレットを乱さないように注意しながら、4 mLの冷PBSで

nitrogen-cavitation-differential-centrifugation-allows-for-monitoring

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオは、リガンドアッセイの差動放射状毛細血管作用を示しています。これは、細胞内ヌクレオチドのセカンドメッセンジャー結合タンパク質の体系的なハイスループットスクリーニングの技術です。この技術により、細胞溶解物中の過剰発現した標的タンパク質にメッセンジャーを直接結合させることができ、タンパク質精製の必要性を回避できます。...

リガンドアッセイの差動放射状毛細管作用:細菌ヌクレオチドセカンドメッセンジャー結合細胞内タンパク質を同定するためのハイスループット技術

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。...

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

ここでは、タンパク質の蛍光強度を適切な内部標準の蛍光強度に正規化することにより、中心体におけるタンパク質のレベルの変化を測定するための新しい定量的蛍光アッセイが開発されています。...

中心体におけるタンパク質レベルの変化を測定するための定量的免疫蛍光アッセイ

ここでは、細胞膜、細胞質、高速遠心分離を使用せず U937...

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

この記事では、カエノハブディティス・エレガンス細胞外小胞を生成、精製、定量化する方法について説明します。...

細胞外小胞体のカエノールハブディティス・エレガンスの精製と分析

ここで提示される電子顕微鏡法と組み合わせてネイティブ細胞膜ナノ粒子系を利用する膜蛋白質のオリゴマー状態の決定のためのプロトコルです。...

膜蛋白質相互作用解析用のネイティブ細胞膜ナノ粒子システム

この分画プロトコルにより、研究者は哺乳類細胞から細胞質、核、ミトコンドリア、および膜タンパク質を単離することができます。後者の2つの細胞内画分は、等密度密度勾配を介してさらに精製される。...

等密度勾配精製によるU937細胞の細胞分画

このプロトコルは、カプセル化されたヒト細胞を最大72時間生存可能に保つためのNMRバイオリアクターのセットアップを説明し、その後、時間分解された細胞内NMRデータ取得および分析を行う。この方法論は、細胞内のタンパク質-リガンド相互作用をリアルタイムでモニターするために適用されます。...

高細胞密度バイオリアクターを用いたリアルタイム定量細胞内NMRによるヒト細胞におけるタンパク質-リガンド相互作用のモニタリング

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。...

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

この論文は、脂質近位環境におけるin vitroでの内在性膜タンパク質とさまざまなパートナー因子との相互作用と集合を評価する方法を説明しています。...

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成しますインビトロ

学ぶ 窒素キャビテーションと差動遠心分離を用いた培養細胞の周辺膜蛋白質分布解析法。界面活性剤不使用で細胞質と膜画分を分離し、内因性蛋白質の局在を正確に評価できます。

窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

さらに動画を探す