Name: 結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 49 s
Description: 学ぶ細菌表示ライブラリを用いた半自動バイオパニング法で、標的タンパク質に特異的なペプチド親和性試薬を迅速に単離し、非特異的結合を効果的に除去する手法です。約1週間で抗体に代わる高感度検出試薬を開発可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、米国陸軍研究所 (ARL) ポスドク ・ フェローシップ プログラムの博士ジャスティン ・ p. ヤンキーの選任による ARL と契約をオーク リッジ関連の大学によって管理サポートを認めたいと思います。残りの資金は、センサーと ARL で電子デバイス本部によって提供されました。著者も感謝したいドーリィ ティー ラボ UCSB で細菌表示ライブラリと YPet モナ試薬、ARL、博士ジョシュア Kogot 彼の初期の仕事のために YPet モナ試薬をクローンとサポートのブリン アダムス博士のクローン作成のための情報を共有するため、細菌のバイオパニングの訓練表示ライブラリ、エッジウッド化学とプラスミドのエクスプレスし、abrax を浄化するために使用を共有するための生物センターのアリーナで穏やかなおよび rivax タンパク質ブランディ ドーシー PA 結合ペプチド、秦 Guo の隔離のためのテクニカル サポートabrax 結合ペプチドの単離の実験、この原稿についての議論が参考のため博士ジェシカ テレルのテクニカル サポート。

著者がある何も開示するには

バイオパニング細菌の表示ライブラリは親和性試薬の分離に成功したアプローチをされており、ペプチド抗体認識のために有用な代替を提供は、特定の条件が必要な場合、極端な環境での安定性など。これらのライブラリのバイオパニングは、ここで説明されている autoMCS メソッドを使用して簡素化されていて、市販 autoMCS プラットフォームより多くの人にこのテクノロジを拡張します。伝統的な交互 MCS/FACS と比較して細菌の並べ替え方法表示ライブラリ、autoMCS メソッドは、並べ替えとの連結の細胞を分離することができるより高価な FACS 装置への投資が不要で安価ここで使用される流れの cytometer の型ではなくであるのみ分析14のことができます。AutoMCS によって成功したバイオパニングのための重要なステップがあります分離プログラム選択、FACS を使用して、バイオパニングを停止するタイミングを決定するライブラリ濃縮を監視、偽陽性を減らすために潜在的な交差反応に対して並べ替え負と候補者の何百もの面倒なスクリーニングを避けるために候補者プールのスマートな分析。
記載例のプールごとにペプチド配列の違いにより若干異なる分析戦略とが PA と abrax、2 つの独立したターゲットのための選ばれた細菌表示ライブラリの成功バイオパニングを示すバイオパニングの 4 つのラウンド後の候補者。PA の 144 植民地で少なくとも一度繰り返されるペプチド配列から明確な傾向を示すシーケンス分析より簡単なケースだった。今回は単独でコンセンサスを含まれている PA ターゲットのコンセンサス シーケンスを判別するのに十分なそれらのコロニーまたは同様のシーケンス ストレプトアビジン ネガティブ コントロールへのバインドと PA へのバインドの比率の面で最適な候補。しかし、この常になる場合。Abrax ターゲット 5 繰り返しシーケンスにシーケンス 100 コロニーを導いたが、これらのシーケンスで傾向があまりすっきりした芳香族アミノ酸残基とアスパラギン酸やアスパラギンが含まれてする傾向以外。シーケンスされたコロニーのリストに戻って、観察親シーケンスにその正確な一致シーケンスが含まれていませんので、繰り返しシーケンスから予測「コンセンサス」のみが生産・ abrax への親和性のためにテストその他候補者であり、互いに共通のより多くの傾向があった。実際には、2 つのコロニーには、繰り返しだけで、(FWAWF ではなく FWDTWF)、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン残基が異なる間隔で同様の傾向があったから「コンセンサス」同様シーケンスが含まれています。これらのペプチドの 1 つは、繰り返しシーケンス、1 つではなかった。似たような変種を含む 3 番目のシーケンスと共に、これらの 2 つのシーケンス abrax の親和性の観点でテスト トップ 5 のバインダーの中にあった。全体のトップ バインダー AX-A05 によっても同様の傾向が表示されます。Abrax の結果は、シーケンス分析との親和性と特異性の解析間に数回のアプローチを交互に選ばれたターゲットに応じて、必要あることを示します。Abrax ターゲットの結果も非常によく似た蛋白質 (rivax 1,15) に達成することができる特異性のレベルを示します。
私たちの研究に選ばれる autoMCS プログラムされた初期の人口の 5% 未満の低周波を用いたラベル付き標的細胞の正の選択の両方は、Posselds と Posseld。どちらの場合も、セルは 2 つの磁気列を通過します。Posselds プログラムの場合ただし、セル通過よりゆっくりと露出時間41を増加する最初の列。商業 autoMCS デバイスの製造元によって与えられたプログラム説明に加えて (を材料表参照) 41、これらのプログラムは、いくつかの潜在的なプログラムの最初の比較の後選ばれました。陰性対照セルの均質な文化からの偽陽性を抜くようにと正常に興味のターゲットに陰性対照細胞減少とスパイクを含む混合文化から知られているバインダーを分離する各プログラムの能力知られているバインダーの割合を比較しました。ここで説明したアプリケーションから著しく逸脱、同様の比較は新しいアプリケーションのプログラムの選択に役立つと。ただし、以前類似のペプチドの分離に導いたバイオパニングのすべての 4 つのラウンドのためにこれらのプログラムのいずれかを使用することを示した PA のペプチド親和性試薬の隔離のためこれら 2 つのプログラム (Posseld と Posselds) の比較結果を公開アフィニティと PA の特異性と WXCFTC コンセンサスの決意。高速流動度より迅速にソートのその Posseld でされ、バインディング ターゲットへの親和性が高かったしたがってバイオパニングの唯一の 2 つのラウンドの後バイオパニングの 4 つのラウンドの後のより多くのユニークなシーケンスにつながった Posselds を使用している間の主な違い14. これから学習、戦略を若干変更したとき両方の利点を組み込む abrax 結合ペプチドのバイオパニング: Posselds は、ラウンド 1 の多様性が、その後最高、この重要なステップの間に露出時間が使用された、プログラムはラウンド 2-4 1,15中最高の親和性バインダーの高速分離のため Posseld しました。特に以来、nMFI とパーセントのバインドされたともに abrax 並べ替え並べ替えいずれかのプログラムでラウンド 4 PA と比べてラウンド 4、abrax に最適なように (図 2 、図 3と Sarkesら201514) が同じターゲットに対して他の対 1 つの戦略を使用して直接比較がより決定的な比較に必要となります。個々 のターゲット、使用されている並べ替えライブラリとは、ここで説明した条件の変更で実現ペプチド発現のレベルに依存可能性がありますプログラムが特定のアプリケーションに最適です。
説明しませんここでは非生物的材料とバイオパニングからの潜在的な結果が、一括アルミ2に対してバイオパニングの同じ細菌表示ライブラリを用いても。本研究では、autoMCS を使用しては実行されませんでしたが、同様の研究は、材料は、可能性があります上にコーティングまたは、磁気ビードに共役 autoMCS を使用して行うことができます。一括アルミニウム研究では個々 のアミノ酸分析と二次構造モデリングだった分離ペプチドの結合親和性を運転していたもの、コンセンサス配列決定2はなかったので理解する上で役に立つ。生物学的目標ともこれは何が運転して"eCPX_Sequencing"マクロから生成されたスプレッドシートに個々 の残留周波数分析のタブが含まれています理由はいくつかのターゲットのための結合親和性を理解する必要があります。しかし、合意の欠如に加えて、繰り返しシーケンスは表示されない残留周波数パターンを示さない場合、他の種類の分析は要求されるかもしれない。また、さらなる並べ替えラウンド ダウン選択目的のターゲットに十分な親和性とのそれらのための候補者のはるかに大きい数をスクリーニングを避けるために必要かもしれません。
次世代シークエンシングの増加する供給、アフィニティのテスト前に最も有望な候補者を確認してバイオパニングの各ラウンド後の濃縮の程度を調べるためより徹底的な調査を実行でした。しかし、彼らは簡単にルーチン コロニー ゲノ ム配列数十または何百ものコロニーの分離に十分に高い周波数ではない場合シーケンス結合分析手順に進むは複製、再作成する必要があります。この技術の進歩より安価なより日常的になるとコロニーの分離のために、特にそれが可能性が高いバイオパニング データを分析する最もよい方法であります。それは個々 のシーケンス、およびライブラリ全体の解明につながる可能性があります、進化。高速の成長率やノザン ゲノム蛋白質の表示の足場およびペプチドの式がなくても素材をバインドできない細菌のセルに向かって並べ替えバイアスが時間をかけて並べ替えライブラリで細菌が変異はさらに、インスタンス。そのため、一度有望な候補が出てくるだプラスミド DNA を分離する、新鮮なエシェリヒア属大腸菌を retransforming、FACS によるペプチド結合を確認する価値があります。セルなしの形式で、ペプチドを使用する場合、アフィニティは、無料ペプチドも評価されなければなりません。たとえば、ターゲット SEB の細菌のディスプレイを介して発見されたペプチド親和性試薬総合的作り出されたセルをオフと immunosorbant の酵素抗体法 (ELISA) と (FACS) 経由でセルとセル オフなどのより伝統的な方法によって分析(ELISA) 経由で、親和性は Kds 7は両方の方法で決定を用いて比較した.
ストレプトアビジン-ビオチンの相互作用の強さはターゲット蛋白質とペプチド結合の捕獲のための理想的な戦略になって、この手順は他のキャプチャの方法で変更できます。エポキシやカルボン酸ビーズなどの磁性ビーズにタンパク質の直接結合は成功しているし、バインド ステップを削除します。ただし、直接添付ファイルは添付ファイル戦略によって、特定または不特定の方法で潜在的な結合部位を妨げます。ストレプトアビジン ビーズを使用する付加的な利点は安定したタンパク質少ない目標たて 30 分でビオチン化をすることができますまたは保存凍結、彼ら自身ビーズ架橋用蛋白質と長い潜伏を要求する傾向がある一方、必要な場合一般的に 2-8 ° C で保存ビオチン化タンパク質の提案された開始濃度目標ここでは、600 nM は複数のターゲットに成功しているが、この濃度は減る場合と高親和性ペプチド キャプチャ試薬を分離することが可能かもしれません。さらに、このメソッドを拡張するおよび他細菌表示ライブラリおよび他の有機体の変更できます。たとえば、用嫌気性菌、酸素がない場合または一意のプロパティを持つペプチドを分離する極限環境で使用するための他の環境では、これらの手順を実行することができます。ペプチドおよび/または興味の特定のターゲットは潜在的にすることができますを決定するコンセンサスは、生体材料、又は総合的作り出されたセルをセル上を使用しました。さらに高い親和性とより堅牢なタンパク質触媒をキャプチャ (PCC) エージェント用センサー、または抗体は、バインディングに使用される、通常他のアプリケーションの開発で総合的作り出されたペプチドがさらに熟成させますか認識38,55。図 5 1に掲げる abrax 結合ペプチドとコンセンサスの最近行われたように、ペプチドは、ターゲットの場所をバインディングを決定するために、分子モデリングを使用もできます。全体的に、ペプチドのアフィニ ティーの試薬のためのバイオパニング細菌表示ライブラリは認識のための抗体の生産と蛋白質ターゲットの検出とこの半自動バイオパニングに高速、簡単、かつ強力な代替アプローチ広範囲にわたるアプリケーションに信頼性の高い結果を生産しています。

バイオパニング親和性試薬発見のため実績のある手法、細菌を表示ライブラリ ペプチド親和性試薬1,2,3,4,の5、便利なソース 6,7,8,9,10、11,12,13,14、 15,16,17,18,19,20,21,22,23、 24。同様にバクテリオファージ表示25,26酵母表示27,28ペプチドは細胞表面にさらされている、これらの相互作用がある、生物的・非生物的ターゲットをバインドできます。ペプチッド バックボーンとアミノ酸側鎖29のユニークな特性によって駆動。バクテリオファージの表示と対照をなして、菌自体は自己複製、バインドされたバクテリオファージの溶出と細胞の再感染なし表示に必要なすべての遺伝物質を含んでいます。酵母ディスプレイと対照をなして細菌表示は快速 (約 20 分30)エシェリヒア属大腸菌のダブルタイムのため高速です。結果として得られるペプチド親和性試薬を作り出すことができる様々 なプラットフォーム16,17,26をセンシング用セルをオフ、生活材料表示セル2使用の可能性があります。,31,32. と比較して、特定のターゲットの認識のためのモノクローナル抗体、ペプチドは、はるかに小さくより柔軟なペプチドの表示ライブラリは特定のアミノ酸、システイン33 などを避けるために DNA レベルで簡単に操作できます。.ペプチドがますます治療34,35,36と他の抗体は、検出、再現性のある合成 (セルを容易にするため利用すると通常のアプリケーションの利用) 生産・冷凍37,38せず長期保存や高温にさらされた後でも機能性試薬を提供する他の極限環境でのパフォーマンスの優れたメンテナンス。試薬の保管のためのコールド チェーンを克服する機能は、極端な環境で動作する必要があります特定の関心は、国防省、例えばのです。熱安定性は、従ってこの原稿の例として与えられる選ばれたターゲットを認識し親和性試薬の望ましい機能だった。
最近では、バイオパニング細菌表示ライブラリも簡単で並べ替え (MAC または MCS) メソッド9,14,39半自動磁気活性化細胞を用いて信頼性の高いになりました。これらのメソッドは、磁気活性化細胞 (autoMACS または autoMCS) の楽器を並べ替えを自動市販などのさまざまな利点を持つプラットフォームを並べ替えいくつかの類似を使用して生物学的ターゲットの実証されている (表を参照してください。材料) 1,14,15と使い捨てカートリッジ7,9またはチップ39、貴重な仕様でサンプルを囲むより専門的なデバイスを使用し生物やバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) またはより高い7毒素。これらの半自動化されたメソッドは、ペプチド材料磁気や磁気ビーズにし (嫌気性菌) などの異なる生物を使用するコーティングもする能力を持っている場合、非生物材料にバインドすることができるの並べ替えに拡張すること、並べ替え成長条件が変更されます。細菌表示ライブラリを並べ替えるだけでなくここで使用される商業 autoMCS 楽器も使用されています一部それ以上の分離に続いて、酵母の表面に表示される人間の単鎖抗体フラグメントの発見の初期の手順について蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) 40を使用しています。並べ替えの時間と労力より堅牢かつ再現可能な除去磁気ビーズから非連結の細胞の洗浄手順、偽陽性の削減につながる、少数の必要な並べ替えラウンド中になり、半自動化する主な利点は減少します。複雑なダウン ストリーム分析9,14。商業 autoMCS 楽器の場合は、別のアプリケーションに最適、負事前並べ替え (枯渇) など純度の優先順位付け、最後のサンプル ボリュームを最小限に抑え、増加される複数のプリロード プログラムまたは希少な細胞41の隔離のための感度を減少しています。
この作品の焦点は、市販の autoMCS 装置を用いて細菌表示ライブラリ バイオパニングの方法論を実証して分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを詳しく説明するには他のアプリケーションへの拡張を容易にするため。ここで使用される表示ライブラリ (材料の表参照) 12,13を含む約 109- 1011ユニークな 15 mer ペプチド細菌外膜タンパク質 OmpX の修正版を介して表示で、できれば無料のペプチドは溶液中の代表が期待されている細胞表面で制約のない性質は合成的に生産。この蛋白質の足場には、C 末端 YPet Mona にバインディングによって式を監視するための肯定的な制御 P2X ペプチドさらに含まれています。ただし、適切な多様性と必要な特定のアプリケーションに必要なその他の特性購入または新規ライブラリでは、このバイオパニング手順をいくつかのマイナーな変更が必要になることがありますは同様に動作をする必要があります。このバイオパニング プロトコルの概略図を図 1に示します。さらに、プロトコルに合わせることができる他の自動磁気並べ替えプラットフォームおよびその他の並べ替えの戦略。正常に、実証されているために必要なより複雑な時間のかかるストリーム分析増加偽陽性14、とはいえベンチトップ磁石手動磁気並べ替えとそれにもかかわらずに代わりのオプションを提供します、autoMCS 手順なしの自動磁気細胞選別装置、使用できます。

<table><tbody><tr><td>autoMACS Pro セパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>磁気ビーズ用自動セルセパレーター</td></tr><tr><td>Luria Broth, Miller (LB)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-500</td><td>増殖培地</td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP904-100</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>寒天</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2641-500</td><td>増粘剤/ゲル化剤</td></tr><tr><td>eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library</td><td>Cytomx Therapeutics</td><td>N/A; http://cytomx.com/contact/</td> <td>オンセルペプチドディスプレイライブラリ.USCBの協力者によって提供されました。</td></tr><tr><td>L-アラビノース</td><td>Sigma</td><td>A3256-500G</td><td>糖、タンパク質発現の誘導用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH 7.4 (PBS)</td><td>Amresco</td><td>0780-10L</td><td>緩衝</td></tr><tr><td>液 EZ-Link スルホ-NHS-LC-ビオチン、無重量</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI21327</td><td>ビオチン分子を第一級アミンに添加</td></tr><tr><td>Pierce ビオチン定量キット</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI28005</td><td>ビオチン分子がタンパク質に共有結合することを確認します</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td>ビオチン結合タンパク質の捕捉のための磁気ビーズ</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td>タンパク質、非特異的結合のブロッキング剤として使用されます</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td>糖、成長および誘導性タンパク質発現の阻害</td></tr><tr><td>Ypet Mona</td><td>UCSBおよびARL</td><td>N/A</td><td>ECPX 3.0の発現をモニタリングするためのポジティブコントロール。著者と協力者によって制作されました。参考文献12および13を参照してください。</td></tr><tr><td>Dylight 488 NHS Ester</td><td>Thermo Scientific</td><td>46403</td><td>フルオロフォア</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン、R-フィコエリトリンコンジュゲート(SAPE)</td>へのタンパク質標的の結合用<td>Mos Scientific</td><td>S866</td><td>ストレプトアビジンへの非特異的結合をモニタリングするためのネガティブコントロール</td></tr><tr><td>FACSFlow</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>342003</td><td>FACS 装置</td></tr><tr><td>の autoMACS カラム</td><td>を実行するためのバッファーMiltenyi Biotech</td><td>130-021-101</td><td>MACS</td></tr><tr><td>分離用autoMACSランニングバッファー&ndash;MACS分離バッファー</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-091-221</td><td>autoMACS機器のメンテナンス用。ハザード:0.09%アジドが含まれています。</td></tr><tr><td>autoMACS Pro 洗浄液</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-092-987</td><td>autoMACS機器のメンテナンス用</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>VWR</td><td>E505-4L</td><td>autoMACS</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma</td><td>G6279-1L</td><td>細菌冷凍庫の在庫</td></tr><tr><td>チル 15 ラック</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-952</td><td>MACS 分離</td></tr><tr><td>用 BD FACSCanto II</td><td>Becton,Dickinson, and Company</td><td>744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview</td> ターゲットBDへの<td>ペプチド結合の評価</td></tr><tr><td>FACSDiva ソフトウェア</td><td>Becton, Dickinson, and Company</td><td>659523</td> ターゲット<td></td></tr><tr><td>Dynabeads MPC-S磁性粒子濃縮器</td>へのペプチド結合の評価 <td>Thermo Scientific</td><td>A13346</td><td>磁気ビーズで使用するベンチトップセルセパレーター</td></tr><tr><td>コロニーシーケンシング</td><td>Genewiz</td><td>N/A; https://www.genewiz.com/</td> <td>DNA and Colony Sequencing Services</td></tr><tr><td>Excel Microsoft</td><td></td><td>323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400</td><td>シークエンス解析マクロ</td></tr><tr><td>炭疽菌保護抗原(PA)</td><td>リスト Biological Laboratories, Inc.</td><td>171</td><td>代表的な結果を得るために例として使用される標的タンパク質。</td></tr><tr><td>Abrax</td><td>ECBCおよびARL</td><td>N/A</td><td>は、代表的な結果を得るために例として標的タンパク質を使用しています。著者と協力者によって制作されました。参考文献1および15を参照してください。</td></tr><tr><td>Rivax</td><td>ECBCおよびARL</td><td>N/A</td><td>は、代表的な結果を得るために例として標的タンパク質を使用しています。著者と協力者によって制作されました。参考文献1および15を参照してください。</td></tr></tbody></table>

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

バイオパニング細菌表示ライブラリは、生物的・非生物的ターゲットの認識ペプチドの親和性試薬発見のため実績のある手法です。ペプチド親和性試薬は抗体検出と治療法などを含む、類似したアプリケーションの使用できますより堅牢なより多くの極端な環境で実行することができます。興味の蛋白質ターゲットにペプチド捕獲のエージェントの特定の濃縮は、結合を改良し、洗浄ステップ、したがって偽のポジティブなバインダーの発生を減少させる半自動の並べ替え方法を使用して強化されています。半自動並べ替えメソッドは、制約のない細菌ディスプレイ表現ランダム 15 mer ペプチド ライブラリの並べ替えと選別装置商業自動磁気活性化の細胞の使用のためにここに記載されているです。わずかな変更を加えると、これらのメソッドは他に拡張可能なデバイス、その他の並べ替えのライブラリ、および他の生物を自動化します。この作品の主な目的は、包括的な方法論を提供し、分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを解説です。これらの技術は、個々 の候補者の比較、並べ替え中に親和性と特異性を評価するために蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してセルにバインドの解析と傾向を特定するシーケンスのペプチドの解析とコンセンサス シーケンスの理解と潜在的興味のターゲット特異性と親和性を改善します。

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

このバイオパニング手順の全体的な目的は、特定の標的タンパク質に対するペプチド捕捉剤を迅速に単離し、非特異的な候補物質を後続の下流解析から迅速かつ効果的に排除することです。この手法は、生物学的脅威の検出から疾患の診断まで、さまざまな用途に向けた堅牢なペプチドアフィニティー試薬の探索に利用できます。この技術の主な利点は、高度なトレーニングを必要とせず、約1週間という短期間でペプチドアフィニティー試薬を迅速に単離できる点にあります。この手法は、細胞外で使用するためのペプチドアフィニティー試薬の探索に利用できますが、これらのペプチドをリビングマテリアルとして利用することも可能です。一般的に、この手法を初めて行う方にとって最も困難な点は、候補物質の下流の配列解析であり、これはここで示す実験プロトコルと密接に関連しています。細菌ディスプレイライブラリのバイオパニングは、磁気ビーズ自体の材料や、そこに結合したキャプチャータンパク質への非特異的結合物質を除去するためのネガティブソートから始まるサイクルプロセスです。磁気ビーズに結合しなかったネガティブ画分を回収します。交差反応の可能性がある他の標的タンパク質に対して追加のネガティブソートを行うことができ、その際も磁気ビーズに結合しなかったネガティブ画分を再度回収します。その後のポジティブソートの手順は、標的タンパク質に対するネガティブソートと非常に似ていますが、今回は磁気ビーズに結合したポジティブ画分を回収します。細菌ディスプレイライブラリーのポジティブソートを行うために、まず、クロラムフェニコールを添加した500 mLのLuria Broth Miller（LBCM-25）に、ネガティブソートによって不要なペプチドをあらかじめ除去した多様な細菌ディスプレイソートライブラリーを、約1 × 10¹¹ cells接種します。ライブラリーを37 °C、225 RPMで、OD 600が0.5から0.55に達するまで培養します。その後、0.04% L-アラビノースを用いて、37 °Cで振盪しながら45分間、ペプチドの発現を誘導します。誘導期間の終了後、培養物を氷上に置きます。そして、遠心分離により2×10¹¹個の細菌細胞を回収します。ペレットを1.5 mLのPBSに懸濁し、穏やかに混和します。必要に応じて、細菌を複数のマイクロ遠心チューブに分けて2回目の遠心分離を行います。ペレットを、目的のビオチン化標的を添加した1 mLのPBSに再懸濁し、回転台上にて4°Cで45分間インキュベートします。その間に、100 µLのストレプトアビジンコードビーズを、牛血清アルブミン（BSA）を添加した1 mLのPBSで遠心分離により洗浄します。洗浄したビーズをベンチトップ磁気粒子分離装置に設置し、ペレットを乱さないように注意しながら、上清を慎重に除きます。回転インキュベーションの終了後、細胞を遠心分離して上清中の未結合の標的物を回収し、標的タンパク質が結合した細菌細胞ペレットを1 mLのBSA添加PBSに再懸濁します。ビーズペレットを再懸濁させる際は、細菌細胞の全量を使用してください。回転プラットフォーム上で4 °Cで30分間インキュベートします。その後、ビーズと細菌の混合液を氷上に置きます。AutoMax装置の電源を入れ、システムを初期化した後、セパレーションメニューから「wash now」、「rinse」、「run」を選択し、それぞれメーカーの洗浄バッファーおよびランバッファーでラインをプライミングします。洗浄の最後に、PBSおよびBSA緩衝液を用いて再度ラインのプライミングを行います。装置の準備が整ったら、細菌とビーズの混合物を15 mLコニカルチューブに移し、さらに500 µLの新鮮なPBSおよびBSAでチューブ内をすすぎます。細菌とビーズの混合物を含む洗浄液を吸引し、チューブを4 °Cのコニカルチューブラックのサンプルスロットに設置します。空の15 milliliter回収チューブをラックのポジティブおよびネガティブ選択スロットに配置し、ラックを装置プラットフォームに移動させます。ラック上の各サンプルに分離プログラムを割り当て、各サンプルの間および最後のサンプルの後に洗浄ステップを追加します。[run]を選択して細胞分離を開始し、[okay]または[continue]を選択して、十分な量のバッファーがあることを確認します。プログラムが完了したら、ラックを取り出し、細菌とビーズの両方を含むポジティブ画分を氷上に置きます。先ほど実演したように、製造元のランバッファーおよび洗浄バッファーでラインをプライミングした後、「power」と「yes」を選択して装置をシャットダウンし、除染用の保存溶液ボトルに70%ethanolが入っていることを確認します。システムのシャットダウンが完了すると、ボトルが紫色になります。装置の電源を切ります。その後、ポジティブソート分画のすべてを用いて、D glucoseを添加した1 LのLBCM25に接種し、37 °Cで振盪しながら一晩培養します。各ソートラウンド後のアフィニティー試薬の単離成功度を分析するため、ソート後のペプチド誘導の終了時に、誘導細胞5 µLを表に示す25 µLの各溶液に添加します。氷上で45分間インキュベートした後、各溶液中の細菌を遠心分離により回収し、各サンプルから上清を吸引します。サンプルチューブを氷上に置いた状態で、FAX装置のソフトウェアで管理者を選択し、適切な解析フォルダを開きます。［新規実験］をクリックします。次に、右クリックして実験名を変更し、「global worksheets」をクリックします。グローバルワークシートのスプレッドシートにあるドットプロットアイコンをクリックして、新しい散布図を作成します。その後、ドットプロットグラフ自体を選択し、インスペクターアイコンを選択します。開いたウィンドウのX軸とY軸の隣にあるボックスをクリックして、軸を2指数関数表示に調整し、インスペクターウィンドウを閉じます。実験をクリックして新しい検体を作成し、右クリックして検体に適切な名称に変更します。次に、プラス記号をクリックして検体を展開し、サンプルの名称を変更します。陰性コントロールサンプルを実行するには、PBSのみのペレットを500 µLの氷冷FAXランニングバッファーに再懸濁し、ピペッティングにより十分に混合します。サンプルをFAXチューブに移し、軽く弾いて細胞を溶液中に保持させ、装置のサンプル注入チューブ（SIT）にロードします。現在のサンプルチューブをダブルクリックし、[acquired data]をクリックします。次に、あらかじめ作成しておいたサイドスキャッター（側方散乱光）領域対フォワードスキャッター（前方散乱光）領域のドットプロットにイベントを表示させ、「threshold」タブで光電子増倍管（PMT）の電圧しきい値を必要に応じて調整し、ネガティブコントロール細胞が中心付近に位置するようにします。サンプルが適切に読み込まれていることを確認し、流速を調整して1秒あたり200～2,000イベントが表示されるように設定した後、「record data」をクリックして最低10,000イベントをキャプチャします。すべてのイベントの取得が完了したら、SITからサンプルチューブを取り出します。ポリゴンゲートアイコンを選択し、スキャッタープロット内の細胞集団の大部分を囲むゲートを描きます。ドットプロットを右クリックして「個体群階層を表示（show population hierarchy）」を選択し、個体群階層のP1をクリックして、P1集団を表示するための新しいドットプロットを作成します。各軸を右クリックして、Y軸をFITC areaに、X軸をforward scatter areaに変更し、軸をバイエキスポネンシャル表示に調整します。ポリゴンゲートを用いて、ネガティブコントロール細胞の集団の上側と左側にできるだけ密着するようにゲートを設定し、ポピュレーション階層でP2を選択して、右クリックで「invert gate（ゲートを反転）」を選択します。集団の1%未満がゲート外に収まるようにしてください。P2ゲートが表示されているドットプロットを右クリックして「show populations（ポピュレーションを表示）」を選択し、P2およびnot P2のポピュレーションを選択して表示させます。次に、P2ゲートを含むドットプロットを右クリックして「create statistics view」を選択し、統計ビューウィンドウを右クリックして「edit statistics view」を選択します。「populations」タブで、P1親集団を含め、必要に応じて集団を追加または削除します。P2およびnot P2は、すでに表示されているはずです。次に、「statistics」タブで、「FITC area medium」およびその他の関心のある統計項目を追加し、「okay」をクリックしてウィンドウを閉じます。P2散布図を右クリックし、「duplicate」を選択して、PE area対FSC areaの同様のドットプロットグラフを作成します。Y軸を調整し、PBSのみのサンプルを使用してP3集団をゲートします。次に、ゲートを反転させ、適切な細胞集団を表示します。すべての適切なゲートが設定されたら、スプレッドシートを使用して、1チューブあたり約10,000イベントを記録しながらすべてのサンプルを解析します。この代表的な実験で示されているように、固定されたポジティブコントロールペプチドへのYpet Monaの結合を利用することで、細胞集団内における誘導ペプチドリブラリーの発現レベルをモニタリングできます。ラウンド3および4で観察されたように、表面提示ペプチドを欠く細胞は、一般的にソーティングプロセス中に除去されます。標的とする特定のタンパク質に結合するペプチドのリブラリー濃縮は、通常、3回のポジティブソーティングラウンドで達成されます。ソートを第4ラウンドまで継続することは有益であり、第3ラウンドですでに存在していた最高親和性のペプチド配列が第4ラウンドでさらに濃縮される可能性が高いため、潜在的な候補の絞り込みに役立ちます。特異性は、目的のターゲットへの結合を、ネガティブソートに使用したものなどの潜在的な交差反応ターゲットへの結合と比較することで評価します。第4ラウンドのソートから得られた配列を解析すると、通常、繰り返し配列が見つかります。これらは、親和性と特異性の解析における優れた出発点となります。反復配列の配列アライメント解析を用いることで、候補の絞り込みに役立つコンセンサス配列の存在を明らかにすることができます。その後、各反復配列から代表的なコロニーを選出し、オンセルアフィニティーおよび特異性の検証を行うことで、標的タンパク質および交差反応タンパク質へのペプチド結合能を評価します。一連の手順を習熟し、適切に実施すれば、初期のアフィニティーおよび特異性解析を含む完全なバイオ実験を2週間以内で完了させることが可能です。全手順を実施する際は、結合親和性に関わる遷移を完全に理解するために、結合評価と配列解析を数回交互に繰り返す必要がある場合があることに留意してください。ペプチド解析の多くを自動化し、候補物質の選択をさらに効率化するために、独自に開発した補完的なマクロファイルを同梱しています。このビデオを視聴することで、細菌ディスプレイライブラリーからペプチド捕捉剤を迅速に単離する方法、および非特異的な候補を以降の下流解析から排除する方法について、十分な理解が得られるはずです。本手順に従った後、ALIZAなどの他の手法を用いて、細胞外結合親和性と特異性を確認することができます。

semi-automated-biopanning-bacterial-display-libraries-for-peptide

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、T7ファージディスプレイペプチドライブラリーのQCMバイオセンサーベースのバイオパニングを使用して、タンパク質と薬物の相互作用を研究する方法を示しています。QCMバイオセンサー上に特定のペプチドを示すファージのバイオパニングにより、高親和性ペプチドの特異的な単離が可能になり、その後のアミノ酸シーケンシングにより、標的タンパク質上の特異的な相互作用部位の同定に役立ちます。...

タンパク質-薬物相互作用を研究するための水晶マイクロバランスバイオセンサーベースのバイオパニング

このビデオでは、ペプチドマイクロアレイ技術を適用して、ヒストンペプチド上の翻訳後修飾(PTM)を認識する抗体の特異性をプロファイリングする技術を示しています。既知のPTMの組み合わせを持つ固定化された蛍光色素標識ヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを、標的PTM特異的抗体で処理します。このプロセスは、標的に対する抗体の特異性と、非標的PTMとの潜在的な交差反応性を特定するのに役立ちます。...

抗体の特異性プロファイリングのためのペプチドマイクロアレイ技術

ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。...

組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。...

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

私たちは、細胞内タンパク質の折り畳みに固有の品質管理メカニズムを持つ大腸菌ツイン-アルギニン転座経路を使用して、抗体フラグメントの結合親和性と細胞質溶解性について抗体フラグメントのライブラリーを同時にスクリーニングする方法を提供します。...

抗体フラグメントのライブラリーをスクリーニングするための細菌インナー膜を表示

高スループットで新規受容体-リガンド相互作用の同定のため画面細胞外蛋白質のマイクロ アレイのプロトコルを紹介します。タンパク質マイクロ...

低親和性受容体-リガンド相互作用のハイスループット検出の細胞外タンパク質マイクロ アレイ技術

ここでは、特定の標的ペプチドをビオチン化する大腸菌ビオチンタンパク質リゲスBirAの新規変異体を選択する方法を提示する。プロトコルは、標的ペプチドの細菌表示のためのプラスミドの構築、BirAライブラリーの生成、BirA変異体の選択および特徴付けについて説明する。...

新規ビオチニル化酵素の選択のための細菌ペプチド表示

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde...

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

本研究は、薬物とペプチドの相互作用を同定するための戦略を提示することを目的とした。この戦略は、水晶結晶マイクロバランス(QCM)バイオセンサーに基づく薬物認識短いペプチドのバイオパンニングを含み、続いてタンパク質上の薬物認識および薬物結合部位の注釈のために得られた情報を定量的に評価するためのバイオインフォマティクス分析を行う。...

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

HCNチャネルとそれらの補助サブユニット間の相互作用は、大うつ病性障害における治療標的として同定されています。ここで、このタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための蛍光偏光ベースの方法が提供されます。...

HCN1とTRIP8bの間のタンパク質 - タンパク質相互作用の小分子阻害剤を同定するための方法

学ぶ細菌表示ライブラリを用いた半自動バイオパニング法で、標的タンパク質に特異的なペプチド親和性試薬を迅速に単離し、非特異的結合を効果的に除去する手法です。約1週間で抗体に代わる高感度検出試薬を開発可能です。

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

さらに動画を探す