体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

これらの手順の全体的な目標は、正常な発達中の胚性および周産期の大動脈壁の形成、および疾患中のこのプロセスの摂動を研究することです。この方法は、胚および周産期の血管培地に寄与する細胞の供給源は何かなど、血管発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、発生の胚期および周産期に発生する平滑筋の病因と形態形成を評価できることです。

これらの技術の意味は、過剰な相撲細胞産生を引き起こす周期性疾患の弁上性大動脈弁狭窄症などの血管疾患の治療に起因しています。ミニポンプの配置手順は、マイクロサージェリーコアを指揮する研究員であり、イェール大学であるJiasheng Zhang博士が行います。まず、Cre ERを持つ生後2〜6か月のマウスとCreレポーターを持つマウスの間で交配ペアを設定します。

金属製のプローブを使用して、毎朝膣栓をチェックし、栓が検出されたときに女性と男性を分離します。早期胚誘発のために、妊娠中の湿疹にタモキシフェンを腹腔内に注射します。.妊娠期間中期から後期の細胞をマークし、出生後のマウスでそれらの運命またはクローン性を追跡するために、妊娠中の腹腔内にプロゲステロンを注入します 湿ったタモキシフェンと1〜2の用量比で無能に

適切な胚の日に胚を収穫するには、70%エタノールで湿った妊娠中の腹部を清潔にし、はさみを使用して腹部を開き、子宮を取り出します。鉗子と実体顕微鏡を使用して子宮から胚を採取し、胎盤と卵黄嚢から慎重に分離します。胚を4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で2時間固定します。

その後、PBSで3回洗浄して余分な固定剤を取り除きます。3回目の洗浄後、胚が沈むまで、PBS中の30%スクロースで、個々の15ミリリットルチューブで胚をインキュベートします。次に、プラスチック凍結型に最適な切断温度を充填し、最大体積の3分の2までコンパウンドし、各型に1つの胚を垂直に配置します。

室温で10分後、組織をドライアイス70%エタノール浴で直立させて凍結し、クライオスタットの温度を摂氏22度に設定します。組織ブロックを切片にして、各大動脈全体にわたって厚さ10〜20マイクロメートルの横方向の組織スライスを生成し、得られた各切片をガラス顕微鏡スライドで捕捉します。すべてのサンプルを取得したら、スライドを室温で30分間乾燥させてから、80°Cで保存します。

組織サンプルを染色するには、スライドを室温で解凍し、蛍光色素の漂白を避けるために光から保護し、0.1%PBS twin 20でスライドを洗浄します。クローン解析では、適切な核色素で組織を染色し、蛍光顕微鏡でレインボークレレポーターの他のフルオロフォアを直接イメージングします。フェイトマッピングでは、mTmG cre レポーターを使用して、免疫染色の有無にかかわらず、直接イメージングによりGFP発現を可視化します。

胚性大動脈を培養して移植するには、胚を仰臥位に置き、伸ばした手足を実体顕微鏡下の解剖ボードに固定します。はさみを使用して、腹部から胸骨を通って胸部上部まで垂直に切開します。最高の気管肺、食道、肝臓、腸を解剖します。

鉗子を使用して心臓を腹側にそっと引っ張り、はさみを使用して大動脈を胸腔と腹腔の背側から離剖します。近位根と遠位腹部の位置で大動脈を切断して解放し、採取した大動脈を細胞培養フード内の滅菌氷冷PBSに入れます。短時間の洗浄後、大動脈を0.5%PBSを添加したDMEM培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに移し、プレートを最大24時間細胞培養インキュベーターに置きます。

インキュベーションの終わりに、大動脈をPBSで2回洗浄し、組織を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定します。さらに3回のPBS洗浄後、組織が沈むまで大動脈を30%スクロシンPBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。.周産期大動脈平滑筋細胞の分離には、23ゲージの針を使用して出生後0.5マウスの左心室に穴を開け、プラスチックチューブを使用して針を滅菌PBS入りシリンジに接続し、垂直に高い位置に保持して、PBSが重力によって左心室に流れ込むようにします。

肝臓が白くなったら、鉗子を使用して大動脈の外側の外膜組織を取り除き、先ほど示したように大動脈を採取します。500マイクロリットルの消化液で大動脈組織を解離し、5〜10分ごとに手動で振とうします。.45分後、チューブを滅菌細胞培養フードに移し、200マイクロリットルのピペットを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで組織スラリーを粉砕します。

細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、次に2ミリリットルのDMEMを追加し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを3ミリリットルの平滑筋細胞培養培地に再懸濁し、細胞を35ミリメートルの培養プレートに播種します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、細胞培養培地を3日ごとにリフレッシュします。

皮下浸透圧ミニポンプを配置するには、麻酔をかけたマウスの腰をバリカンで剃ることから始め、マウスを加熱された手術プレートの腹臥位に置きます。ベタジンとイソプロピルアルコールで背中をこすり、マウスを実体顕微鏡の下に置きます。次に、メスを使用して、尾の付け根まで約3〜5センチメートルの横方向の皮膚切開を行い、下にある筋肉を傷つけずに行います。

切開部に止血器を挿入し、止血顎を開閉して皮下ポケットを作ります。目的の薬剤を充填した浸透圧ミニポンプをポケットに挿入し、6 o非吸収性縫合糸を使用して切開を閉じます。次に、マウスが胸骨の横臥位に達するまでモニタリングしながら回復させます。

細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の胚変異体であるエラスチンは、胚の15.5日以降に始まり、大動脈の内層に過剰な平滑筋細胞を蓄積します。このプロセス中のマルチカラーcreレポーターによる平滑筋細胞のクローン分析は、細胞が複数の色であり、したがってポリクローナルであることを示しています。外植大動脈切片の免疫染色により、エラスチン変異体胚の15.5日目の大動脈は、培養後18時間以内に筋肉亢進と狭窄性になり、抗アンテグリンβ3ブロッキング抗体の添加によりそのプロセスが弱まることが明らかになりました。

出生後0.5日目の野生型マウスの大動脈から単離された平滑筋細胞は、平滑筋細胞マーカーを発現しますが、CD31は発現しません。インテグリンベータ3阻害剤を胚13.5日目から妊娠中の湿地に連続注入すると、細胞外マトリックスタンパク質であるエラスチンの変異体マウスの大動脈弁狭窄と筋肉増強が大幅に軽減されます。ただし、野生型マウスの大動脈を変更しないでください。

浸透圧ミニポンプの配置技術は、一度習得すれば、適切に行えば10分以内に完了することができます。これらの手順に続いて、これらのアプローチは、平滑筋コード化された非血管性、胃腸管の組織や肺領域を研究するためにも外挿できます。このビデオを見れば、in-vivo embryonic fitマッピングとクローン解析、培養外植胚性大動脈、周産期大動脈平滑筋細胞、および外植片皮下浸透膜ミニポンプの実施方法について十分に理解できるはずです。

マウス、タモキシフェン、固定減速機での作業は危険な場合があり、手袋や白衣を着用し、これらの手順を実行する際には特別な注意を払うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。