セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

この新しいDNAベースのモデルシステムの全体的な目標は、セミフレキシブルポリマーのクラスの基本特性を理解することであり、これは生体高分子の重要なクラスの挙動も記述します。この新しい方法により、ソフトメタフィジックスの分野における重要な問題を研究することができ、具体的には、セミフレキシブルフィラメントの振る舞いとそのネットワークへの配置を探求することができます。この技術の主な利点は、イントラビシブフィラメントの機械的特性が実験的にアクセスでき、正確に調整できることです。

セミフレキシブルポリマーは、フィラメントの特殊な特性によって定義されますが、以前は調整可能な実験システムがないため、理論的な枠組みでしか扱われていませんでした。この方法は、セミフレキシブルポリマーの定義量についての洞察を提供しますが、新しいハイドロゲルとして適用して、アンダーレイングメッシュサイズを変更することなく、異なる剛性のマトリックスでの細胞移動を研究することもできます。ナノチューブ内の最小の反復単位は、単位リングと考えることができます。

これらのユニットリングのいくつかは、ハイブリダイゼーション中にスタックします。これにより、細長いナノチューブが形成されます。まず、凍結乾燥オリゴヌクレオチドを精製水に再懸濁し、同社の対応するマニュアルに記載されているさらなる再懸濁手順に従います。

水の量を調整して、最終濃度を200マイクロモルにします。正確な化学量論が組み立てプロセスにとって重要であるため、ディストリビューターから与えられた値を確認するために、単一のDNA鎖の濃度を決定します。マイクロピペットを使用して、サーモサイクラーに適した容器でそれぞれ同じ濃度のDNA鎖を混合し、目的のDNAチューブとヘリックスチューブを形成します。

サーモサイクラーでDNAチューブとヘリックスチューブをハイブリダイズし、テキストプロトコールに記載されているパラメータを使用します。ハイブリダイズDNAとヘリックスチューブは、摂氏4度で最大3週間保存し、分解を検出できません。レオロジーを行う前に、必要に応じてサンプルバッファーを使用して、サンプルを目的の最終濃度まで慎重に希釈します。

動的せん断レオメータに適した形状を選択します。次に、サンプルをレオメータにロードします。潜在的な蒸発効果を防ぐために、3つの手法のうちの1つを使用して、サンプルと環境の空気水界面を不動態化します。

どちらかを2.5ミリリットルのサンプルバッファーバスでサンプルを囲みます。または、サンプルのミセル濃度のすぐ下に界面活性剤を追加します。あるいは、ハミルトンシリンジを使用してサンプルを脂質で囲み、サンプルが空気と直接接触しないようにします。

サンプルチャンバーは、濡れたスポンジを装備したキャップを使用して密封します。また、可能であれば、追加のウォーターバスを使用して蒸発をさらに抑制します。レオメータ専用のソフトウェアを使用して室温で測定を開始し、サンプルを室温で2時間平衡化します。

平衡化時間は、サーモフレクトシステムを完全な等方性ランダム化状態にするために重要です。これは、異なる測定値間の比較を可能にする唯一の確認であるためです。測定後、テキストプロトコルで説明されているようにデータを処理します。1本あたり1〜4マイクロモルのDNA、12.5ミリモルの塩化マグネシウム、および1x核酸ゲル染色剤を使用して、各サンプルに12マイクロリットルの8アリコートを調製します。

また、DNAを含まないネガティブコントロールを作成しますが、核酸ゲル染色を含めます。アリコートをリアルタイムPCRプレートに移し、接着フィルムでシールします。プレートをGの100倍で室温で1分間遠心分離し、気泡を除去します。

気泡は測定中に膨張する可能性があり、サンプルを分析できないため、気泡を取り除くことが重要です。遠心分離後、密封されたプレートをリアルタイム定量PCRシステムにロードします。DNAを90°Cで10分間変性させ、温度を72°Cまで急速に下げるアニーリングプログラムをプログラムします。

その後、温度は30分ごとに摂氏0.5度ゆっくりと低下するはずです。信号が減衰したら、温度上昇を加速します。サイクラーの蓋が少なくとも摂氏100度に加熱され、蒸発したサンプルが接着フィルムに結露するのを防ぐことを確認してください。

組み立て中に、488ナノメートルのアルゴンイオンレーザーでサンプルを励起し、CY3色素を使用する場合は550ナノメートルの蛍光を検出します。その他の色素については、適切な励起発光の組み合わせを選択してください。内蔵カメラを使用して、蛍光信号をできるだけ頻繁に測定し、全体的な信号品質を向上させます。

レオロジー測定の代表的な生データが示され、ネットワークの弾力性が明らかになります。ここに示されているのは、平衡化時間中の時間スイープです。このプロットは、ネットワークのひずみ依存性の動作を示しています。

このプロットでは、ネットワークの周波数依存的な動作が明らかです。この時点で、特定の周波数の値が選択されます。特定のDNAヘリックスチューブ集団の値を濃度に対してプロットしました。

このプロセスは、すべてのDNAチューブとヘリックスチューブに対して繰り返されました。次に、傾きを対数ログプロットで抽出し、べき乗則指数を生成しました。最後に、測定された各濃度の持続長に対して値を再プロットしました。

これらのグラフにより、濃度と持続長に対する弾性プラトー率のスケーリングを抽出できます。開発後、この技術は、ソフトマターおよびポリマー物理学の分野の研究者が、クラスのセミフレキシブルポリマーのフィラメント剛性の影響を調査する道を開きました。この手順に従うと、絡み合ったネットワークの朗読、一般的な交差ネットワーク、構造形成プロセスなどの追加の効果に対処することができます。

このビデオを見れば、DNAナノチューブをハイブリダイズする方法や、そのネットワークのレオロジー特性を測定する方法についてよく理解できるはずです。