Name: 体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶマウスの大動脈形態形成と血管発生のメカニズム。in vivoクローン解析と運命マッピングを用いて、胚・周産期の平滑筋細胞由来と病態を解明する手法を解説。血管疾患治療への応用も示唆される。

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大動脈の SMC 分離のための彼の実験室のプロトコルを共有を学部長の李を感謝いたします。アメリカ心臓協会、国立衛生研究所 (R21NS088854、R01HL125815、および R01HL133016 D.M.G に) によって提供された資金援助 (D.M.G. に科研費 14GRNT19990019)、イェール大学 (午前にブラウン コックス交わりと起動D.M.G. に資金)。

マウスのすべてのプロトコル、動物介護制度とイェール大学で利用委員会によって承認されています。
 1 体内 胚運命マッピングとクローン解析 注: 我々 は広く細胞モデルの開発と疾患モデルでクローン アーキテクチャの起源を評価するこれらのアプローチを使用している。 7, 8, 9, 10. <ol><li>、クレエでマウスと Cre 記者とマウスの間で合うを設定します 。
	メモ: クレエは SMC マークの使用します。Myh11 CreERT2 または Acta2 CreERT2 マウス 11 , 12 は、この目的のため使用されます。我々 は広く萌芽期ティッシュをマークするため ROSA26R CreERT2 マウス 13 を使用しています。
	<ol><li>クローン解析のマルチカラー Cre 記者 (例えば 紙吹雪や虹 [Rb] マウス) 8 , 14 , 15 を使用し、運命のマッピングを使用して、単色 Cre 記者 (例えば、 ROSA26R YFP マウス 16) または二重色 Cre 記者 ROSA26R-mTomato-mGFP (mTmG) 17. 
		注: この育種方式を使用して成体 2-6 ヶ月前 (一般に 〜 30 g)、胚、クレエと Cre 記者が生成されます</li>。
	</ol></li> <li>朝は、金属を使用して膣にプラグ プローブして萌芽期の日 (E) 0.5 としてプラグ検出の日の正午をチェックします</li>。
	<li>プラグインが検出されたとき男性から女性を区切ります</li>。
	<li>準備 4-オハイオ-タモキシフェンとタモキシフェン作業ソリューションを。
	<ol><li>4-オハイオ-タモキシフェンの 100% エタノール、2 分間渦の 50 μ L に 5 mg を溶解し、コーン油の 450 μ L を追加。氷の上には、サイクル サンプルが冷えるまでの間休憩 10 秒サイクルの出力レベル 2 で超音波を照射します。サンプルは、完全に溶解した後 (通常 〜 超音波照射の 4-5 サイクル) 熱量溶液 200 μ L をとり、最終的な作業ソリューション (4-オハイオ-タモキシフェン 1 mg/mL) にするためコーン油の 1,800 μ L に溶解します</li>。
		<li>50 mg/ml 100% エタノールと渦に希釈、タモキシフェンのそれが溶解するまで。完全に溶解して 45 ° C で攪拌し最終的な作業ソリューション (タモキシフェン 10 mg/mL) コーン油で希釈</li>。
	</ol></li> <li>初期胚誘導の注入 4 ああタモキシフェン腹腔妊娠中のダム。
	<ol><li>4 ああタモキシフェン注射 (妊娠中のマウス、または約 5 mg/kg 体重あたりまで 〜 150 μ g) を使用して、E5.5 で、その後彼らは実行可能なダムや胚、子犬をもたらすと</li>。
		<li>0.5 - ダムの胚で妊娠中の 1.5 mg (または 17 〜 50 mg/kg) の投与量で使用タモキシフェン 〜 E9 以降。すべての注射の 30 G の針を使用します 。
		注: 0.22 μ m のフィルターによるろ過は注入前にすべての混合物を殺菌する通常使用されます。</li></ol></li> <li>クローン解析 4-オハイオ-タモキシフェン (例えば、5 mg/kg) またはタモキシフェン (例えば、50 mg/kg) に複数の細胞の高用量の腹腔内注射を使用します。
	<ol>個々 のセルをマーク、4 ああタモキシフェンまたはタモキシフェン投与量を滴定しなさい、興味 (すなわち 大動脈) の組織で分析 (このセクションの終わりに後述) としてほぼすべての胚があるないラベルのセルまたはセルだけに <li>単一の色。これはしきい値線量です</li>。
	</ol></li> <li>中期後期妊娠期間で細胞をマークし、彼らの運命やクローナリティ生後早期のマウスでトレースする注入プロゲステロン腹腔妊娠中のダムの付随して 1:2 (プロゲステロン: タモキシフェン) でタモキシフェンと線量比 。
	注: タモキシフェン投与が 17 〜 50 mg/kg とプロゲステロンの用量は 8.5 〜 25 mg/kg (すなわち、タモキシフェン投与の半分)。プロゲステロン注射は、1 〜 2 日で労働を遅らせる可能性があります</li>。
	<li>安楽死綿やガーゼを含む容器にダムを配置する場所、オープン ドロップ方法を使用希望年齢の胚で妊娠中のダムは、原液イソフルランを浸した。気胸を誘導するために胸腔を開くことで、重要な臓器を削除することによってまたは頚部転位を実行することによって死を確認します</li>。
	<li>は、70% エタノールで腹部を浄化します。腹部を切開し、子宮を解剖はさみを使用します。子宮から胚を外し、慎重に胎盤や鉗子を使用して卵黄嚢胚から分離します</li>。
	<li>頚部転位または手術用はさみで斬首や鋭い刃を実行して E15 以上の胚を安楽死させる 。
	注: E15 より若い胚は急速に母の安楽死および/または母から胚の除去に続いて死ぬ</li>。
	<li>氷冷 PBS で胚を置き、クレエと Cre のレポーターの遺伝子型にはさみを使って尾の小さな部分をカットします</li>。
	<li>PBS で 3 回胚 2 h. 洗浄のための 4 ° C で 4% パラホルムアルデヒドで胚を修正し、30% スクロースを PBS で 2 日間かかることがあります彼らが沈むまで待って 15 mL チューブに胚をインキュベーションしています</li>。
	凍結 <li>塗りつぶしプラスチック金型の最適切削温度 (OCT) 化合物の最大レベルの 2/3 まで。室温気泡を最小限に抑える (RT) で 10 分間 10 月加温で完全に水没、金型でそれぞれの胚を垂直方向に配置します</li>。
	<li>凍結するティッシュのブロックをドライアイス、凍結する 70% エタノールお風呂で直立した場所。-80 でブロックをストア ° C</li>
	<li>は-22 ° c クライオスタット温度を設定し、全体の大動脈、10-20 μ m の厚さを横断を生成するブロックをカットします。RT-80 でそれらを格納する前に 30 分間のスライドを乾燥 ° C</li>
	<li>は、RT、fluorophores の漂白を避けるために光から保護でスライドを解凍します。0.1% PBS Tween20 とスライドを洗います。
	<ol><li>クローン解析核 (DAPI、5 mg/mL) のスライドを染色し、直接画像虹 Cre 記者の他のフルオロ (セルリアン: 433 nm 励起 max, 475 nm 蛍光最大; mOrange: 548 nm、562 nm; mCherry: 587 nm, 610 nm)。
		<ol><li>正立型蛍光顕微鏡で蛍光物質を検出するために、次のフィルター使用: DAPI (励起/最大帯域幅 350/50 nm、排出量最大/帯域幅 460/50 nm)、セルリアン (励起 436/20 nm、発光 480/40 nm), テキサスの赤 (励起 560/40 nm、発光 630/75 nm) と mOrange (励起 577/10 nm、発光 630/50 nm) から mCherry を分離するカスタム フィルター</li>。
		</ol></li> <li>MTmG Cre 記者と運命のマッピング、GFP を検出 (484 nm、510 nm)、直接イメージングまたは免疫染色を用いた。正立型蛍光顕微鏡イメージングのため GFP フィルター (励起 470/40 nm、発光 525/50 nm) を使用します</li>。
		<li>免疫染色、4 ° C で一晩一次抗体を持つセクションを孵化させなさい、0.1% で PBS でトリトン X-100 を洗浄し 1 h. 使用反 CD31 の二次抗体とインキュベートし (最終濃度 0.0016 mg/mL)、抗 GFP (0.006 mg/mL) と。Cy3-直接共役アンチ SMA (1: 500 最終希釈倍率の一次抗体と二次 antibodie を使用フルオロ (1: 500 最終希釈) (材料の表 を参照) を直接共役 s.</li>
	</ol></li> <li>正立型蛍光顕微鏡でスライドを画像 (倍率: 4 X - 20 X) または共焦点顕微鏡 (10 X-63 X)。高倍率 1.4 0.6 の開口と 1,024 x 1,024 ピクセルのフレーム サイズ油目的 x 共焦点イメージングの 63 を使用します</li>。
</ol> 2。胚大動脈文化を外植体 注: このアプローチ、explanted の狭窄に beta3 のインテグリンの役割を評価に使用していた 今回の Eln (-/-) 胚大動脈 9 , 18. <ol><li>上 1.8、ステップごとの過剰イソフルラン吸入による E15.5 でタイミング妊娠中ダムを安楽死させる</li>。
	<li>収穫上 1.9-1.10 の手順に従って、胚を安楽死させると</li>。
	<li>葉末胚の位置し、解剖ボードに拡張四肢をピンします。郭清堅実で視覚化し、上部胸郭に胸骨を通じて腹部から縦切開をカットするはさみを使用してください。解剖まで胸腺、気管、肺、食道、肝臓、腸管</li>。
	<li>ゆっくりと引き腹鉗子を用いた心臓、胸部および腹部の空洞の背側面から大動脈の解剖はさみを使っています。大動脈を解放するために近位のルートと遠位腹部位置カットします</li>。
	<li>は、携帯文化フードで氷冷滅菌 PBS に大動脈を配置します。24 ウェル プレートに大動脈を転送し、DMEM で 0.5% で培養 37 24 h までの FBS ° C 
	注: 培養培地はブロッキング抗体 (例えば、 0.02 mg/mL 9 時 αvβ3 抗体を抗インテグリン; 参照 テーブルの材料) や薬理学的エージェントと補われることができます</li>。
	<li>20 分の 4% パラホルムアルデヒドで固定し、PBS で 2 回大動脈を洗う</li>
	PBS のショ糖を <li>PBS と 30% で 1.5 mL チューブへの転送、大動脈で 3 回洗う。大動脈は流し後、する凍結するティッシュのブロック、カット セクション、および immunostain、1.13 1.15 の手順で上記のよう</li>。
</ol> 3。周産期の大動脈から SMC 分離 注: このアプローチは現在周産期マウス Eln (-/-) と野生型マウスから分離した大動脈平滑筋細胞の生物学を比較する使用されている。
<ol><li>、マウス子犬生後 (P) で 0.5、頚部転位または手術用はさみで斬首刑のいずれかまたは鋭い刃、1.10 の手順に記載されている上記安楽死</li>。
	<li>は、2.3 の手順を実行し、胸部・腹部を開くと後、23 G 針で左心室を穿刺します。滅菌 PBS 含む注射器に針を接続するプラスチック製のチューブを使用は、PBS が重力によって左心室に流し込まれるように高い位置で垂直に開催。ブランシュは肝臓までは、左心室に滅菌 PBS の注入を許可します。
	<ol><li>鉗子を使用して大動脈の外側に外の組織を削除し、ステップ 2.4 で説明されているように、大動脈を解剖します</li>。
	</ol></li> <li>DMEM の単一のソリューションで大動脈をダイジェスト 225 U/mL コラゲナーゼ、2.25 U/mL エラスターゼ 1 x 37 ° C. 手動で振るの 45 分の抗生物質抗真菌とチューブ 5-10 分毎で補われる (500 μ L)</li>
	<li>無菌細胞文化フード、titurate、上下単一細胞懸濁液を生成する 200 μ L ピペットでピペッティングによる消化組織。単一細胞懸濁液を 15 mL チューブに転送、DMEM、2 mL を加えるし、5 分 25 で 920 × g で遠心分離機 ° C</li>
	<li>は、上清を捨てます。SMC 培養液 (10 %fbs 添加 1 μ G/ml rhFGF、10 μ G/ml rhEGF、100 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン、2.5 μ g/mL アムホテリシン B を含む DMEM) 3 mL の細胞ペレットを再懸濁します。35 mm 培養プレートに転送します 。
	注: 最初の分離時に単一 P0.5 野生型大動脈; から取得されます ~ 400,000 セル~ 300,000、これらの細胞は平滑筋細胞</li>。
	<li>は 37 ° C で細胞の培養し、新鮮な SMC 培 3 日ごとに変更します。標準的な手法を使用して、トリプシン、合流するときのセルを通路します。実験、3-7 の通路からセルを使用します</li>。
</ol> 4。皮下の妊娠 (または非妊娠中) 浸透圧のミニ ポンプ配置マウス 注: このアプローチは以前に使用した (例えば、 インテグリン β3 と β5 阻害剤の薬理学的エージェントを継続的に提供するにはcilengitide) 胚の 子宮内で 9 に。ポンプが E13.5 に妊娠中のダムで挿入され分娩まで維持されます。
<ol><li>麻酔と酸素 (1 L/分の流量) 誘導とメンテナンスのための 1-3% の 2-5% イソフルレン マウス。麻酔のレベルを監視するつま先ピンチ反射を使用し、必要に応じて麻酔薬を調整します。鎮痛に対する皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します</li>。
	<li>は、背中の下部をバリカンで剃る。滅菌ドレープ、手袋、および計測器を使用し、手術中に加熱外科板でマウスを維持します</li>。
	<li>腹臥位でそれぞれにマウスを置き、イソプロピル アルコールに続いて betadine で背中をスクラブします。3-5 cm より低い背部の尾の根元に吻側水平皮膚切開 0.5 - 1.0 cm の基になる筋肉を傷つけることがなく長さを作るメスを使用します</li>。
	<li>挿入、止血、切開、止血顎の開閉によりポンプ注入の吻方皮下ポケットを作成します</li>。
	<li>は、メーカーごとの選択のエージェントにミニ浸透圧ポンプを埋める &#39; s ガイドライン (材料の表 を参照してください)。ポケットにいっぱいポンプを挿入し、クリップまたは 6-0 非吸収性縫合糸で切開を閉じる。総手術時間が 10 分未満であることを確認</li>
	<li>は, 胸骨の横臥から回復が彼らまでマウス 15 分毎を監視します。48 時間毎の 6-12 h 皮下ブプレノルフィン (0.05 - 0.1 mg/kg) を管理します。マウスは、全身麻酔から完全に回復して、毎日それらを監視します。クリップの削除手術 7-10 日後に縫合糸またはします</li>。
</ol>

<ol><li>Shankman, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KLF4-dependent+phenotypic+modulation+of+smooth+muscle+cells+has+a+key+role+in+atherosclerotic+plaque+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis.</a> Nat Med. 21, 628-637 (2015).</li>
<li>Rowe, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cell+apoptosis+in+aneurysmal%2C+occlusive%2C+and+normal+human+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cell apoptosis in aneurysmal, occlusive, and normal human aortas.</a> J Vasc Surg. 31, 567-576 (2000).</li>
<li>Rodella, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+aortic+aneurysm+and+histological%2C+clinical%2C+radiological+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochem%22%5BJournal%5D)">Abdominal aortic aneurysm and histological, clinical, radiological correlation.</a> Acta Histochem. 118, 256-262 (2016).</li>
<li>Lewandoski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+control+of+gene+expression+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Conditional control of gene expression in the mouse.</a> Nat Rev Genet. 2, 743-755 (2001).</li>
<li>Lakso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+oncogene+activation+by+site-specific+recombination+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Targeted oncogene activation by site-specific recombination in transgenic mice.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6232-6236 (1992).</li>
<li>Metzger, D., Clifford, J., Chiba, H., Chambon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+site-specific+recombination+in+mammalian+cells+using+a+ligand-dependent+chimeric+Cre+recombinase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Conditional site-specific recombination in mammalian cells using a ligand-dependent chimeric Cre recombinase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 6991-6995 (1995).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Lighthouse, J. K., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+developing+artery+muscularization+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of developing artery muscularization in pulmonary hypertension.</a> Cell Rep. 6, 809-817 (2014).</li>
<li>Greif, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+construction+of+an+arterial+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Radial construction of an arterial wall.</a> Dev Cell. 23, 482-493 (2012).</li>
<li>Misra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+beta3+inhibition+is+a+therapeutic+strategy+for+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Integrin beta3 inhibition is a therapeutic strategy for supravalvular aortic stenosis.</a> J Exp Med. 213, 451-463 (2016).</li>
<li>Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+cell+progenitors+are+primed+to+muscularize+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension.</a> Sci Transl Med. 7, (2015).</li>
<li>Wirth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G12-G13-LARG-mediated+signaling+in+vascular+smooth+muscle+is+required+for+salt-induced+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension.</a> Nat Med. 14, 64-68 (2008).</li>
<li>Wendling, O., Bornert, J. M., Chambon, P., Metzger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+temporally-controlled+targeted+mutagenesis+in+smooth+muscle+cells+of+the+adult+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Efficient temporally-controlled targeted mutagenesis in smooth muscle cells of the adult mouse.</a> Genesis. 47, 14-18 (2009).</li>
<li>Badea, T. C., Wang, Y., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+noninvasive+genetic%2Fpharmacologic+strategy+for+visualizing+cell+morphology+and+clonal+relationships+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A noninvasive genetic/pharmacologic strategy for visualizing cell morphology and clonal relationships in the mouse.</a> J Neurosci. 23, 2314-2322 (2003).</li>
<li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li>
<li>Kumar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+cells.+Defining+a+mesenchymal+progenitor+niche+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal cells. Defining a mesenchymal progenitor niche at single-cell resolution.</a> Science. 346, 1258810(2014).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Dev Biol. 1, 4(2001).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+is+an+essential+determinant+of+arterial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Elastin is an essential determinant of arterial morphogenesis.</a> Nature. 393, 276-280 (1998).</li>
<li>Miano, J. M., Cserjesi, P., Ligon, K. L., Periasamy, M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle+myosin+heavy+chain+exclusively+marks+the+smooth+muscle+lineage+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle myosin heavy chain exclusively marks the smooth muscle lineage during mouse embryogenesis.</a> Circ Res. 75, 803-812 (1994).</li>
<li>Curran, M. E., Atkinson, D. L., Ewart, A. K., Morris, C. A., Leppert, M. F., Keating, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elastin+gene+is+disrupted+by+a+translocation+associated+with+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The elastin gene is disrupted by a translocation associated with supravalvular aortic stenosis.</a> Cell. 73, 159-168 (1993).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+arterial+pathology+in+mice+and+humans+hemizygous+for+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Novel arterial pathology in mice and humans hemizygous for elastin.</a> J Clin Invest. 102, 1783-1787 (1998).</li>
<li>Li, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastin+point+mutations+cause+an+obstructive+vascular+disease%2C+supravalvular+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Elastin point mutations cause an obstructive vascular disease, supravalvular aortic stenosis.</a> Hum Mol Genet. 6, 1021-1028 (1997).</li>
<li>Pober, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Williams-Beuren syndrome.</a> N Engl J Med. 362, 239-252 (2010).</li>
<li>Pober, B. R., Johnson, M., Urban, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+treatment+of+cardiovascular+disease+in+Williams-Beuren+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and treatment of cardiovascular disease in Williams-Beuren syndrome.</a> J Clin Invest. 118, 1606-1615 (2008).</li>
<li>Holtwick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smooth+muscle-selective+deletion+of+guanylyl+cyclase-A+prevents+the+acute+but+not+chronic+effects+of+ANP+on+blood+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Smooth muscle-selective deletion of guanylyl cyclase-A prevents the acute but not chronic effects of ANP on blood pressure.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 7142-7147 (2002).</li>
<li>Boucher, P., Gotthardt, M., Li, W. P., Anderson, R. G., Herz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRP%3A+role+in+vascular+wall+integrity+and+protection+from+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LRP: role in vascular wall integrity and protection from atherosclerosis.</a> Science. 300, 329-332 (2003).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+adult+smooth+muscle+cell-targeted+Cre+recombinase+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of an adult smooth muscle cell-targeted Cre recombinase mouse model.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26, 23-24 (2006).</li>
<li>Armstrong, J. J., Larina, I. V., Dickinson, M. E., Zimmer, W. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+artificial+chromosome+transgenic+mice+expressing+mCherry+fluorescent+protein+substituted+for+the+murine+smooth+muscle+alpha-actin+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial artificial chromosome transgenic mice expressing mCherry fluorescent protein substituted for the murine smooth muscle alpha-actin gene.</a> Genesis. 48, 457-463 (2010).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li>
<li>Yokota, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+lacks+a+transplantable+progenitor+for+smooth+muscle+type+alpha-actin-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone marrow lacks a transplantable progenitor for smooth muscle type alpha-actin-expressing cells.</a> Stem Cells. 24, 13-22 (2006).</li>
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マウスの大動脈とその主要な枝動脈硬化のモデルなど、大人の病理学の条件の広範な調査とは対照的形態形成と胚および周産期の大動脈の病原性について知られています。ここでは、具体的には平滑筋細胞、胚/周産期大動脈に着目し、体内組織植を介して大動脈を研究するためのプロトコルを提供し、SMC の分離方法します。これらの無料の方法は、胚/周産期の大動脈を研究する様々 なアプローチの調査官を提供します。
クローン解析は、個々 のセルの動作を調査することができます非常に強力な方法です。最近10肺血管に特殊な平滑筋細胞を識別するためにこの方法を使いました。マルチカラー Cre 記者を運ぶ個体のマウス、同じ色のセルが 1 つ以上の再結合イベントから派生するチャンスがあることを認識が重要です。したがって、マルチカラー記者とクローンの解析には、多数のマウスの評価が必要となります。中期後期妊娠期間にタモキシフェンが中期後期妊娠期間で細胞をマーク、後天的、それらをトレース実験のための分娩に干渉するためプロゲステロンとタモキシフェン付随して注入する必...

多細胞生物の細胞に栄養素と酸素を提供する関数の循環システム、ない外部環境と接触して、これらの細胞からの老廃物や二酸化炭素を削除します。脊椎動物、主循環システムは、ポンプ血血管のシリーズを通して、心で構成されます。動脈や、静脈などの太い血管の壁から成っている 3 つの層: 私) 内膜や血管内皮細胞の内側の層ii) メディア、または交互に円周方向の中間層細長い平滑筋細胞平滑筋細胞と弾性線維板;および iii) 外膜や結合組織、線維芽細胞の外側の層。血管生物学の研究の大半は血管内皮細胞に焦点を当てる、血管新生を新しい内皮細胞ライニング管の形成を調査します。比較では、平滑筋細胞は、比較的ほとんど注目を します。ただし、平滑筋細胞、血管病理、通常の動脈壁の建設に重要な細胞タイプです。
大動脈は心臓の左心室からの心拍出量を受けて体内最大口径動脈です。それは、多様な人間の病気、動脈硬化、動脈瘤、解離などに悩まされています。大人の有機体の大動脈とその主要な枝に激しく調査血管疾患のモデルで。例えば、供給が低比重リポ蛋白受容体またはアポリポ蛋白 E 遺伝子の null マウス高脂肪食を開発、動脈硬化と運命のマッピングの最近の研究を示す既存の平滑筋細胞がの種類の細胞に上昇を与える、動脈硬化性プラーク1。大動脈瘤の病理学的変化があります SMC アポトーシスと細胞外マトリックス2,3を改造します。
大幅に少ないは胎生期および周産期の期間中に SMC の形態形成と病態について知られています。ここでは、胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞体内の組織移植片の細胞を研究するためプロトコルを提供します。例えば、プロトコルの最初のセクションは、運命とマウス胎仔のクローン解析を区切ります。セル固有のプロモーターの制御下を表明した Cre リコンビナーゼを容易に特定のセルのマーキングとその子孫4,5,6;ただし、セル固有のラベルの時間的制御はマウスの萌芽期の開発中に挑戦することができます。この文脈において胚平滑筋細胞 (e.g.,Myh11またはActa2)、Cre 記者プロモーターの下で条件付きクレエを表現する私たちを提供タモキシフェンまたはその活性代謝物 4-オハイオ州 - にタモキシフェン妊娠中ダムを注入するための方法胚や生後の子孫の標識細胞を分析するため。さらに、運命のマッピングの研究、主に利用する単一記者 fluorophore1,7と Cre 記者と対照をなしてクローン解析大幅にマルチカラー Cre 記者と強化されています。
プロトコルの 2 番目と 3 番目のセクションでは、分離、それぞれ胚大動脈および新生児期から大動脈平滑筋細胞を培養するための方法を説明します。こうした方法により、特に大動脈弁植の平滑筋細胞のシグナル伝達経路の操作と薬理学的エージェントの直接影響を分析します。したがって、マウスの伝統的な遺伝子操作をよりもはるかに速い方法で興味のティッシュの特定の遺伝子の役割を検査します。さらに、孤立した SMC 研究細胞遊走の解析が容易し、付着性は、技術的には、限定の生体内。
最後に、4 番目のプロトコル セクションは、皮下浸透圧ミニ ポンプ搭載されて妊娠中 (または非妊娠) のマウスにおける薬理学的エージェントの配置を区切ります。このメソッドは、急速な代謝のための連続的な注入を必要とするエージェントによる胚の発育に及ぼす影響の分析を促進します。頻繁に注射の代替多くの代理店のための実用的ではない、それは妊娠中のダムにかなりの不快感を引き起こす可能性があります避ける必要があります。

<table><tbody><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>T5648</td><td></td></tr>コーン<tr><td>油</td><td>シグマ</td><td>C-8267</td><td>タモキシフェン</td></tr><tr><td>4-OH-タモキシフェン</td><td>シグマ</td><td>H7904</td>の<td>活性代謝物タモキシフェン</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマ</td><td>P8783-5G</td><td>の半分の濃度でタモキシフェン</td></tr><tr><td>OCT化合物</td><td>サクラティッシュテック</td><td>4583</td>の濃度で使用クライ<td>オブロックを作るため</td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>Polysciences inc</td><td>18986</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>IHC staining of nucleus, final concentration 5 mg/mL</td></tr><tr><td>Cy3 directly conjugated anti-SMA antibody</td><td>Sigma</td><td>A2547</td><td>IHC staining of SMA, final dilution 1:500</td></tr><tr><td>Anti-CD31 antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>550274</td><td>IHC staining of GFP, final concentration 0.006 mg/mL</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11121</td><td>IHC染色 CD31、最終濃度 0.0016 mg/mL</td></tr><tr><td>二次抗体 ヤギ抗ウサギ、Alexa 647</td><td>Life Technologies</td><td>a21244</td><td>IHC染色、最終濃度 0.004 mg/mL</td></tr> 二次<tr><td>抗体ヤギ抗ウサギ、Alexa 488</td><td>Life Technologies</td><td>a11008</td><td>IHC染色、最終濃度 0.004 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10567-014</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>抗インテグリンβ3ブロッキング抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553343</td><td>Clone 2C9.G2、最終濃度 0.02 mg/mL</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>44H14977A</td><td>大動脈の消化用</td></tr><tr><td>エラスターゼ</td><td>Worthington Biochemical Corp</td><td>34K15139</td><td>大動脈の消化用</td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌薬 (100X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF</td><td>Promega</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>Promega</td><td>G5021</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシン B</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td>コーニング</td><td>CLS430165</td><td></td></tr><tr><td>アルゼット 浸透圧ミニポンプ</td><td>Durect Corporation</td><td>2001</td><td></td></tr><tr><td>ECLIPSE 80i Upright蛍光顕微鏡</td><td>ニコン&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;TCS&nbsp;SP5</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myh11-CreERT2 マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>19079</td><td></td></tr><tr><td>Acta2-CreERT2 マウス</td><td></td><td></td><td>Pierre Chambon 博士と Daniel Metzger の研究室から入手</td></tr><tr><td>ROSA26R-CreERT2 マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>8463</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(mTmG/mTmG)マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>&nbsp;</td><td></td>026862</tr><tr><td>ROSA26R(EYFP/EYFP)マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>&nbsp;006148&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Confetti/紙吹雪)マウス</td><td>ジャクソン研究所&nbsp;</td><td>13731</td><td></td></tr><tr><td>ROSA26R(Rb/Rb) マウス</td><td>Irv Weissman 博士</td>の<td>研究室 Irv Weissman</td><td></td> 博士の研究室から入手</tr></tbody></table>

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

大動脈は体の最大の動脈です。大動脈の壁は、内皮細胞の内側の層、中間層の弾性線維板と平滑筋細胞 (SMCs) 交互になると線維芽細胞と細胞外マトリックスの外側の層で構成されます。病態モデル (例えば、アテローム性動脈硬化) 成人の大動脈での広範な研究とは異なり、はるかに少ない胎生期および周産期の大動脈について知られています。ここでは、我々 は平滑筋細胞に焦点を当てる形態形成の解析や正常な開発および病気の胎生期および周産期大動脈平滑筋細胞の病因のプロトコルを提供します。具体的には、4 つのプロトコルが含まれている: 私)生体内で胚運命マッピングとクローンの解析;ii) 胚大動脈培養;周産期の大動脈; iii) SMC 分離・ iv) 妊娠 (または非妊娠) マウス皮下浸透圧ミニ ポンプ配置。したがって、これらのアプローチは、origin(s)、運命、そして大動脈の生体内における平滑筋細胞のクローン構造の調査を促進します。薬理学的エージェントへの継続的な暴露によって胚大動脈形態形成子宮内で調節できます。さらに、孤立した大動脈組織外植片または大動脈平滑筋細胞は muscularization、増殖、移動などの基本的なプロセスの間に特定の遺伝子ターゲットの役割に洞察力を得るために使用することができます。孤立した平滑筋細胞と器官培養切片の大動脈にこれらの仮説を生成する実験は、薬理学的および遺伝的アプローチを通じて体内のコンテキストで評価できます。

代表的なクローン性解析で平滑筋細胞のEln (細胞外マトリックス蛋白質エラスチン遺伝子) の変異株の胚運ぶまた Eln(+/-) マウスにEln(+/-)、Acta2 クレエT2マウスを交配、マルチカラー ROSA26R(Rb/Rb)記者。手順 1 で説明したプラグがチェックされ、E12.5 で単一タモキシフェン注入 (1.5 mg) で誘導された妊娠中のダム、彼らが E18.5 で犠牲になった。胚は、収穫、固定、冷凍、および誘因でした。横行大動脈凍結切片を降順がカットされました。Eln(+/-)、Acta2 クレエT2からのセクションROSA26R(Rb/+) 今回の Elnに蓄積する過剰な内側の層の平滑筋細胞胚を示す-null マウス (E15.5 以降) は、複数の色 (によって示される<strong cl...

ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

これらの手順の全体的な目的は、正常な発達過程における胚期および周産期の大動脈壁の形成、ならびに疾患時にこの過程で生じる摂動を研究することです。この手法は、胚期および周産期の血管中膜を構成する細胞の起源は何かという、血管発達分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、胚期および周産期の発達段階で起こる平滑筋の病態形成および形態形成の評価が可能であることです。これらの手法は、過剰な平滑筋細胞の産生を引き起こす周期性疾患などの、上大動脈弁上狭窄症を含む血管疾患の治療への応用に向けたものです。ミニポンプの留置処置は、イェール大学のマイクロサージェリーコアを率いる研究員であるJiasheng Zhang博士によって行われます。まず、Cre ERを発現する生後2か月から6か月のマウスと、Creレポーターマウスを交配させます。毎朝、金属製プローブを用いて膣栓を確認し、膣栓が検出された場合は雌を雄から分離します。胚発生初期に誘導を行う場合は、妊娠した雌の腹腔内にタモキシフェンを注射します。妊娠中期から後期にかけて細胞を標識し、出生後のマウスにおける細胞の運命またはクローナリティを追跡する場合は、妊娠した雌の腹腔内に、タモキシフェンと1:2の用量比でプロゲステロンを併用して注射します。適切な胚日に胚を回収するため、妊娠したダムの腹部を70% ethanolで洗浄し、ハサミを用いて腹部を切開して子宮を取り出します。ステレオ顕微鏡下でピンセットを使用し、胎盤および卵黄嚢から慎重に分離させて子宮から胚を回収します。回収した胚を4% paraformaldehydeに浸し、4°Cで2時間固定します。続いて、過剰な固定液を除去するためにPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、胚が沈むまで、個別の15 milliliterチューブに入れ、PBSで調製した30%sucrose中で胚をインキュベートします。次に、プラスチック製の凍結用モールドにOCTコンパウンドを最大容量の3分の2まで満たし、各モールドに胚を1つずつ垂直に配置します。室温で10分間放置した後、組織をドライアイスと70%エタノールの混合浴に直立させて凍結させ、クライオスタットの温度を22℃に設定する。組織ブロックをセクショニングし、各大動脈の全域にわたって厚さ10〜20μmの横断切片を作成し、得られた各切片をガラス製顕微鏡スライドに回収する。すべてのサンプルを回収した後、スライドを室温で30分間乾燥させ、その後80℃で保存する。組織サンプルを染色するには、スライドを室温で解凍し、蛍光色素の退色を防ぐため遮光した状態で、0.1%PBS twin 20で洗浄します。クローン解析を行う場合は、組織を適切な核染色剤で染色し、蛍光顕微鏡を用いてrainbow creレポーターの他の蛍光色素を直接イメージングします。運命マッピングを行う場合は、mTmG creレポーターを用いて、免疫染色の有無にかかわらずGFPの発現を直接イメージングにより可視化します。胚大動脈を培養し、摘出するには、ステレオ顕微鏡下で胚を仰臥位に置き、伸ばした四肢を解剖板に固定します。ハサミを使用して、腹部から胸骨を経て上胸部まで垂直に切開します。細い気管、肺、食道、肝臓、および腸を解剖して取り除きます。ピンセットを用いて心臓を腹側にそっと引き寄せ、ハサミを使用して胸腔および腹腔の背側から大動脈を剥離します。大動脈を近位根部と遠位腹部位置で切断して取り出し、細胞培養フード内で、滅菌済みの氷冷PBSに入れます。短時間洗浄した後、大動脈を0.5%PBSを添加したDMEM培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに移し、プレートを細胞培養インキュベーターに最大24時間置きます。インキュベーションの終了後、大動脈をPBSで2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒドで20分間固定します。さらに3回PBSで洗浄した後、組織が沈むまで30%スクロースPBSを含む1.5 milliliterチューブに大動脈を移します。周産期大動脈平滑筋細胞の単離では、23ゲージの針を用いて生後0.5日のマウスの左心室を穿刺し、プラスチックチューブで針を滅菌PBSを含むシリンジに接続します。シリンジを高い位置に垂直に保持し、重力によってPBSが左心室に流れ込むようにします。肝臓が白くなったところで、ピンセットを用いて大動脈外側の外膜組織を除去し、実演した通りに大動脈を採取します。大動脈組織を500 µLの消化液に入れ、5〜10分おきに手で振盪して解離させます。45分後、チューブを滅菌済みセルカルチャーフードに移し、200 µLピペットを用いて、単一細胞懸濁液が得られるまで組織スラリーをトリチュレーションします。細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、2 mLのDMEMを加えて遠心分離により細胞を回収します。ペレットを3 mLの平滑筋細胞培養液で再懸濁し、35 mm培養プレートに播種します。その後、プレートを37 °Cのインキュベーターに入れ、3日ごとに培養液を更新します。皮下浸透圧ミニポンプを留置するには、まず麻酔をかけたマウスの腰下部をバリカンで除毛し、加熱外科プレートの上に腹臥位で固定します。背部をベタジンとイソプロピルアルコールで洗浄し、マウスを実体顕微鏡下に置きます。次に、メスを用いて、尾の付け根から吻側へ約3〜5 cmの位置に、下層の筋肉を傷つけないよう注意しながら、0.5〜1 cmの水平な皮膚切開を加えます。止血鉗子を切開部に入れ、鉗子の顎を開閉して皮下ポケットを作成します。目的の薬剤を充填した浸透圧ミニポンプをポケット内に挿入し、6-0非吸収性縫合糸を用いて切開部を閉鎖します。その後、マウスが胸骨伏臥位になるまで、観察しながら回復させます。細胞外マトリックスタンパク質であるエラスチンをコードする遺伝子の変異胚では、胚齢15.5日後から大動脈の内層に平滑筋細胞が過剰に蓄積します。この過程におけるマルチカラーCreレポーターを用いた平滑筋細胞のクローン解析により、細胞が多色であり、したがってポリクローナルであることが示されています。摘出した大動脈切片の免疫染色により、エラスチン変異体の胚齢15.5日の大動脈は、培養後18時間以内に過剰な筋形成と狭窄を起こすことが明らかになり、この過程はアンチインテグリンβ3ブロック抗体の添加によって抑制されます。出生後0.5日の野生型マウスの大動脈から単離された平滑筋細胞は、平滑筋細胞マーカーを発現するが、CD31は発現しない。胚発生13.5日目から妊娠中の母マウスにインテグリンβ3阻害剤を持続注入すると、細胞外マトリックスタンパク質であるエラスチンの変異マウスにおける大動脈狭窄および過剰な筋層形成が有意に抑制されるが、野生型マウスの大動脈には影響を与えない。浸透圧ミニポンプの留置技術を習得すれば、適切に実施することで10分以内に完了させることができます。これらの手順に従うことで、胃腸管の組織や肺領域などの、血管系以外の平滑筋を含む組織の研究にも同様の手法を応用することが可能です。このビデオを視聴することで、生体内（in-vivo）での胚フィットマッピングおよびクローン解析の実施方法、摘出した胚大動脈および周産期大動脈平滑筋細胞の培養方法、そして皮下留置した浸透圧ミニポンプの回収方法について十分に理解できるはずです。マウス、タモキシフェン、および固定レデューサーを用いた操作には危険が伴うため、これらの手順を行う際は、手袋および白衣の着用など、十分な注意を払い、常に予防策を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々はマウス胚の四肢の皮膚に複雑な血管網の形成を分析するために複数のラベルで共焦点顕微鏡を走査型ホールマウントの免疫組織化学とレーザーをご紹介。...

胚肢の皮膚の血管系のためのホールマウント免疫組織化学的解析：胚における血管分岐形態形成を研究するモデルシステム

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

我々は、（E）9.5およびそれ以降の段階の胚日でのマウス胚内に胚または多能性細胞に由来する内因性および移植細胞の細胞運命および表現型の両方を監視するために、染料を注入するためにDNAベクター、ウイルス、および細胞を一連の方法を記載開発。...

マウス胎児心臓の開発に細胞標識と注入

大動脈の病理は、重篤な罹患率と死亡率につながる可能性があるため、疾患の進行と潜在的な治療法の研究が必要です。ここでは、研究者が心血管疾患の調査を支援するために、マウス大動脈を分離して切除するプロトコルを紹介します。...

単離とマウス大動脈の切除。心血管疾患の研究で多彩なテクニック

この原稿は、発達中の血管系を可視化する技術について説明しています。ここでは、マウス胚に対する子宮内FITC標識トマトレクチンマイクロインジェクションを利用しました。この技術を使用して、胚腎臓全体の灌流血管と灌流されていない血管を描きます。...

マウス胚に子宮内 、心臓内トマトレクチン注射では腎血流量を測定する

小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

我々は、光のクリアランス、共焦点顕微鏡に続く標準的な免疫学的染色法を用いて、E15.5までの全胚マウス心臓における冠血管の分析のためのプロトコルを提示します。この技術は、連続切片の時間のかかる分析を必要とすることなく、心臓全体にわたって血管の可視化を可能にします。...

クリア胚ハーツにおける冠状血管の分析

このプロトコルは、脈管構造を視覚化し、 Xenopus tropicalisにおけるその複雑性を定量化する蛍光ベースの方法を実証する。インビボでの心臓血管発達を研究するために、遺伝的および/または薬理学的操作の後、胚の拍動する心臓に蛍光色素を注入した後、数分後に血管を撮像することができる。...

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鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

古典的には、マウス胚性弁原基の心内膜は、横切片、冠状切片、または矢状切片を用いて分析されてきた。弁形成領域の心内膜の...

エンフェイス マウス胚の平面形態形成解析のための心内膜クッション作製

学ぶマウスの大動脈形態形成と血管発生のメカニズム。in vivoクローン解析と運命マッピングを用いて、胚・周産期の平滑筋細胞由来と病態を解明する手法を解説。血管疾患治療への応用も示唆される。

体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには

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