Name: サイズと架橋密度にナノスポンジ可変性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶナノスポンジ合成法で、ポリマー分子量と架橋剤量を調整し、ナノ粒子のサイズと架橋密度を精密に制御する技術。薬物送達システムの設計に応用可能です。

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LK は国立科学財団大学院研究フェローシップ ・ プログラム (DGE-1445197) とヴァンダービルト大学化学部門からの資金のために感謝しています。LK と EH オシリス TEM 装置 (NSF EPS 1004083) のための資金に感謝したいと思います。

1. AVLの合成と特性評価
<ol>
	<li>2ネック500mL丸底フラスコ(フラスコ1)の内側にマグネチックスターバーを置き、適切なサイズのゴム製セプタムと鋼線で密封します。フラスコを火炎乾燥させて、セプタム内の入口針と開放出口針に接続された窒素ガスでパージして水分を取り除き、ブタン火炎トーチを使用して、炎を表面に沿って動かしてフラスコの外側を穏やかに加熱します。
	<ol>
		<li>フラスコの内部を曇らせる湿気が見えなくなるまで、炎を表面に流してフラスコ全体を加熱し続けます。炎を取り除き、フラスコを室温まで冷まし、反応全体を通して窒素の流れを続けます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>156.25 mLの無水テトラヒドロフラン(THF)を30 mLのシリンジでフラスコ1に加えます。.フラスコをドライアイス/アセトン浴で1〜-78°Cに冷却します。反応全体を通して温度計で温度を監視し、必要に応じてドライアイスを加えて-78°Cを維持します。マグネティックスタープレートを使用してマグネティックスターバーを攪拌し始め、穏やかな渦を作り出します。</li>
	<li>N,N-ジイソプロピルエチルアミン (DIPA) (3.30 mL, 2.3 x 10-2 mol) を 5 mL シリンジで添加し、続いて 2.5 M n-ブチルリチウム (9.34 mL, 2.3 x 10-2 mol) を 10 mL ガラスシリンジで Flask 1 に滴下します。マグネティックスタープレートを用いて-78°Cで15分間撹拌を続けます。</li>
	<li>火炎乾燥(ステップ1.1で説明)し、アルゴンガス(ステップ1.1で窒素ガスで説明)で100mLの丸底フラスコ(フラスコ2)でパージします。フラスコが触れるほど冷えたら、アルゴンガスの入口と出口を同時に取り外します。30 mLシリンジで56 mLの無水THFを、5 mLシリンジでδ-バレロラクトン(VL)(1.97 mL、2.1 x 10-2 mol)を5 mLシリンジで加えます。</li>
	<li>Flask 2の溶液を小さなカニューレでFlask 1に45分かけて滴下し、マグネチックスターバーで連続的に攪拌しながら加えます。Flask 2が空になったら、カニューレを取り外し、Flask 1を-78°Cで15分間攪拌し続けます。</li>
	<li>火炎乾燥(ステップ1.1で説明)し、アルゴンガス(ステップ1.1で窒素ガスで説明)で25mLの丸底フラスコ(フラスコ3)でパージします。フラスコが触れるほど冷えたら、アルゴンガスの入口と出口を同時に取り外して、フラスコ内の陽圧を維持します。アリアン臭化物(2.02 mL、2.3 x 10-2 mol)とヘキサメチホスホラミド(HMPA)(4.43 mL、2.5 x 10-2 mol)をそれぞれ5 mLシリンジで追加します。</li>
	<li>Flask 3 を Flask 1 に小さなカニューレでドロップワイズで追加します。Flask 3が空になったら、カニューレを取り外します。
	<ol>
		<li>Flask 1を沈めたドライアイス/アセトン浴から、スコップとプラスチックカップを使用して、ドライアイスと冷たいアセトンをできるだけ取り除きます。室温のアセトンと交換して浴を-40°Cに上げ、Flask 1を温度を監視しながら2時間攪拌を続けるようにします。温度が-40°Cを超える場合は、ドライアイスを数個追加してアセトンを冷却します。</li>
		<li>冷たいアセトンとドライアイスを取り除いて-10°Cまで温め、室温のアセトンと交換します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>フラスコ1からセプタムを取り出し、150 mLの飽和塩化アンモニウム溶液で反応を急冷しながら、マグネチックスターバーで攪拌します。Flask 1を-20°Cの冷凍庫に一晩置いて保管します。</li>
	<li>フラスコ1を冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。Flask 1の溶液を500 mLのセパレーター漏斗に注ぎます。</li>
	<li>50 mLのジクロロメタン(DCM)を加え、セパリー漏斗にキャップをし、穏やかに揺らしてDCMと水性/ THF混合物を混合し、製品を有機層に抽出します。セパリーファンネルストップコックを開いて、適切なサイズの磁気攪拌棒を含む500mLビーカーに有機層を集め、取っておきます。これを 2 回繰り返します。</li>
	<li>すべての有機物を同じビーカーに集め、マグネティックスタープレートを使用して硫酸マグネシウムをかき混ぜます(残留水を取り除くため)マグネティックスタープレートを使用して、硫酸マグネシウムが溶液に加えたときに固まらなくなるまで。水性廃棄物を捨てます。</li>
	<li>ガラス漏斗内の濾紙を使用して有機製品溶液から硫酸マグネシウム固体を取り除き、有機物を250mLの丸底フラスコに集めます。濾紙と固体硫酸マグネシウムを過剰なDCMですすぎ、すべての製品が収集されるようにします。</li>
	<li>30°Cで加熱し、真空源として水吸引器を使用しながら回転蒸発させることにより、製品から溶媒を除去します。</li>
	<li>シリカゲルを固定相として使用し、カラムクロマトグラフィー10で粗生成物を精製し、3%酢酸エチル/ヘキサンから溶出して1カラム容量(CV)で溶出し、グラジエントを5CVsで29%酢酸エチル/ヘキサンに増やします。フラクションを16 x 150 mm2ホウケイ酸ガラス管に集めます。</li>
	<li>20% 酢酸エチル/ヘキサンを溶離液として使用して薄層クロマトグラフィーを実施し、生成物の画分を測定します。</li>
	<li>すべての製品画分を適切なサイズの丸底フラスコに結合し、40°Cのロータリー蒸発を使用して溶媒を除去し、事前に秤量した製品バイアルに移し、0.05 torrの高真空下に置いて純粋なAVLを取得します。1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5.75 (m, 1H), 5.06 (m, 2H), 4.26 (m, 2H), 2.54 (m, 3H), 2.28 (m, 1H), 2.03 (m, 1H), 1.87 (m, 1H), 1.54 (m, 1H).収量:2.07g(70.56%)。</li>
</ol>
2. VL- co- AVLの合成と評価
<ol>
	<li>火炎乾燥させ、マグネチックスターバーとセプタムを備えた25mLの丸底フラスコを窒素ガスでパージします。
	<ol>
		<li>フラスコを火炎乾燥させて、セプタム内の入口針と開放出口針に接続された窒素ガスでパージして水分を取り除き、ブタン火炎トーチを使用して、炎を表面に沿って動かしてフラスコの外側を穏やかに加熱します。</li>
		<li>フラスコの内部を曇らせる湿気が見えなくなるまで、炎を表面に流してフラスコ全体を加熱し続けます。炎を取り除き、フラスコを室温まで冷まし、反応全体を通して窒素の流れを続けます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丸い底から中隔をすばやく取り外し、スパチュラを使用してフラスコの一番底に錫(II)トリフラー(2.5 mg、5.9 x 10-6 mol)を追加します。セプタムを交換します。</li>
	<li>100 μLマイクロシリンジで3-メチル-1-ブタノール(72.6 μL、6.6 x 10-3 mol)を、2 mLシリンジで1.33 mLの無水DCMを順次添加します。マグネチックスタープレートで10分間攪拌します。</li>
	<li>AVL(0.48 mL、3.7 × 10-3 mol)とVL(1.37 mL、1.4 × 10-2 mol)をシリンジで順次添加します。18 - 20 h. の間攪拌を続けることを許しなさい。
	注:最終共重合体中のAVLおよびVLの割合は、このステップの化学量論によって変更できます。</li>
	<li>~5 mLのメタノール(MeOH)を加えて反応を急冷します。~100 mgの固体支持錫スカベンジャーを加え、2時間攪拌します。重力ろ過でろ過して固形物を取り除きます。</li>
	<li>水吸引器を真空源としてロータリーエポレーターで溶媒を除去し、溶液が粘性になるまで30°Cで加熱します。溶液を500 mLの冷たいMeOH(ドライアイスで少なくとも1時間冷却)に滴下して、白色固体のフレークを生成します。溶液を真空ろ過により、フィルターペーパー付きのフリットガラスディスクを含む漏斗にろ過し、固形物を収集します. 
	注:沈殿物が濾紙を通過する濁った上清または微粉末を生成する場合、製品溶液は希薄すぎます。すべての上清溶媒は、溶液が粘性になるまで30°Cで加熱しながら、真空源として水吸引器を使用した回転蒸発によって除去し、その後、再度沈殿を行う必要があります。</li>
	<li>固形製品をスパチュラで事前に計量したバイアルに移し、0.05 torrの高真空圧で一晩乾燥させて、白いフレーク状の固体を収集します。</li>
	<li>1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5.71 (m, 1H), 5.03 (t, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.65 (t, 2H), 2.15 - 2.50 (m, 5H), 1.47-1.78 (m, 9H), 0.91 (d, 6H). 81.42% VL, 18.58% AVL, 2,940 g/mol, 578 g/mol AVLの繰り返し単位。収量:1.43 g、(73.43%)。</li>
</ol>
3. エポキシバレロラクトン(EVL)共重合体ユニットを生成するための重合後エポキシ化
<ol>
	<li>VL-co-AVL共重合体(500 mg、1.7 x 10-4 mol、2,940 g/mol)をマグネチックスターバー付きの6ドラムバイアルに加えます。6.15 mLの無水DCMをバイアルとボルテックスに加えて、ポリマーを可溶化します。</li>
	<li>メタクロロペルオキシ安息香酸(mCPBA)(74.53 mg、4.3 x 10-4 mol)を2番目の6ドラムバイアルに加えます。.6.15 mLの無水DCMを加え、mCPBAが完全に可溶化されるまでボルテックスします 
	注:アリルとエポキシドの変換比は、このステップで化学量論を変更することで変化させることができます。溶媒中の最終的なアリル濃度は0.065 Mである必要があります。</li>
	<li>mCPBAソリューションをVL-AVLソリューションに転送します。反応液に蓋をし、プラスチックパラフィンフィルムで覆います。48時間攪拌します。</li>
	<li>反応混合物を50mLのセパレーター漏斗に移します。15 mLの飽和重炭酸ナトリウムを加え、分液漏斗に蓋をし、穏やかに揺らして混ぜます。製品を含む有機層を、適切なサイズのマグネチックスターバー(製品フラスコ)を備えた50 mLの三角フラスコに集めます。
	<ol>
		<li>セパリーファンネル、キャップにまだ残っている水性層に5mLのDCMを加え、穏やかに揺らします。有機物を製品フラスコに集めます。水性廃棄物を捨てます。有機層を分膜漏斗に戻します。この水性洗浄を2回繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>硫酸マグネシウム(残留水分を除去するため)を製品フラスコに加え、磁気攪拌板で攪拌しながら加えます。硫酸マグネシウムの小さなスクープを追加して、追加したときに固まらなくなるまで追加し続けます。濾紙を取り付けたガラス漏斗を使用して、固体の硫酸マグネシウムを取り除き、混合物を50mLの丸底フラスコに移します。</li>
	<li>水吸引器を真空源としてロータリー蒸発させ、25°Cで加熱して溶媒を除去し、丸底フラスコの内容物を事前に計量した製品バイアルに移し、ロータリー蒸発によって溶媒を除去します。0.05 torrの高真空に一晩置くと、白いワックス状の固体が生成されます。</li>
	<li>1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5.71 (m, 1H), 5.03 (t, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.65 (t, 2H), 2.94 (d, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.74 (s, 1H), 2.15-2.50 (m, 5H), 1.47-1.78 (m, 9H), 0.92 (d, 6H). 84.53% VL, 9.65% AVL, 5.82% EVL, 2,855 g/mol, 1,841 g/mol EVLの繰り返し単位。収量:417.3mg、(83.46%)。</li>
</ol>
4. ナノスポンジの合成と評価
<ol>
	<li>VL-co-AVL-co-EVLポリマー(200 mg、7.0 x 10-5 mol、2,855 g/mol)を20.01 mLの無水DCMに溶解し、エポキシド濃度0.0054 M..14/20 neck. の100 mL丸底フラスコに移します。
	注:反応を触媒するために、このステップで100μLの飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加できます。</li>
	<li>反応フラスコを50°Cの油浴に入れ、溶液を高速ボルテックスで攪拌し、マイクロシリンジで2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)(21.45 μL、2.9 10-4 mol)を滴下します。フラスコの首に冷水が流れるウォータージャケットコンデンサーを取り付け、14/20ネックアダプターを取り付け、溶液を12時間還流します。フラスコのネックとコンデンサーの間に非常にしっかりと密閉して、溶剤の蒸発を防ぎます。</li>
	<li>粘性のある溶液が得られるまで、25°Cで回転蒸発することにより、反応フラスコから余分な溶媒を取り除きます。</li>
	<li>大きなマグネチックスターバーを2Lビーカーに入れます。10 K分子量カットオフ(MWCO)透析チューブの約6インチの切片を切断し、一端を折りたたんでから透析クリップで閉じます。
	<ol>
		<li>製品を10 K MWCO透析チューブに移します。フラスコを余分なDCMですすぎ、チューブに移します。チューブの上部を折り、吊り下げ用のワイヤーが付いた透析クリップで閉じます。ワイヤーを使用してビーカーの側面に透析チューブを吊るし、透析チューブが完全に水没するまでビーカーにDCMを充填します。</li>
		<li>マグネティックスタープレートにのせ、優しく攪拌します。ビーカーをアルミホイルで覆い、溶剤の蒸発を防ぎます。廃棄物容器に注いで溶媒を除去し、新鮮なDCMと1日3回48時間交換して、未反応のポリマーと架橋剤を除去します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ビーカーからすべての溶媒を取り出し、透析チューブの内容物を0.45μmポリテトラフルオロエチレン(PTFE)シリンジフィルターを取り付けた10mLシリンジに移します。溶液をフィルターを通して、あらかじめ秤量した製品バイアルに直接押し込み、残っている不純物を取り除きます。25°Cでロータリーエポベーションして溶媒を除去し、0.05 torrの高真空に一晩置いて、淡黄色のワックス状の固体を収集します。</li>
	<li>1H NMR11 (CDCl3, 400 MHz): δ 5.71 (m, 1H), 5.03 (t, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.60-3.67 (t, 14H), 2.94 (d, 1H), 2.90 (s, 1H), 2.74 (s, 1H), 2.15-2.50 (m, 5H), 1.47-1.78 (m, 9H), 0.92 (d, 6H).収量:176.9mg(88.45%)。</li>
</ol>
5. ナノスポンジの形態とサイズのTEMイメージング
<ol>
	<li>0.2 μm PTFEシリンジフィルターで5 mLの細胞培養水をろ過します。</li>
	<li>0.5 mgのナノスポンジを1.5 mLの遠心チューブに入れます。ろ過した細胞培養水1 mLを加えます。プローブソニケーター(20 kHz、40 a)を使用して、粒子が微細な懸濁液を発達するまで、室温で2秒のバーストを4〜5回溶液に超音波処理します。長時間の超音波処理を使用したり、溶液を加熱したりしないでください。</li>
	<li>1.5 mLの遠心チューブでろ過した細胞培養水1 mLに、リンタングステン酸水和物(PTA)30 mgを加えます。最高設定で10秒間、またはPTAが完全に可溶化して3%PTA溶液を生成するまでボルテック</li>スします。
	<li>22 G針付きの1 mLシリンジを使用して、0.5 mL 3% PTA溶液を吸い上げます。3%PTA溶液を4滴粒子に加え、最高設定で10秒間ボルテックスします。自動閉鎖ピンセットを使用してTEMグリッドをピックアップし、それを粒子溶液にすばやく3回浸します。グリッドをカバーの下で5時間乾かして、グリッドの集塵を減らします。</li>
	<li>高コントラストと40μmの対物レンズを使用して、サンプルのTEMイメージング12を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>van der Ende, A. E., Sathiyakumar, V., Diaz, R., Hallahan, D. E., Harth, E. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2010/py/b9py00272c/unauth">Linear release nanoparticle devices for advanced targeted cancer therapies with increased efficacy.</a> Polym Chem. 1 (1), 93(2010).</li>
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</ol>

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再現可能なナノスポンジ サイズを取得は、薬物送達アプリケーションに不可欠です。重合とナノスポンジ合成における複数パラメーターは、結果として得られる粒子のサイズと架橋密度を影響します。3 つの重要なパラメーターは、我々 の分析で識別された: 架橋剤及びエポキシ樹脂ペンダント機能高分子の分子量。分子量とエポキシド ナノスポンジ合成機能の範囲を生成するために、VL-co -AVL 共重合体の化学量論を変更する必要があります。アリル機能グループの共重合体のエポキシ化反応中の濃度は、allyls のパーセンテージまたはそれらのすべてのいずれか epoxidize するために使用します。高分子鎖の分解が発生する酸化剤の過剰を使用する場合しかし、これは、酸化剤の量を減らすことによって解決できます。すべて allyls はエポキシ化、さらに高機能化ナノスポンジの表面にはペンダント allyls がないです。また、ソリューション ナノスポンジ合成でエポキシド濃度は 0.0054 M ナノスポンジ合成にとって重要です。
ナノスポンジ反応は、以前必要なナノスポンジ サイズ範囲<sup ...

これらナノシステム1の薬物放出プロファイルをガイドに影響を与える非常に重要なは分子間架橋結合に基づくナノ粒子のサイズと架橋密度を正確にチューニングします。すなわち、設計ナノスポンジ無依存異なるネットワーク密度の粒子を準備、前駆体ポリマーのペンダント機能および組み込まれる親水性の架橋剤の同等物に頼っています。このアプローチで前駆体および架橋剤、溶媒中の濃度はバルク ゲルではなく、個々 のサイズの形ナノ粒子に重要です。定量核磁気共鳴分光法 (NMR) 評価技術を利用して法人ペンダント機能と高分子の分子量の正確な測定可能します。ナノ粒子を形成、一度集中し、ナノゲルの性格を持つことがなく有機物の可溶化できます。
ナノ粒子ドラッグデリバリーの最近の研究はポリの使用に焦点を当てて (乳酸-co-グリコール酸) (PLGA) 自己組織化ナノ粒子2,3,4,5,6。PLGA 薬物送達アプリケーションに適している分解性エステルの連携があり、しばしばそのステルス特性7のため poly(ethylene glycol) (PEG) と組み合わせています。ただし、さらに高機能化有機物で、PLGA 粒子形成の自己組織化の性質のため粒子を溶解できません。PLGA ナノ粒子とは対照的は、提案されたメソッドは、定義されたサイズと形態、オーガニックで不安定であり水溶液1が低下するナノ粒子を形成共有結合で架橋を提供します。このアプローチの利点は、さらに化学的にナノスポンジ8の表面を高機能化する能力と有機溶剤の安定性は医薬品化合物1,9で粒子の後読み込みを使用できます。この方法では、水溶液に沈殿物によって疎水性小分子のカプセル化を実現できます。一緒に親水性の短い架橋ポリエステルのバックボーンの疎水性はこれらの粒子に体温でアモルファス文字を与えます。さらに、薬物の読み込み後、粒子は容易に注射で体内に水溶液中における微細懸濁液を形成できます。これらのポリエステルの nanosponges の合成用パラメーターを評価し、デザイン、サイズおよび形態の調節に非常に重要であるものを決定するこの作業における私たちの目標です。

<table><tbody><tr><td>2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>385506-100ML</td><td></td></tr><tr><td>3-メチル-1-ブタノール</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>309435-100ML</td><td>無水、&ge;99%</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>179124-4L</td><td></td></tr><tr><td>アリルブロマイド</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A29585-5G</td><td>&ge;99%</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A661-500</td><td>DI水中の飽和溶液</td></tr><tr><td>細胞培養水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500-500ML</td><td>0.45 &mu;mシリンジフィルター</td></tr><tr><td>ジクロロメタン(DCM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997-100ML</td><td>無水、&ge;99%、安定剤として40〜150ppmのアミレンを含有</td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>E145SK-4</td><td></td></tr><tr><td>EZFlow 0.2 &mu;m シリンジ フィルター</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>386-2116-OEM</td><td>親水性 PTFE、13 mm</td></tr><tr><td>EZFlow 0.45 &mu;m シリンジ フィルター</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>386-3126-OEM</td><td>親水性 PTFE 、25 mm</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 使い捨てホウケイ酸ガラス試験管、プレーン エンド付き</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-961-31</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-666-318</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>ハミルトン マイクロリットル シリンジ、100 &mu;L</td><td>ハミルトン カンパニー</td><td>80600</td><td>モデル 710 N SYR、セメント NDL、22s ga、2 インチ、ポイント スタイル 2</td></tr><tr><td>ヘキサメチルホスホラミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H11602-100G</td><td>&ge;99%、&le が含まれています。安定剤としての1,000ppmのプロピレンオキシド</td></tr>ヘ<tr><td>キサンフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>H292-4</td><td></td></tr>マグネシウム<tr><td>無水硫酸マグネシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>メタクロロプロオキシ安息香酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>273031-100G</td><td>に精製&ge;バッファー洗浄による99%</td></tr><tr><td>メタノール(MeOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322415-100ML</td><td>無水、&ge;99%</td></tr><tr><td>N-ブチルリチウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230707-100ML</td><td>2.5 M ヘキサン</td></tr><tr><td>N,N-ジイソプロピルエチルアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>550043-500ML</td><td>&ge;99%</td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>P7793-1EA</td><td></td></tr><tr><td>PELCO Pro リバース(自動閉鎖式)ピンセット</td><td>テッド・ペラ社</td><td>5375-NM</td><td></td></tr><tr><td>リンタングステン酸水和物</td><td>Alfa Aesar</td><td>40116</td><td></td></tr><tr><td>Q55 Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q55-110</td><td>55 W、20 kHz</td></tr><tr><td>SiliaMetS Cysteine</td><td>Silicycle</td><td>R80530B-10g</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 透析クリップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>68011</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin 透析チューブ、10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>5233-500</td><td>飽和溶液 DI</td></tr><tr><td>水 TEM グリッド</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>01822-F</td><td>極薄カーボン Type-A 400メッシュ 銅 約 グリッド穴サイズ:42 & マイクロ;m</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン (THF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757-1L</td><td>無水、&ge;99.9%、阻害剤を含まない</td></tr><tr><td>錫(II)トリフルオロメタンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>388122-1G</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Whatman濾紙、グレード1</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-805H</td><td>Circles、185 mm</td></tr><tr><td>&delta;-バレロラクトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>389579-100ML</td><td>真空蒸留により精製</td></tr></tbody></table>

サイズと架橋密度にナノスポンジ可変性

Nanosponge Tunability in Size and Crosslinking Density

ペンダント エポキシド機能と制御寸法ナノスポンジの混入を含む線形のポリエステルの合成のためのプロトコルについて述べる。このアプローチは、得られたポリマーのペンダント機能化へキーである機能性ラクトンの合成から始まります。バレロラクトン (VL) とアリル-バレロラクトン (AVL) は、開環重合に共が。ポストキュア変更、ペンダント アリル グループの一部またはすべてにエポキシ基をインストールする使用されます。希薄溶液中の高分子と低分子芳香族ジアミン架橋剤目的ナノスポンジ サイズと架橋密度に基づくフォーム ナノ粒子にエポキシ樹脂アミン化学を採用します。ナノスポンジ サイズは、寸法と分布を決定する透過電子顕微鏡 (TEM) イメージングによって特徴付けられます。このメソッドは、高度調整可能なポリエステルが可変性ナノ粒子、小分子薬のカプセル化のため使用することができますを作成することが経路を提供します。バックボーンの性質のため、これらの粒子は疎水性小分子の広い範囲の制御放出の加水分解や酵素によって分解。

ナノスポンジの合成パラメーターとその結果のサイズの関係を評価するには、各高分子前駆体の濃度とペンダントの機能は重要です。図 1で、12 h の DCM で両方前駆体高分子/ジアミン誘導体の架橋を組み込んだ後、その nanosponges の successfulsynthetic 方式が還流条件下で実施は。ソリューションのエポキシド濃度も離散的な粒子の形成に重要です。一度 nanosponges を合成した、TEM 画像は一連の粒子の正確な寸法を決定する使用されました。図 2、様々 なナノスポンジ実験のコレクションをポリマー前駆体分子量とペンダント機能定款ナノスポンジ サイズに及ぼす影響が両者の関係を決定するために基づいて行った。図 2分子量が増加するエポキシド (エポキシドあたり 2 アミン) あたり 1 つのジアミン誘導体架橋剤と EVL 定款の 6% と 8% 粒子径の増加傾向が見られます...

ペンダント機能を含む線形のポリエステルから共有架橋ナノ粒子のサイズと架橋密度を調整するためのプロセスについて説明します。合成パラメーター (ポリマーの分子量、ペンダント機能定款および架橋剤) を調整することによって薬物送達アプリケーションの必要なナノ粒子のサイズと架橋密度を実現できます。

We describe a protocol for the synthesis of linear polyesters containing pendant epoxide functionality and their incorporation into a nanosponge with ...

このナノスポンジ合成法の全体的な目的は、形態におけるサイズの設計と制御のために重要な合成パラメータを理解し、活用することです。この手法により、薬物輸送への応用のために、精密な寸法と架橋密度を持つナノ粒子を作製することが可能になります。本手法の主な利点は、これらの粒子の異なる架橋密度や異なるサイズに合わせて調整できることであり、これはこれらの粒子が使用される多くのアプリケーションにおいて非常に重要な要因となります。この手法は、調整したウールの合成パラメータを利用することでナノ粒子の設計に関する知見を得ることができますが、ハイドロゲルやマイクロ粒子などの他のポリマーネットワークにも適用可能です。テキストプロトコルの詳細に従い、マグネチックスターラーを装着した25 mL丸底フラスコから水分を除去します。冷却後、速やかに丸底フラスコからセプタムを取り外し、スパチュラを用いて2.5 mgのトリフルートスズをフラスコ底部の最深部に加えます。セプタムを交換します。次に、100 µLマイクロシリンジを用いて3-methyl-1-butanolを72.6 µL、2 mLシリンジを用いて無水DCMを1.33 mLの順に加えます。懸濁液をマグネティックスターラーで10分間攪拌します。次に、0.48 millilitersのAVLと1.37 millilitersのVLを順に加えます。18～20時間、攪拌を続けて反応させます。約5 millilitersのメタノールを加えて反応を停止させ、その後、100 milligramsの固相支持金スカベンジャーをフラスコに加え、2時間攪拌します。懸濁液を重力ろ過でろ過して固体を除去し、フラスコをジクロロメタン溶媒で洗浄し、これをフィルター上に注ぎます。ウォーターアスピレーターを真空源とし、溶液が粘性を持つまで30 °Cで加熱しながら、エバポレーターで溶媒を除去します。溶媒を500 mLの冷メタノール中に滴下して沈殿させ、白色固体のフレークを生成させます。その後、フィルターペーパーを敷いたガラスフィルター付き漏斗を用いて溶液を吸引ろ過し、固体を回収します。スパチュラを用いて固形生成物をあらかじめ重量を量ったバイアルに移し、05 Torrの高真空下で一晩乾燥させ、白色の薄片状固形物を回収します。磁気攪拌子を入れた6ストリームバイアルに、VLAVL共重合体を500 milligrams加えます。次に、6.15 millilitersの脱水DCMをバイアルに加え、ボルテックスミキサーでポリマーを溶解させます。次に、2つ目の6ストリームバイアルに74.53 milligramsのmCPBAを加えます。6.15 millilitersの脱水DCMを加え、mCPBAが完全に溶解するまでボルテックスで撹拌します。続いて、mCPBA溶液をVLAVL溶液に転移させます。反応容器に蓋をしてパラフィンフィルムで密閉し、48時間攪拌します。反応混合物を50 mLの分液漏斗に移し、飽和重曹水（炭酸水素ナトリウム飽和溶液）を15 mL加えます。分液漏斗の栓をして、ゆっくりと揺らして混合させます。生成物を含む有機層を回収し、適切なサイズのマグネチックスターラーバーを入れた15 milliliterのエルレンマイヤーフラスコに移します。分液漏斗に残っている水層に5 millilitersのDCMを加え、栓をしてゆっくりと振盪させます。有機層を回収し、生成物が入ったフラスコに移します。水層の廃棄物を捨てた後、有機層を分液漏斗に戻します。次に、残留水を完全に取り除くため、マグネ Tスチラーで撹拌しながら、生成物フラスコに硫酸マグネシウムを加えます。硫酸マグネシウムを少量ずつ加え、塊ができなくなるまで継続してください。ろ紙をセットしたガラス漏斗を用いて、固体の硫酸マグネシウムを除去しながら、混合物を 50 milliliter の丸底フラスコに移します。丸底フラスコの内容物を、あらかじめ重量を量っておいた製品バイアルに移します。ウォーターアスピレーターを真空源とし、25 degree celsiusで加熱しながら、エバポレーターを用いて溶媒を除去します。バイアルを05 Torrの高真空下に一晩置くことで、白色のワックス状固体を得ます。0.054 Mのエポキシド濃度にするため、200 mgのVLAVL EVLポリマーを20.01 mLの脱水DCMに溶解します。得られた溶液を、14/20ネックの100 mL丸底フラスコに移します。反応フラスコを50 °Cのオイルバスに設置します。溶液を高速ボルテックスで撹拌し、マイクロシリンジを用いてEDEAを21.45 µLずつ滴下します。1420ネックアダプターを装着し、冷却水が流れている水ジャケット付き凝縮器をフラスコのネックに固定し、溶液を12時間還流させます。次に、ロータリーエバポレーターを用いて25 °Cで反応フラスコから過剰な溶媒を除去し、粘性溶液が得られるまで濃縮します。生成物を、片端を折り畳んで透析クリップで閉じた10k分子量カットオフの透析チューブに移します。フラスコを過剰量のDCMで洗浄し、その液をチューブに移します。チューブの上端を折り畳み、吊り下げ用ワイヤー付きの透析クリップで閉じます。次に、大きな攪拌子を入れた2リットルのビーカーの縁に透析チューブを掛け、チューブが完全に浸るまでDCMをビーカーに満たします。マグネチックスターラーで透析溶液を穏やかに攪拌し、溶媒の蒸発を防ぐためビーカーをアルミホイルで覆います。未反応のポリマーと架橋剤を除去するため、溶媒を廃棄容器に注いで取り除き、新しいDCMに交換する操作を1日3回、48時間にわたって行います。透析後、ビーカーからすべての溶媒を取り除き、透析チューブの内容物を0.45 micron PTFEシリンジフィルターを装着した10 milliliterシリンジに移します。溶液をフィルターを通して、あらかじめ重量を量っておいた製品バイアルに直接注入し、残存する不純物を除去します。25 degree celsiusでエバポレーターを用いて溶媒を除去し、その後、製品バイアルを05 Torrの高真空下に一晩置いて、淡黄色のワックス状固体を回収します。1.5 milliliterの遠心チューブに0.5 milligramsのナノスポンジを入れます。フィルター滅菌した細胞培養用水を1 milliliter加えます。プローブ型超音波分散機を用いて、粒子が微細な懸濁液になるまで、室温で2秒間のバーストを4〜5回繰り返して溶液を超音波処理します。次に、1.5 mL遠心チューブに、ろ過した細胞培養水1 mLと30 mgのPTAを加えます。PTAが完全に溶解し、3% PTA溶液になるまで、最高設定で10秒間ボルテックスミキサーで撹拌します。22Gの針を装着した1 mLシリンジで3% PTA溶液を0.5 mL吸い取り、粒子に3% PTA溶液を4滴加えて、最高設定で10秒間ボルテックスミキサーで撹拌します。次に、セルフクロージングツイーザーを用いてTEMグリッドをピックアップし、粒子溶液に素早く3回浸します。グリッドへの埃の付着を抑えるため、カバーをかけて5時間乾燥させます。最後に、ハイコントラストおよび40 micronの対絞絞理を用いて、サンプルのTEMイメージングを行います。この図は、懸垂機能基を持つ線状ポリエステル共重合体をジアミン架橋剤と反応させ、独立したナノ粒子および溶液を形成させるナノスポンジ合成法を示しています。TEMイメージングを用いて各ナノスポンジセットの正確な寸法を特性評価しており、この画像には標準偏差12 nmの79 nmのナノスポンジが含まれています。これら2つの因子の関係を評価するため、ポリマー前駆体の分子量と懸垂機能基の量に基づいてナノスポンジのサイズを分析しました。ナノスポンジのサイズが増大する傾向は、ペンダント官能基の種類に関わらず、ポリマーの分子量の増加と相関しています。また、ナノスポンジのサイズを、導入したペンダント官能基の量および反応に添加したジアミン架橋剤の量に基づいて分析しました。ペンダント官能基と架橋剤の両方の等量量を増やすことで、ナノスポンジのサイズが増大することが示されました。このビデオを視聴することで、これらの合成パラメータを利用してナノ粒子のサイズと形態を自在に制御し、設計する方法について十分に理解できるはずです。ポリマーの分子量、エポキシ濃度、および架橋剤の量という重要なパラメータを用いることで、これらのナノスポンジの合成を調整できます。このナノ粒子合成法の開発後、本手法は当研究室における低分子疎水性化合物のドラッグデリバリー研究を推進する上で不可欠なものとなっています。本手順を実施する際は、化学量論と濃度が最終生成物に非常に重要であるため、測定の正確性に細心の注意を払うことが極めて重要です。本手順に続き、薬物配送プラットフォームの設計に関する課題を解決するために、他のポリマーネットワーク合成法を実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

生体適合性のpH応答性ゾル - ゲルナノセンサーは、ポリ（乳酸 - コ - グリコール酸）（PLGA）エレクトロスパン足場に組み込むことができる。産自己申告足場は、足場上に細胞を培養しながら微小環境条件の現場モニタリングのために使用することができる。 3D構築物が細胞の実験を妨害することなく、リアルタイムでモニターすることができるので、これは有益である。...

3次元細胞培養のための自己申告足場

nanohelical構造の正確なモデリングは、新規ナノテクノロジー応用につながる予測シミュレーション研究のために重要である。現在、ソフトウェアパッケージおよびコードは、原子論らせんモデルを作成する際に制限されています。私たちは2つのシミュレーションのための原子論nanohelicalモデルを作成するように設計手順、および可視化を通じて、研究を強化するためのグラフィカル·インターフェースを提示する。...

予測研究および拡張の3D可視化のためのスケーラブルなNanohelices

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ポリジメチルシロキサン(PDMS)の2つのマイクロチャネル間にナノ流体接合を作成するためのシリカコロイドナノ粒子の簡単な自己組織化技術を提案します。この技術を使用して、細孔径が~45...

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分解性感温ハイドロゲル ヒドラゾン架橋高分子オリゴマー バルク スケール、マイクロ スケール、およびナノスケール、ゲル粒子・...

自己組織化反応押出、マイクロフルイディクス, 経由で複数の長さスケールでの分解性感温ハイドロゲルを加工・ エレクトロスピニング

細胞挙動のナノトポグラフィー変調の研究のために、小さなナノパターン化された型から広い面積のナノパターン基板を生成するためのプロトコルが提示されます。...

細胞の挙動のNanotopographical変調のステッチ法を用いたナノパターン基板を拡大

セミフレキシブル高分子は、生きているシステムで広く適用されているユニークな力学特性を表示します。ただし、ポリマーの剛性などのプロパティにはアクセスできませんので、生体高分子に関する体系的な研究は制限されます。本稿では、プログラム可能な DNA...

セミフレキシブル高分子を研究する多目的ツールとして DNA ナノチューブ

発表は、陽極酸化アルミニウム フィルターを用いて作製したナノファイバーを集約することによって機能性表面のナノ ・ マイクロ...

マルチ スケール構造機能表面の刻印ナノファイバーによる集計

ナノゲルは、生物製剤の送達のための優れた汎用性の高いナノ粒子プラットフォームです。タンパク質ベースのペイロードをカプセル化できる刺激応答性ポリ(エチレン)グリコールベースの高分子ナノゲルを、水性条件下でのワンステップ架橋コナノ重合戦略を使用して合成しました。これらの新規ナノ粒子の最適な作製と特性評価について、以下で紹介します。...

水性ワンステップ架橋法とコナノ重合法による刺激応答性ナノゲルの合成

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3D細胞培養のための微多孔性アニール粒子足場における粒子分率の制御(英語)

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活性アクチンベースアセンブリの収縮性および変形モードのin vitroでのチューニング:2次元活性ネットワークから液晶滴まで

学ぶナノスポンジ合成法で、ポリマー分子量と架橋剤量を調整し、ナノ粒子のサイズと架橋密度を精密に制御する技術。薬物送達システムの設計に応用可能です。

サイズと架橋密度にナノスポンジ可変性

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