体内と組織や細胞植アプローチを使用して形態形成と胚および周産期の大動脈の病因を研究するには
2017年9月12日
ここで体内のクローン解析運命マッピング、大動脈植と単離平滑筋細胞の詳細を使用して萌芽期および周産期のマウス大動脈を勉強するためのプロトコル。これらの多様なアプローチは、通常開発の萌芽期および周産期の大動脈の疾患の病態形成の調査を促進します。
これらの手順の全体的な目標は、正常な発達中の胚性および周産期の大動脈壁の形成、および疾患中のこのプロセスの摂動を研究することです。この方法は、胚および周産期の血管培地に寄与する細胞の供給源は何かなど、血管発生分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、発生の胚期および周産期に発生する平滑筋の病因と形態形成を評価できることです。
これらの技術の意味は、過剰な相撲細胞産生を引き起こす周期性疾患の弁上性大動脈弁狭窄症などの血管疾患の治療に起因しています。ミニポンプの配置手順は、マイクロサージェリーコアを指揮する研究員であり、イェール大学であるJiasheng Zhang博士が行います。まず、Cre ERを持つ生後2〜6か月のマウスとCreレポーターを持つマウスの間で交配ペアを設定します。
金属製のプローブを使用して、毎朝膣栓をチェックし、栓が検出されたときに女性と男性を分離します。早期胚誘発のために、妊娠中の湿疹にタモキシフェンを腹腔内に注射します。.妊娠期間中期から後期の細胞をマークし、出生後のマウスでそれらの運命またはクローン性を追跡するために、妊娠中の腹腔内にプロゲステロンを注入します 湿ったタモキシフェンと1〜2の用量比で無能に
。適切な胚の日に胚を収穫するには、70%エタノールで湿った妊娠中の腹部を清潔にし、はさみを使用して腹部を開き、子宮を取り出します。鉗子と実体顕微鏡を使用して子宮から胚を採取し、胎盤と卵黄嚢から慎重に分離します。胚を4%パラホルムアルデヒドで摂氏4度で2時間固定します。
その後、PBSで3回洗浄して余分な固定剤を取り除きます。3回目の洗浄後、胚が沈むまで、PBS中の30%スクロースで、個々の15ミリリットルチューブで胚をインキュベートします。次に、プラスチック凍結型に最適な切断温度を充填し、最大体積の3分の2までコンパウンドし、各型に1つの胚を垂直に配置します。
室温で10分後、組織をドライアイス70%エタノール浴で直立させて凍結し、クライオスタットの温度を摂氏22度に設定します。組織ブロックを切片にして、各大動脈全体にわたって厚さ10〜20マイクロメートルの横方向の組織スライスを生成し、得られた各切片をガラス顕微鏡スライドで捕捉します。すべてのサンプルを取得したら、スライドを室温で30分間乾燥させてから、80°Cで保存します。
組織サンプルを染色するには、スライドを室温で解凍し、蛍光色素の漂白を避けるために光から保護し、0.1%PBS twin 20でスライドを洗浄します。クローン解析では、適切な核色素で組織を染色し、蛍光顕微鏡でレインボークレレポーターの他のフルオロフォアを直接イメージングします。フェイトマッピングでは、mTmG cre レポーターを使用して、免疫染色の有無にかかわらず、直接イメージングによりGFP発現を可視化します。
胚性大動脈を培養して移植するには、胚を仰臥位に置き、伸ばした手足を実体顕微鏡下の解剖ボードに固定します。はさみを使用して、腹部から胸骨を通って胸部上部まで垂直に切開します。最高の気管肺、食道、肝臓、腸を解剖します。
鉗子を使用して心臓を腹側にそっと引っ張り、はさみを使用して大動脈を胸腔と腹腔の背側から離剖します。近位根と遠位腹部の位置で大動脈を切断して解放し、採取した大動脈を細胞培養フード内の滅菌氷冷PBSに入れます。短時間の洗浄後、大動脈を0.5%PBSを添加したDMEM培地を含む24ウェルプレートの1ウェルに移し、プレートを最大24時間細胞培養インキュベーターに置きます。
インキュベーションの終わりに、大動脈をPBSで2回洗浄し、組織を4%パラホルムアルデヒドで20分間固定します。さらに3回のPBS洗浄後、組織が沈むまで大動脈を30%スクロシンPBSを含む1.5ミリリットルのチューブに移します。.周産期大動脈平滑筋細胞の分離には、23ゲージの針を使用して出生後0.5マウスの左心室に穴を開け、プラスチックチューブを使用して針を滅菌PBS入りシリンジに接続し、垂直に高い位置に保持して、PBSが重力によって左心室に流れ込むようにします。
肝臓が白くなったら、鉗子を使用して大動脈の外側の外膜組織を取り除き、先ほど示したように大動脈を採取します。500マイクロリットルの消化液で大動脈組織を解離し、5〜10分ごとに手動で振とうします。.45分後、チューブを滅菌細胞培養フードに移し、200マイクロリットルのピペットを使用して、単一細胞懸濁液が得られるまで組織スラリーを粉砕します。
細胞を15ミリリットルの円錐管に移し、次に2ミリリットルのDMEMを追加し、遠心分離によって細胞を回収します。ペレットを3ミリリットルの平滑筋細胞培養培地に再懸濁し、細胞を35ミリメートルの培養プレートに播種します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターに入れ、細胞培養培地を3日ごとにリフレッシュします。
皮下浸透圧ミニポンプを配置するには、麻酔をかけたマウスの腰をバリカンで剃ることから始め、マウスを加熱された手術プレートの腹臥位に置きます。ベタジンとイソプロピルアルコールで背中をこすり、マウスを実体顕微鏡の下に置きます。次に、メスを使用して、尾の付け根まで約3〜5センチメートルの横方向の皮膚切開を行い、下にある筋肉を傷つけずに行います。
切開部に止血器を挿入し、止血顎を開閉して皮下ポケットを作ります。目的の薬剤を充填した浸透圧ミニポンプをポケットに挿入し、6 o非吸収性縫合糸を使用して切開を閉じます。次に、マウスが胸骨の横臥位に達するまでモニタリングしながら回復させます。
細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の胚変異体であるエラスチンは、胚の15.5日以降に始まり、大動脈の内層に過剰な平滑筋細胞を蓄積します。このプロセス中のマルチカラーcreレポーターによる平滑筋細胞のクローン分析は、細胞が複数の色であり、したがってポリクローナルであることを示しています。外植大動脈切片の免疫染色により、エラスチン変異体胚の15.5日目の大動脈は、培養後18時間以内に筋肉亢進と狭窄性になり、抗アンテグリンβ3ブロッキング抗体の添加によりそのプロセスが弱まることが明らかになりました。
出生後0.5日目の野生型マウスの大動脈から単離された平滑筋細胞は、平滑筋細胞マーカーを発現しますが、CD31は発現しません。インテグリンベータ3阻害剤を胚13.5日目から妊娠中の湿地に連続注入すると、細胞外マトリックスタンパク質であるエラスチンの変異体マウスの大動脈弁狭窄と筋肉増強が大幅に軽減されます。ただし、野生型マウスの大動脈を変更しないでください。
浸透圧ミニポンプの配置技術は、一度習得すれば、適切に行えば10分以内に完了することができます。これらの手順に続いて、これらのアプローチは、平滑筋コード化された非血管性、胃腸管の組織や肺領域を研究するためにも外挿できます。このビデオを見れば、in-vivo embryonic fitマッピングとクローン解析、培養外植胚性大動脈、周産期大動脈平滑筋細胞、および外植片皮下浸透膜ミニポンプの実施方法について十分に理解できるはずです。
マウス、タモキシフェン、固定減速機での作業は危険な場合があり、手袋や白衣を着用し、これらの手順を実行する際には特別な注意を払うなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
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概要
この記事では、in vivo クローン分析や運命マッピングなどのさまざまな技術を通じて、胚および周産期のマウス大動脈を研究するためのプロトコルについて詳しく説明しています。これらの方法は、正常な発達および疾患状態における大動脈の形態形成を理解するために不可欠です。
主要な研究構成要素
科学分野
- 血管発達
- 胚発生学
- 血管疾患の病因
背景
- 大動脈壁の形成を理解することは、血管の健康に関する洞察を得るために重要です。
- 研究は血管発達に寄与する細胞の発生源に焦点を当てています。
- 技術により滑 muscle の病因を評価することができます。
- 血管疾患の治療への応用が期待されます。
研究目的
- 胚および周産期の大動脈の形態形成を調査すること。
- 疾患時の大動脈発達の異常を特定すること。
- 血管内部における細胞の起源を探ること。
使用方法
- in vivo クローン分析
- 運命マッピング技術
- 大動脈エキスプラント
- 滑 muscle 細胞の分離
主要な結果
- 発達時の滑 muscle の形態形成に関する洞察。
- 大動脈形成における主要な細胞源の特定。
- 大動脈構造における疾患関連の変化の評価。
- 血管疾患の潜在的な治療への応用。
結論
- この研究は大動脈の発達に関する理解を深めます。
- 血管疾患の研究のための枠組みを提供します。
- これらの方法は治療戦略の進歩につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding the cellular origins and morphogenetic mechanisms of the embryonic and perinatal aorta provides critical insights for target validation in vascular development pathways. These approaches enable mechanistic de-risking by clarifying smooth muscle cell fate, clonality, and responses to pharmacological perturbations in disease-relevant developmental windows. The data generated supports predictive confidence in early discovery by linking genetic and molecular perturbations to structural aortic phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding smooth muscle cell origin and clonal architecture in the developing aorta.
- Scientific Value: Supports functional target validation by assessing the role of specific genes in muscularization, proliferation, and migration.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking through fate mapping and clonal analysis to clarify cellular contributions during normal and perturbed development.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Prepares validated aortic explants and isolated smooth muscle cells for downstream compound screening and target modulation studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible culture systems for quantitative assessment of smooth muscle phenotypes.
- Operational Value: Supports assay readiness for evaluating pharmacological agents on morphogenic processes in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Bridges discovery findings to in vivo validation through pharmacological and genetic approaches in perinatal disease models.
- Translational Value: Provides disease-relevant systems (e.g., elastin mutant aortas) to study hyper muscularization and stenosis mechanisms.
- Translational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by linking in vitro observations to in vivo phenotypic outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through phenotypic screening to preclinical validation, supporting iterative de-risking of vascular targets.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cellular origins and pathway clarification in aortic morphogenesis.
- Screening: Describes assay readiness via explant culture and isolated SMCs for compound evaluation and phenotypic readouts.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as clonal color distribution, muscularization indices, and migration metrics for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through in vivo pharmacological modulation in perinatal disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying smooth muscle-dependent processes across vascular and non-vascular tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through mechanistic insight into smooth muscle pathogenesis and morphogenesis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility of aortic explant and SMC isolation protocols across laboratories.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early vascular target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of vascular targets based on developmental phenotype relevance and disease model concordance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryology, microsurgery, and fluorescent clonal analysis techniques.
- Dependent on instrumentation including cryostats, fluorescent microscopes, and osmotic pump delivery systems.
- Necessitates cross-team standardization for embryo staging, tissue fixation, and imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when applying protocols to non-aortic smooth muscle tissues such as gut or lung.
- Practical limitations include embryo availability, gestational timing precision, and technical complexity of perinatal cell isolation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:07
In Vivo Embryonic Fate Mapping and Clonal Analysis
4:14
Explant Embryonic Aorta Culture
5:47
Smooth Muscle Cell (SMC) Perinatal Aorta Isolation
7:16
Subcutaneous Osmotic Mini-Pump Placement
8:23
Results: Representative Embryonic and Neonatal SMC Analyses
9:47
Conclusion
