シュワンの移植細胞のギャップを渡って軸索の再生を促進するために切断のラット脊髄切り株をブリッジする PVDF ・ セッション導管内

この資料では、完全断裂後脊髄切り株とシュワン細胞 (SCs) と橋し、のギャップの間で軸索の再生を促進するために注射の基底膜マトリックス塗りつぶしの中空管を挿入する方法について説明します。

この外科的介入手順の全体的な目標は、シュワン細胞と注射可能なマトリックスで満たされた導管を使用して、完全に横断された脊髄断端間のブリッジを確立し、ブリッジを横切る軸索再生を促進することです。私たちの目標は、ラットの脊髄損傷部位を橋渡しして機能を回復させることです。私たちが使用している怪我は、完全な切断ギャップの作成です。

この種の損傷を使用することによってのみ、損傷部位に軸索が見つかったときに軸索が再生したと確信を持って言うことができます。私たちが使用しているブリッジは、シュワン細胞を含むポリマーチャネルであり、シュワン細胞は軸索の再生に非常に重要です。このビデオでは、このような橋を完全な交差ギャップに導入する方法を示します。

この方法に不慣れな研究者は、脊髄の完全な切断と導管の導入が初心者にとって難しい場合があるため、練習が必要になります。手順を開始する前に、10番のブレードを使用してコンジットを5mmに切断します。これは、必要に応じて解剖顕微鏡下でも行うことができます。

コンジットを縦方向に沿ってそっと折り、まっすぐな刃のバンナスハサミを使用して、開口部から少なくとも1ミリメートル、約1ミリメートル間隔で約0.4ミリメートルの長さの4つの小さな切開を切ります。次に、コンジットを広げ、同じ側に沿って2つの切開部の間に切り込みを入れて、2つの窓を並べて作成し、切り取っていない側に沿って窓を適切に開閉できることを確認します。T7-T9椎弓切除術を行うには、麻酔をかけた180〜200グラムの雌のフィッシャーラットでつま先のピンチに対する反応の欠如を確認した後、T9-T11棘突起のランドマークを特定します。

彼らは皮膚を貫通する小さな三角形の隆起のように感じるでしょう。10番の刃を使用して、T4からT11まで4〜5センチメートルの正中線の皮膚を切開し、続いて湾曲した鈍い先端のはさみで表層脂肪層を小さく切開します。脂肪を解剖した後、10番のブレードを使用してT7-T9の棘突起を特定し、鈍い鉗子を使用して筋肉を約T4に保持します。T6からT10までの椎骨の両側に沿って筋肉をできるだけ椎骨に近づけて切開し、きれいな開口部を作り、動物への損傷を最小限に抑えます。

リトラクターをT7からT9のあたりに配置します。10番のブレードを使用して、T6からT10までの個々のプロセス間の筋肉と靭帯を切断し、ロンジャーを使用してT7からT9までの椎弓板の筋肉と靭帯をできるだけ横方向に取り除きます。T7からT9への横突起間のギャップが見えたら、ロンゲールを使用してT9棘突起を取り除き、鈍い鉗子でT8棘突起を静かに持ち上げて、T9とT10突起の間の小さな開口部でT9椎弓板を持ち上げます。次に、ロンゲールを使用して、開口部からT9で吻側に移動して、ラミナをできるだけ横方向に除去します。すべての椎弓板が除去されたら、特にT8で横突起間の隙間が見えることを確認し、T7とT9の間の両側の骨を調べて、外側に突き出た骨片がなく、後根が見えるようにします。

角度のついたスプリングハサミを使用して、T8の上下の背根と腹根を切断し、脊髄に生理食塩水を追加して出血を止めます。次に、T8の横突起の間の隙間に、角度のついたスプリングハサミを脊髄の上に置き、神経組織を完全に切断するために1つのカットを行います。得られた2〜2.5ミリメートルの隙間に圧縮フォームの小片を置き、すぐにその領域に生理食塩水を追加します。

切断された臍帯の切り株が止血に達するのを待っている間に、吸収三角形を細く長い断片に切り取り、PBSストレージから導管を取り出します。コンジットにいくつかの三角形を配置して余分なPBSを取り除き、事前にカットされたウィンドウが開いていることを確認します。次に、GFPシュワン細胞ペレットから培地を取り出し、シュワン細胞を10マイクロリットルの冷たいDMEM/F-12に再懸濁します。

10マイクロリットルの冷注入用ゲルを細胞懸濁液に加え、ピペッティングを繰り返してよく混合します。次に、細胞懸濁液を氷の上に置きます。臍帯の切り株の準備ができたら、圧縮されたフォームを取り除き、次に吸収三角形の長い部分を使用して、椎弓切除領域から生理食塩水と血液を取り除きます。

次に、マイクロヘラを使用して吻側の切り株をそっと持ち上げ、窓を上に向けて切り株の上に導管を滑り込ませ、切り株全体が挿入され、導管に過剰な出血がないように注意します。尾側の切り株をそっと持ち上げ、導管のもう一方の端をその上に滑り込ませ、切り株全体が挿入され、窓が背側表面にあることを確認します。次に、ウェスタンブロットローディングチップを装備したマイクロピペットを使用して、20マイクロリットルのGFP Schwann Cell注入可能なマトリックス混合物をプレカットウィンドウの1つからコンジットに注入し、ウィンドウを閉じます。

注意点です。コード切り株をできるだけ早く、そしてできるだけ慎重に取り扱うことが非常に重要です。遅れると、切り株が腫れ、導管を脊髄に滑り込ませるのが難しくなり、さらに損傷を引き起こす可能性があります。

移植から3週間後、クライオスタット矢状脊椎組織切片の共焦点蛍光画像は、導管に沿って、また導管内にシュワン細胞が均一に分布しているだけでなく、ブリッジの中心内に血管と有髄軸索が分布していることを明らかにしています。軸索の再生は、シュワン細胞の存在とも密接に関連しており、構造化された導管内でシュワン細胞ブリッジを使用して、吻側と尾側断端の間の橋に沿って軸索の再生を促進することの有効性が確認されています。この手順をマスターすると、適切に実行されれば、この手順は45分で完了できます。

この手順に続いて、EndoRayトレースなどの他の方法を実行して、追加の質問に答えることができます。たとえば、いくつの軸索がブリッジに再生され、そのうちいくつがブリッジを出て脊髄に再入るのでしょうか?このビデオを見れば、脊髄を横断する方法、導管を挿入する方法、マトリックス内に細胞を注入する方法をよく理解して、軸索再生やその他の結果評価のための信頼性の高いブリッジを作成する方法を理解しているはずです。