シアノバクテリアにおけるグリコーゲン含有量の測定

ここでは、シアノバクテリア細胞のグリコーゲン含有量を測定するための信頼性の高い簡単なアッセイを提示します。この手順は、沈殿、選択可能な解重合、およびグルコース残渣の検出を必要とする。この方法は、野生型および遺伝子操作された株の両方に適しており、シアノバクテリアの代謝工学を促進することができる。

この手順の全体的な目標は、酵素ベースの選択的加水分解およびアッセイを使用してシアノバクテリアのグリコーゲン含有量を決定することです。この方法は、生理学、分子遺伝学、調査中のさまざまなシアノバクテリア株の生物工学など、シアノバクテリア分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、小規模に適応し、実行が容易で、グリコーゲンに対して感度が高く特異的であることです。

この方法はシアノバクテリアについての洞察を提供することができますが、大腸菌、酵母、微細藻類、さまざまな従属栄養微生物や光栄養微生物など、グリコーゲンやデンプンを蓄積する他の微生物にも適用できます。このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されているシアノバクテリア培養物の調製から開始します。1ミリリットルのシアノバクテリア培養物または細胞懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。

次に、6, 000倍のgと摂氏4度で10分間遠心分離します。ペレットを50ミリモルのTris-HCL pH 8の1ミリリットルに再懸濁する前に、上清を捨てます。.前と同じように再懸濁したペレットを遠心分離します。

上清を捨て、細胞ペレットをTris-HCLバッファーに再度懸濁します。前と同じようにチューブを遠心分離し、上清を捨てます。次に、ペレットを500マイクロリットルの50ミリモルTris-HCL緩衝液pH8に完全に再懸濁します。

効率的な溶解のためには、ペレットを十分に懸濁することが重要です。再懸濁液を氷に保管してください。再懸濁した細胞を4°Cで30サイクルの超音波処理により溶解し、各サイクルは最大振幅の20キロヘルツの周波数で30秒で構成され、続いて90秒溶解します。

ライセートを含むチューブを6, 000倍のgおよび摂氏4度で10分間遠心分離します。遠心分離後、ペレットは主に大きな細胞の破片であるべきであり、上清はさらなる分析に使用されます。この時点で、タンパク質アッセイキットを使用してタンパク質濃度を決定します。

1.5ミリリットルのスクリューキャップチューブに900マイクロリットルのエタノールと得られた上清100マイクロリットルを混合することにより、細胞溶解物からクロロフィルaを除去します。キャップを閉めた後、標準的な実験室の加熱ブロックを使用して、チューブを摂氏90度で10分間加熱します。次に、チューブを氷で30分間インキュベートします。

次に、チューブを20,000倍のgと摂氏4度で30分間遠心分離します。遠心分離後、上清を慎重に取り除きます。ペレットにはグリコーゲンが含まれています。

ペレットを空気中で軽く乾燥させて、余分なエタノールを取り除きます。ペレットの溶解が困難になるのを避けるために、ペレットを過度に乾燥させないでください。得られた上清の666ナノメートルで吸光度を測定し、クロロフィルa含有量を決定します。

この値は、グリコーゲン含有量を正規化するために使用できます。ペレットを50ミリモル酢酸ナトリウムpH5の100マイクロリットルに溶解します。これらの材料を渦を使ってよく混ぜます。

ピペッティングによる混合は、混合物が粘性であるため推奨されません。また、ミリリットルあたり8単位アミログルコシダーゼの50マイクロリットルとα-アミラーゼのミリリットルあたり2単位の50マイクロリットルを追加します。次に、混合物を摂氏60度で加熱ブロック内で2時間インキュベートし、グリコーゲンをグルコース分子に消化できるようにします。

インキュベーション後、サンプルを20, 000倍gで5分間遠心分離し、上清を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。酵素加水分解後の上清中のグルコース濃度を、GOD-POD試薬を用いて測定します。グリコーゲン沈殿ステップから100マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移します。

ネガティブコントロールとして、100マイクロリットルの50ミリモル酢酸ナトリウムpH5を使用します。検量線を作成するために、グルコース標準溶液も測定します。各サンプルに150マイクロリットルのGOD-POD試薬を加え、ピペッティングで迅速に混合します。

プレートを摂氏25度で30分間インキュベートします。次に、プレートリーダーを使用して、510ナノメートルの吸光度値を記録します。グルコース標準から得られた検量線を使用して、グルコース当量としてのグリコーゲンの量を計算します。

シネコシスティスのグリコーゲン含有量を以下に示します。グリコーゲンを過剰に蓄積することが知られている2つの変異株、delta pmg Aとdelta pmg Rを野生型株と比較しました。予想通り、変異株はグリコーゲンのレベルが上昇しました。

逆に、グリコーゲン合成酵素を欠く変異体はグリコーゲンを蓄積しませんでした。ここで使用されている菌株は、マンニトールを生成するように設計されています。特に、グリコーゲン合成酵素変異体は対照株よりも多くのマンニトールを産生し、光合成によって合成された炭水化物は、グリコーゲンを合成する能力を欠く変異株のマンニトールにリダイレクトされることを示唆しています。

このビデオを見れば、シアノバクテリアのグリコーゲン含有量を5時間で定量的に測定できるはずです。この手順を実行するときは、信頼性の高い結果を得るために、細胞を完全に再懸濁し、グリコーゲンペレットを可溶化することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、シアノバクテリアの炭水化物代謝がどのように調節されているかなどの追加の質問に答えるために、残りの細胞溶解物を使用して代謝酵素活性アッセイなどの他の方法を実行できます。