結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

このバイオパニング手順の全体的な目標は、ペプチド捕捉剤を目的の特定のタンパク質ターゲットに迅速に単離し、非特異的な候補をさらなるダウンストリーム分析から迅速かつ効果的に排除することです。この方法は、生物学的脅威の検出から疾患の診断まで、さまざまなアプリケーションに対応する堅牢なペプチドアフィニティー試薬の発見に使用できます。この技術の主な利点は、ペプチドアフィニティー試薬を、大量のトレーニングなしで約1週間で迅速に単離できることです。

この方法は、オフセル用のペプチドアフィニティー試薬の探索にも使用できますが、ペプチドは生体材料としても使用できます。一般に、この方法を初めて使用する個人にとって最も難しい側面は、候補の下流の配列解析であり、これはここに示す実験プロトコルと大きく相互作用します。バイオパンニング細菌ディスプレイライブラリは、磁気ビーズ自体に対するネガティブソーティングから始まり、ビーズ材料に付着した非特異的結合剤や付着した捕捉タンパク質を除去する循環的なプロセスです。

磁気ビーズに結合しない負の画分は保持する必要があります。任意の潜在的な交差反応性タンパク質標的に対して追加のネガティブソーティングを行うことができ、磁気ビーズに結合しないネガティブ画分は再び保持されます。その後のポジティブソーティングステップは、タンパク質ターゲットに対するネガティブソーティングと非常によく似ていますが、今回は磁気ビーズ結合したポジティブ画分が保持されます。

細菌ディスプレイライブラリーのポジティブソーティングのために、まず、クロラムフェニコールを添加したLuria Broth MillerまたはLBCM-25を500ミリリットルに、ネガティブソーティングにより望ましくないペプチドが事前に枯渇した多様な細菌ディスプレイソーティングライブラリーの約10〜11番目の細胞に接種します。ライブラリを摂氏37度、225 RPMでインキュベートし、培養物がOD 600が0.5〜0.55に達するまでインキュベートします。次に、0.04%L-アラビノースで37°Cで45分間、振とうしながらペプチド発現を誘導します。

導入期間の終わりに、培養物を氷の上に置きます。そして、遠心分離により10〜11番目の細菌細胞を2倍に収集します。ペレットを1.5ミリリットルのPBSに再懸濁し、穏やかに渦巻きます。

そして、必要に応じて細菌を複数のマイクロ遠心チューブに分割し、2回目の遠心分離を行います。目的のビオチン化ターゲットを添加したPBS1ミリリットルにペレットを再懸濁し、回転プラットフォーム上で摂氏4度で45分間インキュベーションします。その間に、100マイクロリットルのストレプトアビジンコードビーズを、ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したPBS1ミリメートルで遠心分離して洗浄します。

洗浄したビーズをベンチトップ磁性粒子セパレーターに置き、ペレットを乱さないように注意しながら、スーパーネイトを慎重に取り外します。回転インキュベーションの終了時に、細胞を遠心分離してスーパーナノの未結合ターゲットを回収し、標的タンパク質結合細菌細胞ペレットを1ミリリットルのPBSとBSAに再懸濁します。細菌細胞の全量を使用して、ビーズペレットを再懸濁します。

回転プラットホーム上で摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、ビーズとバクテリア溶液を氷の上に置きます。Auto Max装置の電源を入れてシステムを初期化し、分離メニューで[今すぐ洗浄]、[すすぎ]、および[実行]を選択して、メーカーの洗浄バッファーと実行バッファーでラインをそれぞれプライミングします。

洗浄の最後に、PBSとBSAバッファーを使用して、ラインをもう一度プライミングします。機器の準備ができたら、バクテリアとビーズの混合物を15ミリリットルの円錐形チューブに移し、さらに500マイクロリットルの新鮮なPBSとBSAでチューブをすすぎます。バクテリアとビーズの混合物で洗浄液を引き抜き、チューブを摂氏4度の円錐形チューブラックのサンプルスロットに入れます。

空の15ミリリットルの収集チューブをラックの正と負の選択スロットに入れ、ラックを機器プラットフォームに移します。ラック上の各サンプルに分離プログラムを割り当て、各サンプルの間と最後のサンプルの後にすすぎステップを追加します。[実行] を選択してセル分離を開始し、OKまたは続行して、十分なバッファーが使用可能であることを確認します。

プログラムが完了したら、ラックを取り外し、バクテリアとビーズの両方を含む正の画分を氷の上に置きます。先ほどのデモのようにラインをプライミングした後、メーカーのランバッファーとウォッシュバッファーを使用して、電源を選択し、はいを選択して装置をシャットダウンし、除染のために保存溶液ボトルに70%のエタノールがあることを確認します。システムのシャットダウンが完了すると、ボトルは紫色になります。

機械の電源を切ることができます。次に、ポジティブソート画分全体を使用して、Dグルコースを添加したLBCM25の1リットルを接種し、摂氏37度で振とうしながら一晩培養します。各ソーティングラウンド後のアフィニティー試薬の単離成功を分析するには、ソート後のペプチド誘導の最後に、表に示すように、25マイクロリットルの溶液に5マイクロリットルの誘導細胞を添加します。

氷上で45分間インキュベートした後、遠心分離により各溶液中の細菌を回収し、各サンプルからスーパーネイトを吸引します。サンプルチューブを氷上に置き、FAX装置ソフトウェアで管理者を選択し、適切な分析フォルダを開きます。[新しいテスト] をクリックします。

次に、右クリックして実験の名前を変更し、[グローバル ワークシート] をクリックします。グローバルワークシートスプレッドシートのドットプロットアイコンをクリックして、新しい散布図を作成します。次に、ドット プロット グラフ自体を選択し、インスペクター アイコンを選択します。

開いているウィンドウの X 軸と Y 軸の横にあるボックスをクリックして、軸を 2 指数関数的な表示に調整し、インスペクター ウィンドウを閉じます。実験をクリックして新しい標本を作成し、右クリックして実験に適した標本の名前に変更します。次に、プラス記号をクリックして試料を展開し、サンプルの名前を変更します。

ネガティブコントロールサンプルを分析するには、PBSのみのペレットを500マイクロリットルの氷冷FAXランニングバッファーに再懸濁し、ピペッティングによりよく混合します。サンプルをFAXチューブに移し、フリックして細胞を溶液中に保持し、サンプルを装置のサンプル注入チューブまたはSITにロードします。現在のサンプルチューブをダブルクリックし、取得したデータをクリックします。

次に、事前に準備した側方散乱領域と前方散乱領域のドットプロットにイベントを表示し、必要に応じてしきい値タブの下の光増倍管電圧しきい値を調整して、ネガティブコントロールセルが中心近くに来るようにします。サンプルが適切に読み取られている場合は、流量を調整して毎秒 200-2 、 000 イベントを表示し、レコードデータをクリックして最小 10 、 000 イベントをキャプチャします。すべてのイベントが取り込まれたら、サンプルチューブをSITから取り外します。

ポリゴン ゲート アイコンを選択し、散布図で細胞集団の大部分の周囲にゲートを描画します。ドット プロットを右クリックして [人口階層の表示] を選択し、人口階層の P1 をクリックして、P1 人口を表示する新しいドット プロットを作成します。各軸を右クリックすると、Y 軸が FITC 領域に、X 軸が前方散乱領域に変わり、軸が双指数表示に調整されます。

ポリゴンゲートを使用して、母集団の上辺と左辺の周囲にネガティブコントロールセルをできるだけ密接にゲートし、母集団階層でP2を選択し、右クリックして反転ゲートを選択します。人口の1%未満がゲートの外に落ちるべきです。P2 ゲートのあるドット プロットを右クリックして [母集団の表示] を選択し、表示する母集団 (P2 母集団ではなく P2) を選択します。

次に、P2 ゲートのあるドット プロットを右クリックして [統計ビューの作成] を選択し、統計ビュー ウィンドウを右クリックして [統計ビューの編集] を選択します。[母集団] タブで、必要に応じて母集団 (P1 親母集団を含む) を追加または削除します。P2 ではなく P2 がすでに表示されているはずです。

次に、[統計]タブで、FITC、エリア、中、およびその他の関心のある統計を追加し、[OK]をクリックしてウィンドウを閉じます。P2散布図を右クリックして[複製]を選択し、PEエリアとFSCエリアの同様のドットプロットグラフを作成します。Y 軸を調整し、PBS 単独のサンプルを使用して P3 母集団をゲートします。

次に、ゲートを反転させます。そして、適切な母集団を表示します。適切なゲートがすべて設定されたら、スプレッドシートを使用して、チューブあたり約 10, 000 のイベントを記録するすべてのサンプルを実行します。

この代表的な実験と同様に、Ypet Monaが固定ポジティブコントロールペプチドに結合すると、集団内の誘導ペプチドライブラリーの発現レベルをモニターするのに役立ちます。表面に表示されたペプチドを欠く細胞は、通常、ラウンド3およびラウンド4で観察されるように、ソーティングプロセス中に排除されます。目的の特定のターゲットに結合するペプチドのライブラリーの濃縮は、通常、3回のポジティブソーティングラウンドで達成されます。

第3ラウンドですでに存在していた最も親和性の高いペプチド配列は、第4ラウンドでさらに濃縮される可能性が高く、潜在的な候補の選別に役立つため、第4ラウンドのソーティングを継続することは有益です。特異性は、意図したターゲットへの結合と、ネガティブソーティングに使用されたような潜在的な交差反応性ターゲットへの結合を比較することによって評価されます。ソーティングラウンド4からの配列の解析では、通常、親和性および特異性解析の優れた出発点となる反復配列が明らかになります。

反復配列の配列アラインメント解析は、候補のダウン選択に役立つコンセンサス配列の存在を明らかにするために使用できます。その後、各反復配列の代表的なコロニーを、オンセルの親和性と特異性の事実によってさらに解析し、標的タンパク質および交差反応性タンパク質へのペプチド結合を評価することができます。一度習得すれば、初期の親和性および特異性分析による完全なバイオ実験は、適切に実施されれば2週間未満で実施できます。

完全な手順を実行する場合、結合親和性に関与するトランジットを完全に理解するために、結合評価と配列解析を数回交互に行う必要がある場合があることを覚えておくことが重要です。ペプチド分析の多くを自動化し、候補選択をさらに効率化するために開発した補足マクロファイルが含まれています。このビデオを見れば、細菌ディスプレイライブラリーからペプチド捕捉剤を迅速に単離する方法や、さらに下流の分析から非特異的な候補を排除する方法について十分に理解できるはずです。

この手順を踏んだ後、ALIZAなどの他の方法を実行して、細胞結合の親和性と特異性を確認することができます。